hBD-3 和TNF-α 及CINC-1 對鼻咽癌放療后口咽部感染的診斷價值及與口腔評估表評分和口腔黏膜反應的相關性分析

周曉麗 谷 峰 鄭雪莉

（河南科技大學臨床醫(yī)學院，河南科技大學第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科，河南 洛陽 471003）

鼻咽癌為臨床常見的頭頸部惡性腫瘤，發(fā)病率高居耳鼻咽喉惡性腫瘤之首。鼻咽癌對放療具有較高敏感性，因此放療是目前治療鼻咽癌的最常用手段之一[1-2]。但在放療過程中口腔黏膜受到超過閾值劑量的放射線輻射后，對口腔黏膜造成損傷，易繼發(fā)口咽部感染等局部并發(fā)癥，嚴重者甚至被迫中斷放療計劃[3]。因此積極防治鼻咽癌放療后口咽部感染具有重要臨床意義?？谘什扛腥究梢鹁植垦装Y反應，人β 防御素-3（human betadefensin-3，hBD-3）與人口腔黏膜上皮細胞炎癥反應密切相關，具有促進炎癥的作用[4-5]。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）在評估、診斷感染性疾病方面具有較高敏感度[6-7]。中性粒細胞趨化因子-1（cytokine induced neutrophil chemoattractant-1，CINC-1）在炎癥反應過程中發(fā)揮炎癥細胞趨化作用，其水平升高可刺激炎癥加重[8]。本研究中探討了口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 對鼻咽癌放療后口咽部感染的診斷價值及其與口腔評估表（oral assessment guide，OAG）評分、口腔黏膜反應的相關性，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2017 年1 月—2020 年6 月鼻咽癌放療患者118 例，其中男74 例，女44例；年齡41 ～65 歲，平均（51.78±4.91）歲。放療期間參照國內(nèi)相關診斷標準[9]判斷是否發(fā)生口咽部感染，根據(jù)是否發(fā)生口咽部感染分為感染組（n=27 例）與未感染組（n=91 例）。患者均符合本研究的病例納入與排除標準。

1.2 病例納入與排除標準

1.2.1 納入標準 ①符合鼻咽癌診斷標準[10]；②均需行放療；③無放療禁忌證；④卡氏功能狀態(tài) 評 分（Karnofsky performance status，KPS）[11]≥70 分；⑤放療前血常規(guī)、常規(guī)實驗室檢查后未發(fā)現(xiàn)異常；⑥患者及家屬知曉本研究，簽署知情同意書。

1.2.2 排除標準：①合并其他原發(fā)惡性腫瘤者；②放療前3 周內(nèi)有感染性疾病史者；③嚴重肝腎功能障礙、心腦血管疾病者；④慢性口腔潰瘍、牙齦發(fā)炎等口腔疾病患者；⑤精神系統(tǒng)疾病或心理疾病患者；⑥代謝性疾病、內(nèi)分泌疾病患者；⑦腫瘤已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移者；⑧合并其他可能影響本研究指標水平疾病者。

1.3 治療方法 所有患者均接受放療，采用Discovery CT590 RT 型CT 掃 描 儀（ 美 國 通用公司）進行CT 模擬定位，勾畫大體腫瘤靶區(qū)（gross tumor volume，GTV）、 臨 床 靶 區(qū)（clinical target volume，CTV）及計劃靶區(qū)（planning target volume，PTV），采用直線加速器6 MV 光子線進行放療，鼻咽GTV 處方劑量60.00 ～70.00 Gy，分次劑量2.00 ～2.33 Gy；PTV 處 方 劑 量54.00 ～57.00 Gy， 分 次 劑 量1.80 ～1.90 Gy；CTV 處方劑量57.00 ～63.00 Gy，分次劑量1.90 ～2.10 Gy，連續(xù)治療6 周。治療期間所有患者均給予止痛、營養(yǎng)支持、鼻咽部常規(guī)護理，發(fā)生口咽部感染后暫停放療，待感染痊愈后繼續(xù)放療。

1.4 觀察指標 ①兩組臨床資料，包括性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、鼻咽癌病程、腫瘤直徑、臨床分期[12]、分化程度[13]、牙石指數(shù)（calculus index，CI）[14]、放療周期、KPS 評分、OAG 評分[15]。②兩組口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 水平。③分析口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 與OAG 評分、鼻咽癌放療后口咽部感染的關系，及診斷鼻咽癌放療后口咽部感染的價值。④比較感染組不同口腔黏膜反應分級患者口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1水平，口腔黏膜反應分級采用美國放射治療腫瘤協(xié)作組對放射黏膜損傷所作的分級標準進行評定，分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ共4 個等級，級別越高損傷越嚴重[16]。⑤分析口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 與口腔黏膜反應分級的關系。

