血清可溶性α-Klotho在慢性腎臟病中生物學作用的研究進展

孫龍 朱國雙 鄧丹芳 林臘梅 李穎霞 王小琴

430065 武漢，湖北中醫(yī)藥大學(孫龍，朱國雙，鄧丹芳，林臘梅，李穎霞)；430061 武漢，湖北省中醫(yī)院(王小琴)

1997年日本學者Kuro-o首次報道了抗衰老基因Klotho(KL)[1]，從此開啟了KL研究的序幕。現(xiàn)已闡明膜型α-Klotho蛋白(membrane Klotho protein，mKL)在腎臟中有高水平的表達，其主要通過FGF23/FGFR/Klotho信號通路影響骨-腎-甲狀旁腺內(nèi)分泌軸的正負反饋機制，起到平衡體內(nèi)的鈣磷代謝的作用[2]。與mKL不同，可溶性α-Klotho(soluble α-klotho，sKL)被認為是一種類激素樣物質(zhì)，主要分布于血液、尿液和腦脊液中[3]。近期有關(guān)血清sKL的研究引起了廣泛的關(guān)注，研究報道在慢性腎臟病(CKD)早期患者血清sKL的水平就出現(xiàn)下降，并隨年齡的增長和估計腎小球濾過率(eGFR)的下降而逐漸降低[4-5]，患者血清低sKL水平還與其不良的腎臟疾病結(jié)局有關(guān)[6]。相關(guān)機制研究表明通過外源性補充或內(nèi)源性上調(diào)血清sKL的水平，能調(diào)控多種信號通路發(fā)揮保護腎臟功能和延緩病情進展的作用。本文圍繞sKL的結(jié)構(gòu)和來源、生物學功能及與CKD并發(fā)癥的關(guān)系等方面進行綜述。

一、sKL的來源和結(jié)構(gòu)

相關(guān)研究報道sKL主要有兩種來源，一種是mKL蛋白胞外域的脫落，另一種是α-KL基因選擇性剪切編碼的分泌型KL蛋白[7-8]，其中mKL是一種Ⅰ型單次跨膜蛋白，主要表達于腎臟、甲狀旁腺和腦脈絡(luò)叢中[1]。由于其胞外域較長(包含兩個重復序列KL1和KL2)，在去整合素-金屬蛋白酶10(ADAM10)、ADAM17和β-淀粉樣前體蛋白裂解酶1的作用下可脫落成為sKL[9]。根據(jù)酶裂解位點的不同生成3種產(chǎn)物，分別為單獨的KL1或KL2(68 kDa)片段與保留胞外域完整性的KL1和KL2片段(130 kDa)[8]。然而，最新研究表明在人血清或腦脊液中尚不能鑒定到剪切后的分泌型KL蛋白，而且也無法檢測到相對分子質(zhì)量低于130 kDa的KL蛋白分子[10-12]，因此推測血清中的sKL可能主要來源于mKL的脫落。

研究發(fā)現(xiàn)sKL的生成和代謝均與腎臟密切相關(guān)。在腎臟特異性α-KL基因敲除的小鼠體內(nèi)，其血清sKL的水平顯著降低[13]，提示sKL主要由腎臟表達的mKL脫落產(chǎn)生[14]。在臨床試驗中，Khodeir等[15]發(fā)現(xiàn)CKD患者血清sKL水平隨腎功能的損害加劇而進行性降低，并且血清中低sKL水平是CKD進展的獨立危險因素[16]，與CKD患者較高的死亡風險和不良的腎臟病結(jié)局密切相關(guān)[6，17-18]。此外，血清sKL水平與腎臟組織病理學形態(tài)有較強相關(guān)性，血清高sKL水平能降低腎間質(zhì)纖維化和局灶節(jié)段性硬化程度[19]。因此，血清sKL的水平可作為反映CKD嚴重程度的早期診斷和分期的標志物，并預測CKD患者的預后。

二、sKL的生物學功能

1.抑制TRPC6離子通道 瞬時受體電位陽離子通道6(transient receptor potential cation channel，subfamily C，member 6，TRPC6)是一種非選擇性陽離子通道，在足細胞損傷中起著重要的致病作用[20-21]。Kim等[22]發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的小鼠足細胞中，sKL通過減弱磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)依賴性TRPC6通道胞吐作用，能抑制足細胞中TRPC6介導的Ca2+內(nèi)流，并改善TRPC6基因過表達小鼠的足細胞骨架重塑和白蛋白滲漏。

