CD4+ T淋巴細(xì)胞在IgA腎病中致病作用機(jī)制研究

唐余燕 賀海東 孫蔚倩 張棟梁 胡屏 徐旭東

201199 上海，復(fù)旦大學(xué)附屬閔行醫(yī)院(上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院)腎臟科

IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)是世界范圍內(nèi)最常見的原發(fā)性腎小球疾病，是導(dǎo)致尿毒癥的常見病因之一。IgAN以IgA(或包含IgG)免疫復(fù)合物沉積于腎小球系膜區(qū)及毛細(xì)血管袢為病理特征[1-2]，近年的研究表明低糖基化的多聚IgA1被稱為“致腎病IgA”，是IgAN的關(guān)鍵致病因子[3]，但機(jī)制迄今為止尚不清楚。研究表明，IgAN患者機(jī)體內(nèi)低糖基化IgA1是由B細(xì)胞產(chǎn)生，而這一分泌IgA1的過程是由CD4+T細(xì)胞調(diào)節(jié)完成，因此CD4+T細(xì)胞失調(diào)可能導(dǎo)致B細(xì)胞產(chǎn)生過量的異常IgA1，沉積在腎小球，促發(fā)免疫系統(tǒng)紊亂，最終導(dǎo)致IgAN的發(fā)展[4]。CD4+T細(xì)胞在調(diào)節(jié)IgA1生成及IgAN的發(fā)展中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)IgAN患者治療前及治療后1月外周血清的CD4+T淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子，包括γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、白介素(interleukin，IL)-4、IL-17、IL-21、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)，并檢測(cè)IgAN患者治療前JAK/STAT信號(hào)通路各信號(hào)分子的表達(dá)水平。分析CD4+T淋巴細(xì)胞在IgAN中致病作用機(jī)制，為IgAN的治療提供新的思路。

材料與方法

一、研究對(duì)象與實(shí)驗(yàn)材料

1.研究對(duì)象 選取2017年8月至2018年8月于復(fù)旦大學(xué)附屬閔行醫(yī)院腎臟科住院治療且經(jīng)首次腎活檢證實(shí)為IgAN患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥18歲；(2)eGFR均≥60 mL·min-1·(1.73 m2)-1。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往接受過糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑或腎移植治療；(2)合并感染、腫瘤、妊娠等情況的患者。本研究共納入45例IgAN患者作為IgAN組，另外納入我院體檢中心49例體檢健康者作為健康對(duì)照組。以上受試者均簽署知情同意書，并得到閔行區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批件號(hào)：2018-批件-010-01K)。

2.實(shí)驗(yàn)材料 兔單克隆抗體JAK/STAT信號(hào)通路均購于Abcam公司；人淋巴細(xì)胞分離液購于sigma公司；PE標(biāo)記的人IFN-γ及IL-4單克隆抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的人CD8α及CD4單克隆抗體，PEcy5標(biāo)記的抗人CD3單克隆抗體及抗人FOXP3染色試劑盒均購于eBioscience公司；佛波酯、莫能霉素和離子霉素均購于Sigma公司；細(xì)胞固定劑和破膜劑均購于Invitrogen公司；IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-21及TGF-β1測(cè)試劑盒均購于R&D公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及Real time PCR試劑盒均購于北京天根公司。

二、方法

1.治療 IgAN組患者均單用甲潑尼龍激素治療，劑量為0.8 mg·kg-1·d-1。激素治療的指征：經(jīng)3～6個(gè)月有效的支持治療(包括血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑或血管緊張素受體阻滯劑、控制血壓)，患者蛋白尿>1 g/d且eGFR>50 mL·min-1·(1.73 m2)-1。

2.標(biāo)本留取 IgAN組于腎活檢前留取外周血10 mL，健康對(duì)照組于體檢時(shí)留取外周血10 mL，分離血清、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞備用。IgAN組治療1月后隨訪時(shí)再次留取外周血5 mL，分離血清備用。

3.淋巴細(xì)胞的制備 吸取5 mL血液與等量1640培養(yǎng)液混勻后，將混合液沿管壁漸漸加入到含有5 mL淋巴細(xì)胞分離液的離心管中(混合液∶淋巴細(xì)胞分離液=1∶2)，2 000 rpm離心30 min。吸取白細(xì)胞層，移入另一支離心管中，加入1640培養(yǎng)液6 mL，輕輕混勻，分別進(jìn)行2次洗滌，棄上清液，加入2 mL 1640全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