1.5 hBD-3、TNF-α、CINC-1 的檢測方法 采集所有患者放療結(jié)束后口腔黏膜組織，感染組取炎癥部位口腔黏膜組織，未感染組取放療照射范圍內(nèi)口腔黏膜組織，置于含雙抗和兩性霉素B（1 000 mg/L 鏈霉素，1 000 U/L 青霉素，25 mg/L兩性霉素B）的DMEM 培養(yǎng)液中，放入冰盒4℃保存，2 h 內(nèi)進行檢測，采用酶消化法培養(yǎng)人口腔黏膜上皮細胞，選用第2 代細胞置入0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化液消化后進行接種培養(yǎng)，提取細胞上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 水平，試劑盒購自上海梵態(tài)生物科技有限公司，檢測操作嚴格按照試劑盒說明書完成。

1.6 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)處理采用SPSS22.0 軟件，計數(shù)資料以例數(shù)描述，采用χ2檢驗；等級資料行Ridit 檢驗；計量資料采取Bartlett 方差齊性檢驗與Kolmogorov-Smirnov 正態(tài)性檢驗，均確認具備方差齊性且服從正態(tài)分布，以表示，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗，相關性分析采用Spearman 相關系數(shù)模型，通過Logistic 進行多因素回歸分析，診斷效能分析采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，獲取曲線下面積（area under the curve，AUC）、置信區(qū)間、敏感度、特異度及截斷值（cut-off 值），不同診斷方案間曲線下面積比較采用DeLong 檢驗，聯(lián)合診斷實施Logistic 二元回歸擬合，返回診斷概率logit(P)，將其作為獨立檢驗變量，均采用雙側(cè)檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料 兩組性別、年齡、BMI、鼻咽癌病程、腫瘤直徑、臨床分期、分化程度、CI差異均無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）；兩組放療周期、KPS 評分、OAG 評分差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 兩組口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 的比較 感染組口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 水平較未感染組高（P ＜0.05），見表2。

圖1 口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 與OAG 評分的相關性

表2 兩組口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 比較()

表2 兩組口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 比較()

組別例數(shù)（例）TNF-α（ng/L）hBD-3（μg/L）CINC-1（pg/mg）感染組 27 8.03±2.64 61.14±19.75 72.11±22.46未感染組 91 3.68±1.21 40.05±13.27 38.59±12.81 t 值 12.084 6.429 9.865 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 口 腔 黏 膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 與OAG 評分相關性 Spearman 相關性分析顯示，口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 與OAG 評分間存在正相關關系（r=0.504、0.385、0.433，P均＜0.05），見圖1。

2.4 口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 與鼻咽癌放療后口咽部感染的關系 以鼻咽癌放療后是否發(fā)生口咽部感染作為因變量（未發(fā)生=0，發(fā)生=1），以放療周期、KPS 評分、OAG 評分、口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 作為自變量（放療周期：1 ～2 個周期=1，≥3 個周期=2；KPS評分，OAG 評分，口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 均以所有鼻咽癌放療患者平均值為界：≤平均值=1，＞平均值=2），代入Logistic 回歸方程，結(jié)果顯示，口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1與鼻咽癌放療后口咽部感染顯著相關（P ＜0.05），見表3。

表3 口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 與鼻咽癌放療后口咽部感染的關系

2.5 口 腔 黏 膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 診斷價值 根據(jù)兩組口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 水平繪制各指標診斷鼻咽癌放療后口咽部感染的ROC 曲線，結(jié)果顯示，各指標診斷的AUC均＞0.7，具有良好診斷效能，聯(lián)合診斷的AUC高達0.917，高于任一指標單獨診斷，聯(lián)合診斷的最佳敏感度、特異度分別為77.78%、89.01%。見表4、圖2。

2.6 感染組不同口腔黏膜反應分級患者口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 的比較 感染組口腔黏膜反應分級Ⅰ級6 例，Ⅱ級11 例，Ⅲ級7例，Ⅳ級3 例，因例數(shù)較少，故將Ⅰ級與Ⅱ級合并、Ⅲ級與Ⅳ級合并統(tǒng)計。感染組Ⅰ級+ Ⅱ級患者口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 水平較Ⅲ級+Ⅳ級患者低（P ＜0.05），見表5。

表4 口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 的診斷價值分析

圖2 口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 診斷的ROC

表5 感染組不同口腔黏膜反應分級患者口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 比較()

表5 感染組不同口腔黏膜反應分級患者口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 比較()

CINC-1（pg/mg）Ⅰ級+Ⅱ級 17 6.72±1.82 52.45±11.19 57.86±16.48Ⅲ級+Ⅳ級 10 10.26±3.05 75.91±20.25 96.34±26.94 t 值 3.798 3.901 4.629 P 值 ＜0.001 0.001 ＜0.001組別 例數(shù)（例）hBD-3（μg/L）TNF-α（ng/L）

