尼羅羅非魚的Galectin-8基因的原核表達(dá)及條件優(yōu)化

牛繼敏 牛金中 黃瑜 劉鑫潮 簡紀(jì)常 魯義善

摘 要：Galectin-8屬于S型凝集素，是一種內(nèi)源性凝集素，具有高親力，含β-半乳糖苷，可識別重要的病原分子[1]。該蛋白質(zhì)有2個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，均提供該家族中其他蛋白質(zhì)類似的保守序列[2]。該研究基于尼羅羅非魚Galectin-8 NCBI上發(fā)表的基因序列，利用primer5.0設(shè)計(jì)1對引物，構(gòu)建尼羅羅非魚Galectin-8基因的原核表達(dá)載體，將重組后的質(zhì)粒pGEX-4T-1-Galectin-8導(dǎo)入大腸桿菌中，通過PCR、連接、轉(zhuǎn)化等，進(jìn)行原核表達(dá)。對影響因素進(jìn)行條件優(yōu)化，使用優(yōu)化后的濃度、時(shí)間、溫度條件表達(dá)Galectin-8重組蛋白能得到最優(yōu)表達(dá)量。Western blot檢測純化后的重組蛋白，結(jié)果顯示，重組蛋白可以很好地結(jié)合GST-Tag標(biāo)簽的單克隆抗體，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明羅非魚Galectin-8的重組蛋白被成功表達(dá)，為羅非魚Galectin-8后續(xù)相關(guān)功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：尼羅羅非魚;Galectin-8;原核表達(dá);Western blotting;條件優(yōu)化

中圖分類號 S917.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2020）05-0006-04

Prokaryotic Expression and Condition Optimization of Galectin-8 Gene in Nile Tilapia

Niu Jimin1 et al.

（Fisheries College， Guangdong Ocean University， Zhanjiang 524088， China）

Abstract： Galectin-8 belongs to S-type lectin， an endogenous lectin with high affinity and β-galactoside， which are important in the recognition of pathogenic molecules[1]. The protein has two functional domains that provide similar conserved sequences to other proteins in the family[2]. Primer5.0 software was used to design a pair of primers based on the Nile tilapia Galectin-8 gene sequence published on NCBI to construct the prokaryotic expression vector of the tilapia Galectin-8 gene. The recombinant plasmid ie pGEX-4T-1 -Galectin-8 was constructed and introduced into E. coli for prokaryotic expression by PCR， ligation， and transformation. Optimal conditions of factors affecting the expression of Galectin-8 recombinant protein in terms of concentration， time， and temperature were provided. The purified recombinant protein was able to specifically bind to the GST-Tag monoclonal antibody detected by Western blot which proved the successful expression of Galectin-8 recombinant protein of tilapia. This result provides the fundamentals to the study of subsequent related functions of tilapia Galectin-8.

Key words： Oreochromis niloticus; Galectin-8; Prokaryotic expression; Western blotting; Condition optimization

凝集素（lectins）是脂質(zhì)復(fù)合物上的一種非共價(jià)結(jié)合蛋白或糖蛋白，可選擇識別糖結(jié)構(gòu)[3-4]。半乳糖凝集素（galectin）是凝集素中的1個(gè)家族，參與免疫應(yīng)答過程，在其他方面也發(fā)揮著重要作用，可以分為3個(gè)亞型：原型[5-6]、嵌合體型和串聯(lián)重復(fù)型[7-11]。

Galectin-8是1個(gè)891bp的開放閱讀框（ORF），編碼296個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)（33kD）。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明該蛋白質(zhì)與來自其他動(dòng)物物種的半乳糖凝集素8類似，并與鮭魚半乳糖凝集素8具有至少56.8%的同源性。在結(jié)構(gòu)上，氨基酸序列包括分別為135和133個(gè)氨基酸的不同的2個(gè)N-和C-末端碳水化合物識別結(jié)構(gòu)域（CRD），通過39個(gè)氨基酸的多肽接頭連接[7，8，12]，N-和C-CRD含有2個(gè)保守的WG-EI和WG-ET基序，表明它們在介導(dǎo)Galectin-8和糖部分如β-半乳糖苷之間的特異性相互作用中具有重要作用[13-15]。