4.CD4+T淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)健康對(duì)照組和治療前后IgAN組患者的CD4+T淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子水平。分離制備外周血清，分別吸取標(biāo)準(zhǔn)品及血清各50 μL依次加入孔中，后每孔分別加入50 μL酶聯(lián)親和物，37℃溫育60 min，棄孔內(nèi)液體，采用稀釋的洗滌液沖洗5遍，加入顯色液，室溫下避光反應(yīng)15 min，后每孔加入終止液50 μL，使用酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)定吸光度值。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出IFN-γ、IL-4、L-17、IL-21及TGF-β1的水平。

5.CD4+T淋巴細(xì)胞比例檢測(cè) 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)健康對(duì)照組和治療前IgAN組患者的CD4+T淋巴細(xì)胞比例。將分離得到的淋巴細(xì)胞以RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整至1×106/mL，取25 μg/mL佛波酯、1 μg/mL離子霉素和1.7 μg/mL莫能霉素加入培養(yǎng)液中，37℃、50 mL/L CO2孵育6 h；PBS洗滌2次后收集細(xì)胞，分四管(A、B、C、D)，A、B管分別加入CD3-PEcy5、FITC-CD8α抗體，C管加入CD4-FITC、PE-CD25抗體，D管加入同型對(duì)照抗體，避光孵育15 min；PBS洗滌2次，100 μL固定劑作用15 min，PBS洗滌后加入100 μL破膜劑作用5 min，A、B管直接加PE-IFN-γ及IL-4抗體，C管加入抗人APC-FOXP3抗體，D管加入同型對(duì)照抗體，室溫避光孵育30 min；PBS洗滌2次后500 μL PBS重懸，流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)分析。

6.RT-qPCR檢測(cè)JAK/STAT信號(hào)通路信號(hào)分子mRNA表達(dá) 將制備得到的健康對(duì)照組和治療前IgAN組患者單核細(xì)胞轉(zhuǎn)移至2 mL無RNA酶EP管內(nèi)，做好標(biāo)記，離心1 500 g×5 min，棄去上清，用于提取RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA參照RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。Real-Time PCR擴(kuò)增檢測(cè)JAK/STAT信號(hào)通路各信號(hào)分子的表達(dá)水平，引物序列如表1所示。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃ 120 s；94℃ 20 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；每次在延伸階段讀取吸光值。各組細(xì)胞表達(dá)的信號(hào)分子水平以2-ΔΔCt值表示。

表1 RT-qPCR引物序列

7.Western blotting檢測(cè)JAK/STAT信號(hào)通路信號(hào)分子蛋白表達(dá) 隨機(jī)選擇5個(gè)IgAN患者及3個(gè)健康者，將其分離得到單核細(xì)胞裂解，制備培養(yǎng)細(xì)胞蛋白樣品，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素NC膜上，取出漂洗過的印跡膜，放入5%脫脂牛奶中封閉1 h，向封閉后的印跡膜加入TBST稀釋后的一抗JAK、JAK3、STAT3、STAT5、STAT6(1∶1000)，4℃孵育過夜。第2天TBST洗膜5 min×3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(Jackson1∶2000)室溫孵育2 h。TBST洗膜10 min×3次。加入化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑(試劑A∶試劑B=1∶1)反應(yīng)2 min，取出膜，甩去多余的液體，用保鮮膜包好PVDF膜，暗室中用X膠片感光、顯影、定影。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、兩組一般資料比較

IgAN組45例患者中，有男性22例，女性23例，平均年齡(35.1±6.1)歲，平均eGFR(91.2±12.6)mL·min-1·(1.73 m2)-1。健康對(duì)照組49例受試者中，有男性24例，女性25例，平均年齡(34.5±7.1)歲，平均eGFR(112.0±10.6)mL·min-1·(1.73 m2)-1。兩組一般資料比較無顯著差異(P>0.05)，具有可比性。

二、兩組血清中CD4+ T淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子水平比較

與健康對(duì)照組相比，治療前IgAN組血清IL-4、IL-17、TGF-β1、IL-21水平顯著高于健康對(duì)照組(P<0.05)；而IFN-γ水平與健康對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。激素治療1月后，IgAN組平均24 h蛋白尿較治療前顯著降低[(1.49±0.15)g/24 hvs.(2.31±1.10)g/24 h，P<0.01]，平均Scr與治療前比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(106.0±45.6)μmol/Lvs.(110.2±59.9)μmol/L，P>0.05]。IgAN組血清IL-4、IL-17、TGF-β1、IL-21水平均顯著低于治療前(P<0.01)(圖1)。提示IgAN患者存在CD4+T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)失調(diào)。

