水飛薊賓對(duì)宮頸癌裸鼠移植瘤抑瘤作用機(jī)制研究

賈號(hào)

摘 要 目的：探討水飛薊賓對(duì)宮頸癌裸鼠移植瘤的抑瘤作用和作用機(jī)制。方法：建立宮頸瘤裸鼠移植瘤模型，分析藥物對(duì)裸鼠的抑瘤作用；用間接免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)及Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)COX-2、VEGF、Bax和Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果：水飛薊賓可劑量依賴(lài)性地抑制宮頸癌裸鼠移植瘤腫瘤組織的生長(zhǎng)。間接免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)及Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明水飛薊賓能抑制COX-2、VEGF、Bcl-2的表達(dá)、促進(jìn)Bax的表達(dá)。結(jié)論：水飛薊賓通過(guò)抑制血管生長(zhǎng)因子和前列腺素的合成，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)；對(duì)宮頸癌細(xì)胞的殺傷作用是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；降低Bcl-2蛋白的表達(dá)、增加Bax蛋白的表達(dá)為其誘發(fā)宮頸癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞 水飛薊賓 宮頸癌裸鼠 抑瘤作用

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5； R737.33 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2020）05-0072-04

Study on the mechanism of silibinin on tumor inhibition of cervical carcinoma transplanted in nude mice

JIA Hao*

（Department of Medicine， the First Peoples Hospital of Shangqiu， Henan Shangqiu 476100， China）

ABSTRACT Objective： To investigate the antitumor effect and mechanism of silibinin on transplanted tumor of cervical cancer in nude mice. Methods： The xenograft model of cervical tumor in nude mice was established and the antitumor effect of drugs on nude mice was analyzed. The expression levels of COX-2， VEGF， Bax and Bcl-2 were detected by indirect immunofluorescence flow cytometry and Western blotting. Results： It was verified by the determination of indirect immunofluorescence flow cytometry and Western blotting that silibinin could inhibit the growth of tumor tissue in cervical cancer nude mice in a dose-dependent manner and the expression of COX-2， VEGF and Bcl-2 cells and promote the expression of Bax cells. Conclusion： Silibinin can inhibit the growth of tumor cells by inhibiting the synthesis of angiogenic factors and prostaglandins and its killing effect on cervical cancer cells is due to induction of cell apoptosis. One of the mechanisms that induce the apoptosis of cervical cancer cells is due to the decrease of Bcl-2 protein expression and the increase of Bax protein expression.

KEY WORDS silibinin； naked mice of cervical cancer； tumor inhibitory effect

水飛薊賓（silibinin， SB），是從水飛薊素中提取出來(lái)的活性成分，目前作為肝保護(hù)劑在臨床中廣泛使用，無(wú)論是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還是臨床應(yīng)用，均顯示良好的保肝作用和極低的不良反應(yīng)。目前有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，SB具有很好的抗腫瘤作用，對(duì)各種上皮細(xì)胞來(lái)源的腫瘤均有良好的作用，如前列腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等[1]。SB已進(jìn)入前列腺癌的Ⅰ期臨床試驗(yàn)[1]。不少學(xué)者報(bào)道了SB抗癌的作用機(jī)制，特別是對(duì)于宮頸癌和肝癌[2-5]，但是對(duì)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究還很少，本文就SB對(duì)宮頸癌裸鼠移植瘤的抑瘤作用和作用機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

FACScan流式細(xì)胞分析儀（美國(guó)Becton Dickinson公司）；F039200酶聯(lián)免疫分析儀（奧地利Tecan公司）；Genius 6K-C臺(tái)式低速離心機(jī)（長(zhǎng)沙市鑫奧儀器儀表有限公司）。

1.1.2 細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

人宮頸癌HeLa細(xì)胞購(gòu)于American Type Culture Collection（ATCC， Manassas， VA， USA）。使用10% 胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。裸鼠購(gòu)自商丘美蘭生物工程有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為：SYXK（豫）2017-0006。

1.1.3 試劑

SB（批號(hào)0856 9902）、紫杉醇（批號(hào)1534 200202）均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所）；RPMI-1640培養(yǎng)液（美國(guó)Hyclone公司）；抗體均由北京中杉生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與處理

裸鼠，雌性，6～8周齡，質(zhì)量15～18 g，于商丘美蘭生物工程有限公司SPF級(jí)動(dòng)物房普通飼料喂養(yǎng)。40只裸鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、紫杉醇組、低劑量SB組、中劑量SB組、高劑量SB組共5組。然后將0.2 ml細(xì)胞懸液皮下接種到裸鼠。待腫瘤長(zhǎng)到5 mm以上后，①空白對(duì)照組：用飲用滅菌自來(lái)水灌胃1 ml，每日1次，連續(xù)30 d；②紫杉醇組：用10 mg/kg紫杉醇灌胃1 ml，每日1次，連續(xù)30 d。

分別用滅菌自來(lái)水配制的0.2、1和5 mg/ml三種質(zhì)量濃度SB混懸液供低、中、高三劑量組裸鼠灌胃，每日1次，連續(xù)30 d。

1.2.2 觀察指標(biāo)

一般情況觀察：每周1次測(cè)量并記錄小鼠及腫瘤組織的基本情況；每天觀察裸鼠的精神狀態(tài)及背部瘤組織的生長(zhǎng)情況等。

腫瘤組織測(cè)量：從給藥第15天起，每 3 d測(cè)量腫瘤大小，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)，V （mm3）= 0.5×L×S2（最大長(zhǎng)徑為L(zhǎng)和橫徑為S）。停藥次日處死裸鼠，計(jì)算抑瘤率（%）=（1-治療組平均腫瘤質(zhì)量/模型組平均腫瘤質(zhì)量）×100%。