2.7 口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 與口腔黏膜反應分級關聯(lián)性 Spearman 相關性分析結(jié)果顯示，口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 與口腔黏膜反應分級間存在正相關關系（rhBD-3=0.698，rTNF-α=0.741，rCINC-1=0.723；P ＜0.001）。

3 討 論

口腔黏膜上皮是口腔天然免疫的第一道屏障，也能誘導分泌細胞因子、趨化因子、抗菌肽保護上皮組織[17]。放療損傷口腔黏膜屏障，導致口咽部感染、黏膜充血水腫，患者出現(xiàn)口腔潰瘍、吞咽困難、口干和口咽部劇烈疼痛等癥狀，影響患者生活質(zhì)量及治療的順利進行[18]。

我們觀察了鼻咽癌患者放療后口腔黏膜組織hBD-3、TNF-α 和CINC-1 的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌患者放療后發(fā)生口咽部感染的患者口腔黏膜hBD-3 水平明顯高于未發(fā)生口咽部感染者，提示口腔黏膜hBD-3 表達情況可能與口咽部感染的發(fā)生有關。hBD-3 是一種主要由上皮細胞產(chǎn)生的陽離子短鏈多肽，在所有上皮細胞中均有表達，但以口腔上皮細胞為主。Follacchio 等[19]發(fā)現(xiàn)，hBD-3 在金黃色葡萄球菌誘導感染模型大鼠體內(nèi)表達升高。研究顯示，hBD-3 主要由細菌、真菌及白細胞介素（IL）-1、TNF-α 等炎性因子誘導表達，在局部炎性口腔上皮細胞中，hBD-3 表達明顯升高[20]。Wang 等[21]研究證實，hBD-3可通過誘導IL-8 表達發(fā)揮促進炎癥反應的作用。本研究中多因素分析證實，口腔黏膜hBD-3 水平升高可增加鼻咽癌放療后口咽部感染發(fā)生風險，證實口腔黏膜hBD-3 表達參與口咽部感染的發(fā)生。分析其原因，口腔黏膜hBD-3 水平升高，可加重局部組織炎癥反應，對口腔黏膜細胞的損傷增加，降低了口腔黏膜的免疫力，間接參與口咽部感染，從而促進口咽部感染的發(fā)生。

TNF-α 是一種促炎因子。TNF-α 表達增加可引起并加重局部炎癥反應，使口腔內(nèi)皮細胞損傷加重，同時能使白細胞數(shù)量減少，降低機體免疫力，增加感染發(fā)生風險。本研究中發(fā)現(xiàn)其在鼻咽癌放療后發(fā)生口咽部感染患者的口腔黏膜中表達明顯升高，是感染發(fā)生的影響因素之一。

相關研究證實，CINC-1 等炎性反應因子表達量增加可促使機體發(fā)生炎癥反應[22]。CINC-1 能促進粒細胞與血管內(nèi)皮細胞黏附并趨化粒細胞到組織中，可加重黏膜組織損傷、促進局部炎癥浸潤，參與鼻咽癌放療后口咽部感染的發(fā)生發(fā)展。夏俊等[23]研究發(fā)現(xiàn)，采取有效措施下調(diào)鼻咽癌放療后鼻- 鼻竇及咽部患者口腔黏膜CINC-1 水平，可能抑制炎性遞質(zhì)的表達，抑制黏膜炎性損傷。本研究中還發(fā)現(xiàn)，口腔黏膜CINC-1 水平升高也可增加鼻咽癌放療后口咽部感染發(fā)生風險。

OAG 評分是評估口腔狀況的常用指標，其分值越高表示患者口腔狀況越差[24]，本研究中相關性分析發(fā)現(xiàn)，口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 與患者OAG 評分呈正相關，口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 水平越高，鼻咽癌放療患者口腔狀況越差，口咽部感染發(fā)生風險越高。在此基礎上，我們嘗試采用ROC 曲線評價口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 診斷鼻咽癌放療后口咽部感染的價值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各指標診斷的AUC 均在0.7 以上，可滿足臨床基本診斷需求，尤其是各指標聯(lián)合診斷的AUC 高達0.917，可為鼻咽癌放療后口咽部感染的早期診斷提供更準確參考數(shù)據(jù)。

口腔黏膜反應分級是反映口腔黏膜損傷的標準[25]。本研究中發(fā)現(xiàn)，口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 水平與口腔黏膜反應分級呈正相關，提示口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1水平可在一定程度上反映口腔黏膜損傷情況，以此指導治療，或許能減輕口咽部感染對患者生活質(zhì)量、治療依從性的影響，改善患者預后。

綜上可知，口腔黏膜hBD-3、TNF-α、CINC-1 水平與鼻咽癌患者OAG 評分、口腔黏膜反應間存在正相關關系，且在鼻咽癌放療后口咽部感染診斷方面具有良好應用價值。本研究仍存在樣本量較少等不足，有待通過大樣本研究進一步驗證。