三、兩組CD4+ T淋巴細(xì)胞分布比例比較

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組外周血中Th1(CD3+CD8-IFN-γ+)、Th2(CD3+CD8-IL-4+)、Treg(CD4+CD25+FOXP3+)的分布比例，發(fā)現(xiàn)IgAN患者外周血Th1占T細(xì)胞的百分比為(14.04±4.11)%，略少于健康對(duì)照組的(16.25±6.16)%，但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Th2的占比為(2.57±0.72)%，顯著高于健康對(duì)照組的(1.81±1.10)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。IgAN組Th1/Th2比值顯著低于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。IgAN組Treg的占比為(2.14±0.82)%，顯著高于健康對(duì)照組的(1.59±0.53)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示IgA腎病患者體內(nèi)存在CD4+T細(xì)胞失衡。(圖2)

四、兩組JAK/STAT信號(hào)通路信號(hào)分子mRNA表達(dá)比較

為分析IgAN患者CD4+T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)失調(diào)機(jī)制，本研究采用RT-qPCR檢測(cè)JAK/STAT信號(hào)通路發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，IgAN組JAK1、JAK3、STAT3和STAT6 mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，而STAT5 mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)。兩組JAK2、TYK2、STAT1和STAT4 mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。提示CD4+T細(xì)胞亞群失調(diào)可能參與IgAN患者的發(fā)病機(jī)制，與JAK/STAT信號(hào)通路表達(dá)失衡有關(guān)。

五、兩組JAK/STAT信號(hào)通路信號(hào)分子蛋白表達(dá)比較

為了進(jìn)一步驗(yàn)證IgAN患者JAK/STAT信號(hào)通路表達(dá)失衡，本研究隨機(jī)選擇5個(gè)IgAN患者及3個(gè)健康者，通過Western blot檢測(cè)前述mRNA表達(dá)有差異信號(hào)分子的蛋白水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，IgAN組JAK1、JAK3、STAT3和STAT6蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)，而STAT5蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)(圖4)，與RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果一致。

討 論

IgAN是最常見的原發(fā)性腎小球疾病，是終末期腎病的重要病因之一。病理特征為腎小球系膜區(qū)以低糖基化IgA1聚合體為主的免疫復(fù)合物沉積，臨床表現(xiàn)以血尿和(或)蛋白尿?yàn)橹?。研究表明IgAN是免疫復(fù)合物沉積引起的自身免疫性疾病。近年來研究發(fā)現(xiàn)IgA1鉸鏈區(qū)異常糖基化在IgAN發(fā)生中具有重要的作用，這一結(jié)論已獲得廣泛認(rèn)可[5]。因此，深入了解異常糖基化IgA1生成作用機(jī)制有助于尋找新的治療手段。

CD4+T細(xì)胞在控制和消除一系列外來入侵的病原體中起著關(guān)鍵性作用，但當(dāng)CD4+T細(xì)胞錯(cuò)誤應(yīng)答自身抗原時(shí)，不僅導(dǎo)致機(jī)體慢性感染狀態(tài)，而且誘發(fā)過敏和自身免疫性疾病，如慢性乙型肝炎病毒感染、過敏性鼻炎、IgAN等[6]。根據(jù)特定的細(xì)胞因子，為適應(yīng)機(jī)體的免疫狀態(tài)，CD4+T細(xì)胞分化為功能各樣的亞群，并各自具有這些特定細(xì)胞因子的免疫功能[7]。Th1細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α、TNF-β，有助于細(xì)胞免疫反應(yīng)介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)病原體的清除；Th2細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-10，參與體液免疫介導(dǎo)的細(xì)胞外病原體的清除[8]；Treg主要通過細(xì)胞接觸機(jī)制及分泌抗炎因子IL-10、TNF-β等發(fā)揮維持免疫穩(wěn)態(tài)和免疫耐受的作用[9-11]。隨著研究的進(jìn)展，CD4+T細(xì)胞亞群類型在不斷更新中。JAK/STAT信號(hào)通路參與機(jī)體多種調(diào)節(jié)反應(yīng)，JAK激酶被激活后，可進(jìn)一步活化其下游信號(hào)蛋白分子STAT，導(dǎo)致STAT同源或異源二聚體化，隨后二聚體蛋白移位核內(nèi)，與相應(yīng)的靶基因啟動(dòng)子結(jié)合，控制目的蛋白的表達(dá)，對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)控起著重要作用。JAK/STAT信號(hào)通路在CD4+T淋巴細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用[12]。

