血清抗體ELISA檢測陰性的抗腎小球基底膜病1例

郝雨 秦偉

610041 成都，四川大學華西醫(yī)院腎內(nèi)科

病 例 資 料

患者，男，38歲，因“痰中帶血1個月”于2018年7月12日入院。入院前1個月，患者無明顯誘因出現(xiàn)暗紅色血痰，量少，咳 2～3口，不伴有發(fā)熱、胸悶、氣緊，于2018年6月7日到廣元市人民醫(yī)院門診就診，查胸部CT示雙肺多發(fā)滲出灶，未予以處理。此后患者未再出現(xiàn)痰中帶血，無明顯不適癥狀，為診治肺部病變遂來我院?；颊哂新砸倚透窝撞∈?，否認高血壓、糖尿病、呼吸系統(tǒng)疾病、泌尿系統(tǒng)疾病病史，否認吸煙、特殊藥物、毒物接觸史。入院查體：T：36.3℃，P：116次/分，R：20次/分，BP：115/90 mmHg。神志清楚，全身淺表淋巴結(jié)未觸及，心肺腹體檢未見異常，雙下肢無水腫。診治經(jīng)過：2018年7月12日查胸部CT：雙肺彌漫分布磨玻璃密度片影，肺門及縱隔淋巴結(jié)無腫大(圖1)。行電子纖支鏡檢查：各級支氣管管腔未見異常，肺泡灌洗液病理送檢未見異常。查血常規(guī)：血紅蛋白104 g/L。生化：白蛋白40.7 g/L，血肌酐(Scr)71 μmol/L。肝功能、血糖、凝血功能、結(jié)核抗體、降鈣素原、真菌G+GM試驗、肺癌標志物、巨細胞病毒、EB病毒、肺炎支原體+衣原體抗體、抗中性粒細胞漿抗體、抗GBM抗體、免疫球蛋白、ANA抗體譜、補體C3、補體C4均未見異常。乙肝抗原陽性，HBV-DNA定量8.95×102IU/mL，丙肝抗體、梅毒抗體、HIV抗體均陰性。查尿常規(guī)：尿隱血(+++)，尿蛋白(+++)，尿紅細胞144/HP。24 h尿蛋白定量7.4 g/d。泌尿系彩超：雙腎大小、形態(tài)未見異常，雙腎實質(zhì)回聲增強，考慮患者同時存在肺部、腎臟疾病，二者可能存在相關性，于7月24日行右腎穿刺活檢術，術后病理：光鏡：腎小球總數(shù)15～17個；腎小囊：細胞性新月體2個；系膜：節(jié)段細胞及基質(zhì)輕度增生；基膜：節(jié)段空泡變性；毛細血管腔：4個小球節(jié)段壞死。腎小管：小管上皮細胞中度變性；腎間質(zhì)、血管病變不明顯。免疫熒光：IgG、C3、κ、λ：7個小球基膜線狀沉積，IgA、IgM、C1q：7個小球陰性(圖2)?；颊吣I臟病理示腎小球以節(jié)段壞死及新月體形成病變?yōu)橹?，免疫熒光IgG、C3成線狀沉積，病理診斷為抗腎小球基底膜(GBM)病?；颊叻尾坎∽儎t考慮為抗GBM抗體引起的彌漫性肺泡出血。治療上予以雙膜血漿置換7次，潑尼松50 mg口服 qd，環(huán)磷酰胺50 mg 口服bid，纈沙坦降尿蛋白，恩替卡韋抗乙肝病毒等對癥支持治療。2018年8月6日復查生化：白蛋白26.7 g/L，Scr 85 μmol/L。24 h尿蛋白定量6.8 g/d。復查胸部CT示：雙肺磨玻璃樣病變較前明顯吸收(圖1)?；颊叱鲈汉罄^續(xù)規(guī)律服用上述藥物治療。2018年9月25日復查生化：白蛋白39.8 g/L，Scr 89 μmol/L，24 h尿蛋白定量13 g/d，尿常規(guī)：尿隱血(+++)，尿蛋白(+++)，尿紅細胞44/HP?？怪行粤＜毎麧{抗體、抗GBM抗體陰性，HBV-DNA定量陰性。再次收入院，予以甲潑尼龍500 mg連續(xù)靜滴3 d，環(huán)磷酰胺 1g 靜滴沖擊治療，囑患者出院后繼續(xù)服用潑尼松45 mg、每日一次后潑尼松逐漸減量，每2周減5 mg，直至10 mg、每日一次維持治療。10月30日予以環(huán)磷酰胺靜滴1 g沖擊治療，累積劑量8 g后停用。自11月27日開始服用他克莫司小劑量起始，后調(diào)整為1 mg口服、每日兩次。2019年4月30日復查生化：白蛋白40.8 g/L，Scr 81 μmol/L，24 h尿蛋白定量3.22 g/d，抗GBM抗體陰性。

討 論

抗GBM病是抗腎小球基底膜抗體介導的器官特異性自身免疫性疾病。抗GBM抗體的靶抗原位于Ⅳ型膠原α-3鏈羧基末端非膠原結(jié)構(gòu)域(non-collagenous domainC1，NC1)即α3(Ⅳ)NC1，含兩個主要的隱匿性抗原表位EA和EB[1- 2]，而Ⅵ型膠原α-3鏈限制表達于腎臟、肺臟、耳蝸、睪丸組織的基底膜及眼Bruch膜[3]。在各種誘發(fā)因素作用下，抗原表位暴露刺激產(chǎn)生抗GBM抗體。抗體作用于腎小球基底膜，導致局灶節(jié)段性纖維素樣壞死，常進展形成大量新月體，快速進展至腎衰竭；作用于肺泡基底膜，導致肺泡壁斷裂纖維化引起彌漫性肺出血，嚴重者發(fā)生大咯血威脅生命[4]。免疫熒光檢測可見免疫球蛋白IgG沿腎小球基底膜、肺泡壁基底膜成線性沉積。根據(jù)抗GBM病的定義，需同時具備：(1)腎小球腎炎或(和)肺出血；(2)血清抗 GBM 抗體陽性。然而，盡管十分少見，臨床上少部分組織病理證實為抗GBM病的患者，其血清中卻未能檢測出抗GBM抗體[5-9]。本文報道1例血清抗體酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測陰性的抗GBM病病例，并進行文獻回顧，分析血清抗體陰性的原因及加深對該病的認識。