1.2.3 間接免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)COX-2和VEGF的表達(dá)

切取各組組織塊制備細(xì)胞懸液，于1 200 r/min離心5 min，將細(xì)胞重懸浮于染色液中于室溫30 min。分別加入鼠抗人COX-2、VEGF單抗各20 ml，37 ℃孵育60 min。設(shè)立陰性對(duì)照組。PBS洗滌后加FITC標(biāo)記的二抗，混勻，避光室溫孵育30 min，過(guò)濾后檢測(cè)。

1.2.4 裸鼠移植瘤組織中COX-2、VEGF、Bcl-2和Bax的表達(dá)水平檢測(cè)

取凍存組織裂解。BCA測(cè)定蛋白濃度，酶聯(lián)免疫分析儀測(cè)定波長(zhǎng)為A562，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出蛋白濃度。制備10%分離膠、5%濃縮膠的SDS-PAGE凝膠。吸取40 mg總蛋白，進(jìn)行電泳分離，將蛋白從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉。β-actin作為內(nèi)參，1∶800稀釋作為一抗4 ℃孵育過(guò)夜。1∶4 000稀釋二抗孵育1 h，然后用顯影液、定影液顯色，掃描圖片保存。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)用SPSS 25.0處理（t檢驗(yàn)），數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤接種陽(yáng)性率

由病理組織學(xué)驗(yàn)證，40只裸鼠注射HeLa細(xì)胞株后均長(zhǎng)出腫瘤。6～10 d肉眼觀察到長(zhǎng)出腫瘤，22～26 d腫瘤生長(zhǎng)到直徑≥5 mm。

2.2 藥物對(duì)裸鼠的不良反應(yīng)

各用藥組和對(duì)照組相比，裸鼠在飲食量、飲水量、排便、以及活動(dòng)力上均沒(méi)有顯著的差異。

2.3 對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響

對(duì)照組腫瘤體積增長(zhǎng)最快；與對(duì)照組相比，各用藥組腫瘤體積的增長(zhǎng)有明顯的抑制作用；SB 0.2、1和5 mg/ml連續(xù)給藥30 d的荷瘤裸鼠，其抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用隨著劑量的增加逐漸增大（圖1）。

2.4 對(duì)腫瘤抑制率的影響

各用藥組與對(duì)照組相比都有不同程度的抑瘤作用，SB的抑瘤作用與紫杉醇相當(dāng)，且呈劑量依賴(lài)性，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，表1）。

2.5 對(duì)宮頸癌裸鼠移植瘤組織內(nèi)COX-2、VEGF的表達(dá)影響

紫杉醇組、中劑量SB組和高劑量SB組與對(duì)照組相比，COX-2和VEGF蛋白表達(dá)的熒光測(cè)定強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，圖2），表明SB可抑制移植瘤中HeLa細(xì)胞COX-2和VEGF的表達(dá)。

2.6 對(duì)宮頸癌裸鼠移植瘤COX-2、VEGF、Bcl-2和Bax的表達(dá)水平的影響

以β-actin為對(duì)照，Western blotting檢測(cè)各組宮頸癌裸鼠移植瘤組織切片COX-2、VEGF、Bcl-2和Bax的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，紫杉醇組、中劑量SB組和高劑量SB組與對(duì)照組相比，COX-2、VEGF、Bcl-2的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05，圖3），且其抑制作用與藥物血清濃度呈正相關(guān)；而B(niǎo)ax的表達(dá)顯著升高（P<0.05，圖3），且其抑制作用與藥物血清濃度呈負(fù)相關(guān)。

3 討論

裸鼠是一種小鼠突變株，異種移植后的人體腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)仍保持其原有的組織形態(tài)、免疫學(xué)特點(diǎn)等性質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)在學(xué)校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，并嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室規(guī)范操作，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)裸鼠死亡。

腫瘤細(xì)胞依靠分泌血管生長(zhǎng)因子（VEGF、bFGF等）保證其自身生長(zhǎng)[6]。COX-2是前列腺素合成過(guò)程的限速酶，其過(guò)表達(dá)與腫瘤新生血管形成密切相關(guān)[7]。中國(guó)傳統(tǒng)藥物的抗腫瘤作用機(jī)制主要有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[8]、激活免疫系統(tǒng)間接抑制腫瘤等。凋亡主要有線(xiàn)粒體通路，Bcl-2蛋白家族引起線(xiàn)粒體膜通透性增加，引起一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是Bcl-2蛋白家族成員，Bcl-2/Bax的比例可決定細(xì)胞的命運(yùn)，其比例增高，細(xì)胞不易發(fā)生凋亡，而比例降低則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9]。

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，SB可劑量依賴(lài)性地抑制裸鼠移植瘤腫瘤組織的生長(zhǎng)，可下調(diào)VEGF、COX-2的表達(dá)，表明SB通過(guò)抑制血管生長(zhǎng)因子和前列腺素的合成，從而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)SB可上調(diào)Bax的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，Bcl-2/Bax的比例降低，從而激活線(xiàn)粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

我們將會(huì)對(duì)SB抗宮頸癌的活性和作用機(jī)制做進(jìn)一步的研究。SB在體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均有較好的抗宮頸癌作用，拓展了目前臨床治療惡性腫瘤的思路，不僅對(duì)宮頸癌的臨床治療具有指導(dǎo)意義，還可能作為一種防治惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展、抑制其生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床。

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