尼羅羅非魚屬熱帶性魚類，生長快、繁殖力強(qiáng)、病害少、抗病性強(qiáng)等特點(diǎn)，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織推廣養(yǎng)殖的魚類物種之一[16]。廣東沿海一帶羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)量居全國首位。隨著養(yǎng)殖密度的增加，養(yǎng)殖環(huán)境變得惡化，一些疾病相應(yīng)增多[17]，細(xì)菌性疾病，無乳鏈球菌就是其中之一，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[18-21]。目前羅非魚免疫系統(tǒng)的研究處于初級階段，本研究基于Galectin-8基因在NCBI上的全長序列設(shè)計(jì)引物，克隆Galectin-8的ORF區(qū)，構(gòu)建原核表達(dá)載體并優(yōu)化表達(dá)條件，為羅非魚Galectins的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)用羅非魚由湛江附近漁場購買，克隆的載體pMD18-T、T4連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶 BamHI和 XHOI、ExTaq DNA聚合酶購自TaKaRa公司，原核表達(dá)的載體pGEX-4T（+）Vector和大腸桿菌的表達(dá)菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

總RNA提取試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;引物合成、氨芐西林（Amp+）、IPTG購自上海生工公司;考馬斯亮藍(lán)染液、一抗、二抗購自碧云天生物有限公司;提取質(zhì)粒和凝膠回收試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 羅非魚Galectin-8基因的擴(kuò)增 羅非魚頭腎組織中的總RNA提取按試劑盒說明書進(jìn)行操作，成功提取RNA后用瓊脂糖凝膠檢測其質(zhì)量，按說明書逆轉(zhuǎn)錄合成第1條鏈，根據(jù)NCBI上公布的尼羅羅非魚Galectin-8的基因序列（LOC100696357），以cDNA為模板，設(shè)計(jì)1對引物的在其5′端加上BamHI和XhoI位點(diǎn)，PF：5-CGCGGATCC ATGTCCGTGGCTAAC-3（BamHI）PR：5-GGCGAGCTCTCACCACAGCTTGATGTC-3（XhoI），以羅非魚頭腎組織cDNA單鏈為PCR擴(kuò)增模板，反應(yīng)體系參照牛金中等[23]，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。目的條帶用瓊脂糖凝膠電泳檢測，拍照觀察條帶大小。目的條帶正確后進(jìn)行純化回收，將其產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，涂板挑單克隆菌落篩選，結(jié)合PCR鑒定是否正確。選擇pMD18-T上的通用引物M13/RV鑒定。將陽性克隆送至上海生工測序。序列測序正確的pMD-18-Galectin-8重組質(zhì)粒和原核表達(dá)載體pGEX-4T，提取其質(zhì)粒，用之前設(shè)計(jì)的BamHI和XhoI2種快切酶進(jìn)行酶切，產(chǎn)物切膠回收，16℃、T4 DNA連接酶過夜連接，次日轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化后，用LB平板（含氨芐（Amp+）抗性）挑選單菌落結(jié)合菌落PCR鑒定，陽性克隆送生物公司測序。

命名測序正確的重組質(zhì)粒為pGEX-4T-1-Galectin-8。在新鮮的含Amp+LB培養(yǎng)基中接種陽性菌株以及空載質(zhì)粒pGEX-4T的菌株其比例為1∶100左右，37℃振搖培養(yǎng)，至對數(shù)生長期，OD600達(dá)到0.4～0.6，IPTG濃度加0.2mmol/L的，誘導(dǎo)2h，對菌液收集，對目的蛋白使用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.2.2 重組蛋白Galectin-8條件優(yōu)化 （1）在不同濃度的IPTG誘導(dǎo)條件下，將濃度梯度設(shè)為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和2.0mmol/L，37℃振蕩培養(yǎng)3h后，目的蛋白的表達(dá)量用聚丙烯酰胺凝膠檢測。（2）不同時(shí)間的IPTG誘導(dǎo)條件，IPTG濃度為0.6mmol/L，分別誘導(dǎo)1、2、3、4、5、6、7和8h之后收集樣品，SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達(dá)量;（3）利用上述優(yōu)化的表達(dá)時(shí)間，誘導(dǎo)溫度，IPTG誘導(dǎo)濃度，對目的蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，然后對表達(dá)菌株收集離心，用PBS洗滌重懸超聲破碎。使用超聲波細(xì)胞粉碎儀對目的蛋白破碎：功率160w，破碎6s，間隔8s，破碎時(shí)間為8min，菌液變清撤后4℃離心。成功得到全菌蛋白后，按GST的說明書純化GST標(biāo)簽的目的蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.2.3 Western-blot鑒定分析 在最佳誘導(dǎo)條件下，收集純化重組蛋白。SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)到PVDF膜上Western blot分析。具體步驟：室溫封閉液封閉PVDF膜1h;加入鼠抗GST-Tag單克隆抗體（1∶2500稀釋）的一抗，孵育2h;用TBST洗脫膜，在搖床洗脫3次，每次15min;加入HRP山羊抗鼠IgG（1∶4000稀釋）的二抗，室溫震蕩1h;用TBST洗脫膜，在搖床洗脫3次，每次15min;充分清洗后，滴加配制新鮮的DAB顯色溶液，待有清晰的條帶出現(xiàn)后，用蒸餾水立即終止反應(yīng)，觀察目的蛋白條帶的大小，結(jié)果拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 Galectin-8基因的擴(kuò)增及鑒定 顯示PCR擴(kuò)增后在891bp處有明顯的條帶。pMD-18T載體與目的片段相連，PCR擴(kuò)增用載體上的引物M13和RV，其產(chǎn)物片段約為1046bp，與預(yù)期一致。因此，所選菌落為陽性克隆，說明獲得的目的條帶為Galectin-8基因。