分化失衡的T細(xì)胞不僅導(dǎo)致機(jī)體慢性感染，且誘導(dǎo)各種自身免疫性疾病，如腎小球腎炎[13]。研究表明，IgAN患者機(jī)體內(nèi)低糖基化IgA1是由B細(xì)胞產(chǎn)生，而這一分泌IgA1的過程是由CD4+T細(xì)胞調(diào)節(jié)完成。在IgAN患者機(jī)體內(nèi)表現(xiàn)為Th1型免疫反應(yīng)減弱，Th2型增強(qiáng)，這可能與IgA在腎臟沉積有關(guān)[14]。在IgA腎病的ddY小鼠模型中，在疾病的早期階段表現(xiàn)出較強(qiáng)的Th1優(yōu)勢(shì)[15]。新診斷為IgAN患兒的尿沉渣中有較高的T-bet表達(dá)，并且與T-bet蛋白在腎活檢組織染色陽性正相關(guān)[16]。同時(shí)，Th2型細(xì)胞因子IL-4在IgA鉸鏈區(qū)糖基化和腎纖維化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。另外Th1/Th2比例與IgA腎病患者蛋白尿和腎組織病理改變相關(guān)[17]。由于血液樣本特定的細(xì)胞因子和CD4+T細(xì)胞相對(duì)穩(wěn)定且易于檢測(cè)，因此它們有可能被用作治療和監(jiān)測(cè)疾病的生物標(biāo)記物。然而，迄今為止，CD4+T細(xì)胞亞群在IgAN發(fā)病機(jī)制中的作用及其作為新治療靶點(diǎn)的潛在應(yīng)用的研究文獻(xiàn)較少。本研究發(fā)現(xiàn)IgAN患者Th2、Treg在T細(xì)胞中的占比顯著高于健康對(duì)照組(P<0.05)，提示IgAN患者存在CD4+T細(xì)胞亞群紊亂。而CD4+T細(xì)胞亞群免疫紊亂可能參與IgAN發(fā)病機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)IgAN患者及激素治療后1個(gè)月外周血清的CD4+T淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-21、TGF-β1)的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)IgAN組血清IL-4、IL-17、TGF-β1、IL-21水平高于健康對(duì)照組(P<0.05)；而IFN-γ水平與健康對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IgAN激素治療1個(gè)月后，隨訪患者24 h尿蛋白定量較治療前顯著減少，外周血清IL-4、IL-17、TGF-β1、IL-21水平均顯著低于治療前(P<0.05)。以往的研究表明，IgAN嚴(yán)重腎功能不全患者的Th2細(xì)胞因子IL-4為高表達(dá)。同時(shí)，Th2細(xì)胞因子參與扁桃體和胃腸道黏膜處IgA異常糖鏈形成[18-19]。此外，Th2型細(xì)胞因子IL-4在控制IgAl鉸鏈區(qū)糖基化和腎纖維化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。另一項(xiàng)研究表明，與健康對(duì)照組相比，IgAN患者Thl7表達(dá)比例增加，細(xì)胞因子IL-17A和IL-21表達(dá)也升高，并且血清IL-17A表達(dá)與24 h尿蛋白相關(guān)，并且63例IgAN患者中有34例腎小管有IL-17A表達(dá)，與29例無IL-17A表達(dá)相比，這些患者腎功能下降，蛋白尿和腎小管間質(zhì)損害更嚴(yán)重[20]。與本文研究結(jié)果相一致。

陳明喆等[21]研究發(fā)現(xiàn)橙皮苷對(duì)IgA腎病大鼠腎功能具有改善作用，其機(jī)理可能與提高抗氧化能力，降低STAT3蛋白的表達(dá)有關(guān)。為分析IgAN患者CD4+T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)失調(diào)機(jī)制，本研究采用RT-qPCRT及Western blot檢測(cè)JAK/STAT通路發(fā)現(xiàn)，治療前IgAN組JAK1、JAK3、STAT3和STAT6表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)，而STAT5表達(dá)水平顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05)。兩組JAK2、TYK2、STAT1和STAT4表達(dá)水平比較無顯著性差異，提示CD4+T細(xì)胞亞群失調(diào)可能參與IgAN患者的發(fā)病機(jī)制，與JAK/STAT信號(hào)通路表達(dá)失衡有關(guān)。

綜上所述，CD4+T細(xì)胞亞群失調(diào)可能參與IgAN患者的發(fā)病，其機(jī)制與JAK/STAT信號(hào)通路表達(dá)失衡有關(guān)，因此，CD4+T細(xì)胞因子(IL-4、IL-17、TGF-β1、IL-21)可能成為治療IgAN的新靶點(diǎn)和監(jiān)測(cè)IgAN病情的無創(chuàng)生物標(biāo)志物。但由于研究經(jīng)費(fèi)的原因，本實(shí)驗(yàn)收集標(biāo)本量較少，觀察時(shí)間尚短，希望能有更多類似試驗(yàn)進(jìn)行較大規(guī)模的研究，為提高IgAN的預(yù)后開拓新方向。