抗GBM病病情險惡，早期快速診斷對挽救患者生命、擺脫透析治療十分關鍵。臨床上，通常采用商業(yè)化的ELISA試劑盒定量檢測患者血清中的抗GBM抗體，進行快速診斷和監(jiān)測治療效果。Sinico等[10]研究人員曾比較了4種抗GBM抗體ELISA試劑盒的產(chǎn)品性能，發(fā)現(xiàn)均具有良好的靈敏度，高達94.7%～100.0%，但特異性有所差異，最低90.9%，最高達100%。然而，已有多篇文獻報道在少數(shù)抗GBM病患者血清中，商業(yè)化的ELISA試劑盒并未能檢測到致病性的抗GBM抗體，分析可能原因：(1)ELISA檢測方法本身的局限性。用靈敏度更高的Western blotting替代ELISA方法可提高抗GBM病患者血清抗體的陽性檢出率。有文獻報道，使用ELISA和Western blotting兩種方法均未檢測出血清抗體的抗GBM病患者，利用biosensor技術卻能夠檢測出其血清致病抗體[6]。但是Western blotting和biosensor技術均難以在臨床工作中開展。(2)抗GBM抗體通常為免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)。IgG1亞類是主要的致病抗體[11]。而文獻報道一些抗GBM病患者其致病抗體為IgG4亞類[7]。臨床使用的商業(yè)化ELISA試劑盒是用于檢測抗GBM 的IgG型抗體，但對IgG4亞類不敏感。還有文獻報道一些患者的抗GBM抗體可為IgA型[12]，用商業(yè)化的ELISA試劑盒則檢測不出。(3)抗GBM抗體的靶抗原位于IV型膠原上。IV型膠原由6條不同的α鏈組成(α-1～α-6)，α(IV)鏈包括3個主要結(jié)構(gòu)域：NH2-末端7S結(jié)構(gòu)域、膠原域和羧基末端非膠原結(jié)構(gòu)域(non-collagenous domain C1，NC1)，3條鏈通過NC1之間的相互作用形成3種異源三聚體：α1α1α2、α3α4α5和α5α5α6，成熟GBM中只含α3α4α5[13-14]。通常認為抗GBM抗體的靶抗原位于α3(IV)NC1，含兩個主要的隱匿性抗原表位EA和EB。研究發(fā)現(xiàn)一些患者的抗GBM抗體并未作用于α-3鏈的EA和EB表位，可能通過識別α3α4α5(V)構(gòu)象型表位而致病[15]。還有一些研究報道抗GBM抗體靶抗原可能并未在α-3鏈上，而位于α5(IV)NC1或α4(IV)NC1[16]。商業(yè)化的ELISA試劑盒其微孔板包被的抗原是高度純化的IV型膠原α-3鏈，檢測不出上述特殊類型的抗GBM抗體。

本文報道的病例，多次使用商業(yè)化ELISA試劑盒檢測患者血清抗GBM抗體均為陰性，原因存在上述多種可能性，同時該患者的臨床表現(xiàn)以腎病范圍的大量蛋白尿為主，腎功能在正常范圍內(nèi)，在抗GBM病中并不常見。需考慮是否合并有膜性腎病、微小腎病、膜增生性腎小球腎炎、糖尿病腎病、乙肝相關腎病、單克隆免疫球蛋白相關腎病等可引起大量蛋白尿的腎臟疾病。該患者雖有乙肝病史，但其腎臟組織病理示光鏡下少部分腎小球毛細血管的節(jié)段壞死，小細胞新月體形成，免疫熒光為典型的IgG、C3沿GBM線性沉積，無其他部位免疫球蛋白的沉積。電鏡觀察腎小球足細胞可見節(jié)段足突融合，未見其他異常(圖3)，符合典型的抗GBM病病理特點，并不存在合并其他腎病的病理特征，最終診斷為抗GBM病。經(jīng)典的抗GBM病需要血漿置換聯(lián)合強的松加環(huán)磷酰胺免疫抑制治療來挽救腎功能或控制大咯血，而對于腎功能正常的抗GBM病患者尚沒有統(tǒng)一的指南和共識指導治療。少量的臨床觀察研究顯示，此類患者經(jīng)過積極的血漿置換和免疫抑制治療，能長期維持正常的腎功能[17-19]。本病例難以檢測患者血清抗GBM抗體滴度，難以評估血漿置換的治療劑量和效果；予以糖皮質(zhì)激素加環(huán)磷酰胺藥物治療，患者的腎功能維持在正常范圍，但蛋白尿無明顯緩解；改為小劑量潑尼松+他克莫司治療后，尿蛋白較前明顯下降，繼續(xù)門診隨訪觀察病情變化。目前，商業(yè)化的ELISA試劑盒已廣泛應用于臨床以快速檢測患者血清的抗GBM抗體。但由于檢測方法的局限性，陰性結(jié)果并不能完全排除抗GBM病。該病例提醒我們需結(jié)合患者的臨床特征、血清學、組織病理檢查結(jié)果進行綜合分析，組織病理仍是明確抗GBM病診斷的金標準。