2.2 構(gòu)建Galectin-8原核表達(dá)載體 重組Galectin-8的質(zhì)粒BamHI和XhoI酶切，在891bp處有1條大小接近的條帶，與pGEX-4T載體在4969bp處有1條大小一致的條帶，且插入的片段測序比對后同樣顯示是Galectin-8，表明pGEX-4T-Galectin-8被成功構(gòu)建成原核表達(dá)載體。

2.3 大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá) 只有誘導(dǎo)的菌株在59kD的位置有條帶，未誘導(dǎo)的對照組則無此條帶。GST標(biāo)簽的PGEX-4T-1空載體大小是26kD，而Galectin-8預(yù)測的蛋白分子量為33kD，重組后的蛋白大小為59kD，該分子量與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，從而證明重組Galectin-8蛋白表達(dá)成功。

2.4 大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

2.4.1 IPTG最佳誘導(dǎo)濃度和時(shí)間 結(jié)果顯示，在IPTG濃度為0.2mmol/L時(shí)，目的蛋白表達(dá)量最有效，因此，得出最佳IPTG誘導(dǎo)濃度為0.2mmol/L。當(dāng)溫度和濃度條件一致時(shí)，蛋白表達(dá)量在1～2h時(shí)目的在明顯增加，2h后并無明顯變化，說明2h是最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

2.4.2 最佳誘導(dǎo)溫度 在其他條件不變的情況下，25℃和37℃誘導(dǎo)，收集菌液對蛋白破碎，用SDS-PAGE凝膠電泳檢測。結(jié)果證明，在37℃和25℃條件下，目的蛋白都存在。

2.4.3 目的蛋白的純化和鑒定 在IPTG濃度為0.2mmol/L，4h，37℃條件下，收集菌液純化目的蛋白，SDS-PAGE檢測分析。結(jié)果顯示：純化后的目的蛋白條帶單一。Western blot顯示，重組蛋白純化后能特異性結(jié)合GST-Tag單克隆抗體，說明羅非魚Galectin-8帶重組蛋白表達(dá)成功。

3 討論

本研究以大腸桿菌為表達(dá)系統(tǒng)對羅非魚Galectin-8進(jìn)行原核表達(dá)，這是蛋白表達(dá)最常使用的表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌在實(shí)驗(yàn)過程中也會(huì)影響到蛋白的表達(dá)量，所以在優(yōu)化培養(yǎng)中PH可以適當(dāng)提高避免抑制蛋白表達(dá)。氧氣要充足，搖菌時(shí)注意容器中菌液量不能太多，對數(shù)生長期時(shí)能提高重組蛋白的表達(dá)量，IPTG的濃度、時(shí)間、溫度對其表達(dá)量影響也很大。本試驗(yàn)主要對IPTG的濃度、時(shí)間、溫度進(jìn)行條件優(yōu)化[23-24]。在37℃，2h且IPTG濃度為0.2mmol/時(shí)目的蛋白表達(dá)量處于最佳，濃度過高有時(shí)會(huì)抑制目的蛋白的表達(dá)[25]。當(dāng)溫度在25℃時(shí)，目的蛋白比37℃時(shí)的表達(dá)量明顯減少，因此本研究得出溫度對蛋白表達(dá)及其重要。用優(yōu)化后的條件表達(dá)Galectin-8重組蛋白，純化目的蛋白使用GST鎳柱，Western blot檢測其分子量，證明無論是重組蛋白的全菌蛋白還是純化后的重組蛋白，均與GST標(biāo)簽的單克隆抗體有效結(jié)合，且目的條帶單一，進(jìn)一步說明表達(dá)的重組蛋白是Galectin-8。

本試驗(yàn)在最佳誘導(dǎo)條件下成功構(gòu)建尼羅羅非魚Galectin-8的原核表達(dá)，且Galectin-8重組蛋白的表達(dá)量最大。純化后的Galectin-8重組蛋白，為后續(xù)制備羅非魚Galectin-8的抗體及其它方面的功能研究奠定最重要的一步。

參考文獻(xiàn)

[1]余艷玲，馮鵬霏，潘傳燕，等.尼羅羅非魚TGF-β1蛋白原核表達(dá)及多克隆抗體的制備[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2019，35（06）：1407-1412.

[2]盧曉，陳政良.半乳糖凝集素[J].免疫學(xué)雜志，2004，20：21-23.

[3]梁亞芳，史雨紅，苗亮，等.大彈涂魚（Boleophthalmus pectinirostris）Galectin-8基因序列及其細(xì)菌凝集活性的鑒定[J].海洋與湖沼，2018（2）：413-421.

[4]Zhang D L， Lv C H， Yu D H， et al. Characterization and functional analysis of a tandem-repeat galectin-9 in large yellow croaker Larimichthys crocea[J]. Fish & Shellfish Immunology， 2016， 52：167-178.

[5]張巖，佟盛春，王永來，等. galectin-3在子宮內(nèi)膜病變中表達(dá)的研究[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，37（5）：701-703.

[6]Unajak S， Pholmanee N， Kondo H， et al. Molecular characterization of Galectin-8 from Nile tilapia （Oreochromis niloticus Linn.） and its response to bacterial infection[J]. Molecular Immunology， 2015，68（2）：585-596.

[7]陳燦燦.Galectin-4表達(dá)失調(diào)與肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展及相關(guān)分子機(jī)制初步研究[D].福州：福建醫(yī)科大學(xué)，2017.

[8]王曉輝，張浩，楊智洪，等.半乳糖凝集素-1的融合克隆及純化[J].生物技術(shù)通訊，2008（1）.

[9]鄭利兵，吳彪，劉志鴻，等.魁蚶（Scapharca broughtonii）半乳糖凝集素（SbGal）基因cDNA的克隆及表達(dá)分析[J].海洋與湖沼，2015（5）：1061-1070.

[10]Vasta G R， Ahmed H， Du S J， et al. Galectins in teleost fish： Zebrafish（Danio rerio）as a model species to address their biological roles in development and innate immunity[J]. Glycoconjugate Journal， 2004， 21（8-9）：503-521.

[11]江紅節(jié).半乳糖凝集素的結(jié)構(gòu)和功能[J].生命的化學(xué)（中國生物化學(xué)會(huì)通訊），1995（6）：21-24.

[12]Hadari Y R， Arbelgoren R， Levy Y， et al. Galectin-8 binding to integrins inhibits cell adhesion and induces apoptosis.[J]. Journal of Cell Science， 2000， 113（13）：2385-2397.

[13]吳銳. 血漿半乳糖凝集素-3水平與多囊卵巢綜合征中慢性炎癥和胰島素抵抗的相關(guān)性研究[D].重慶：重慶醫(yī)科大學(xué)，2018.

[14]Troncoso M F， Ferragut F， Bacigalupo M L， et al. Galectin-8： A matricellular lectin with key roles in angiogenesis[J]. Glycobiology， 2014，24（10）：907-914.

[15]陳秀麗.石斑魚半乳糖凝集素基因的克隆、表達(dá)及功能分析[J].2016.

[16]王斌.中國羅非魚出口貿(mào)易國際競爭力研究[D].無錫：江南大學(xué)，2011.

[17]黃紀(jì)兵，肖鶴.羅非魚常見疾病及防治[J].科學(xué)養(yǎng)魚，2017（10）：90-90.

[18]付天增.無乳鏈球菌和海豚鏈球菌滅活疫苗對羅非魚的免疫效果[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

[19]潘傳燕，馮鵬霏，張永德，等.尼羅羅非魚PPARδ的原核表達(dá)及其多抗制備和純化[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2019，34（09）：1053-1058.

[20]朱潔蓮，高婷婷，鐘孝俊，等.羅非魚源無乳鏈球菌滅活疫苗免疫效果的研究[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2017，47（05）：636-643.

[21]李桂歡.羅非魚源無乳鏈球菌嵌合型亞單位疫苗與DNA疫苗的研制及免疫效果評價(jià)[D].廣州：廣東海洋大學(xué)，2014.

[22]牛金中，黃瑜，湯菊芬，等.尼羅羅非魚補(bǔ)體3基因片段的原核表達(dá)及條件優(yōu)化[J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，38（2）：80-84.

[23]黃瑜，牛金中，湯菊芬，等.尼羅羅非魚NCCRP-1基因的原核表達(dá)及條件優(yōu)化[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2018，37（09）：3753-3758.

[24]Patnaik P R. Investigation of induction effect on the steady state performance of a continuous fermentation for recombinant β-ga1actosidase[J]. Process Biochemistry， 2001， 36（11）：1069-1074.

（責(zé)編：張 麗）