研究顯示CKD晚期患者心肌肥厚的患病率高達90%，是導致舒張功能障礙、充血性心臟衰竭、心律失常和猝死的主要原因[23-24]，而且TRPC6通道介導的Ca2+內(nèi)流在心臟肥大病理過程中起重要作用[25]。Xie等[26]發(fā)現(xiàn)在野生型小鼠和心臟特異性過表達TRPC6小鼠的離體心肌細胞中，sKL能減弱TRPC6通路胞吐作用以抑制該通道的活性。進一步研究發(fā)現(xiàn)在5/6腎切除術(shù)誘導CKD模型小鼠中，表現(xiàn)出嚴重的心臟肥大和心臟纖維化。通過向KL雜合子CKD小鼠注射sKL能抑制心臟中TRPC6通道介導的Ca2+信號傳導，保護心臟免受應激誘導的心臟肥大和心臟纖維化[27]。

2.抑制Wnt/β-catenin通路 Wnt蛋白是一種高度保守的細胞外信號分子家族[28]，在CKD患者中Wnt信號通路出現(xiàn)異常激活并誘導下游β-catenin蛋白去磷酸化，進而上調(diào)多種纖維化因子的表達[29]。Zhou等用KL載體轉(zhuǎn)染人近端腎小管上皮細胞HKC-8細胞，發(fā)現(xiàn)KL的異位表達抑制了Wnt1介導的β-catenin激活及其核轉(zhuǎn)移。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)在單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)誘導的腎纖維化模型中，通過靜脈注射編碼sKL的質(zhì)粒上調(diào)小鼠體內(nèi)sKL的表達，能抑制UUO小鼠梗阻側(cè)腎臟中的β-catenin和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達，并減少梗阻側(cè)腎臟中腎間質(zhì)基質(zhì)蛋白的表達和沉積，從而減輕腎間質(zhì)纖維化[30]。

近期研究發(fā)現(xiàn)sKL還可以通過抑制Wnt/β-catenin通路介導的氧化應激以改善足細胞功能障礙[31]。Zhou等發(fā)現(xiàn)在高級氧化蛋白產(chǎn)物(advanced oxidation protein products，AOPPs)誘導的蛋白尿小鼠足細胞中檢測到Wnt/β-catenin通路的激活。研究通過上調(diào)模型小鼠腎小球中sKL的表達，能抑制β-catenin的活化并下調(diào)相關(guān)纖維化因子的表達，由此可保護足細胞的超微結(jié)構(gòu)、發(fā)揮改善蛋白尿作用。

3.抑制TGF-β1信號傳導 轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是一種強效的促纖維化細胞因子[32]，其誘導的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)在組織纖維化中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[33]。研究發(fā)現(xiàn)向UUO小鼠體內(nèi)注射純化的重組sKL蛋白能抑制梗阻側(cè)腎臟的纖維化。雖然檢測顯示sKL并未抑制UUO腎臟中TGF-β1的表達，但sKL能直接結(jié)合II型TGF-β受體以抑制TGF-β1信號傳導并下調(diào)下游相關(guān)纖維化因子的表達[34]。

研究還報道了sKL能抑制主動脈瓣的纖維化。研究發(fā)現(xiàn)在衰老加速小鼠P1(senescence-accelerated mice P1，SAMP1)的主動脈瓣中發(fā)現(xiàn)TGF-β1、α-SMA(肌成纖維細胞標記物)和Scleraxis(膠原合成的轉(zhuǎn)錄因子)的表達上調(diào)，表明加速衰老與肌成纖維細胞轉(zhuǎn)變和膠原基因激活有關(guān)。同時研究發(fā)現(xiàn)在該小鼠體內(nèi)血清sKL水平急劇下降，通過向小鼠體內(nèi)注射sKL cDNA的腺相關(guān)病毒增加其血清sKL的含量，能抑制主動脈瓣中的TGF-β1和Scleraxis的上調(diào)并且減弱SAMP1小鼠中的主動脈瓣纖維化疾病[35]。

4.激活Nrf2/HO-1通路 核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2‐related factor 2，Nrf2)是一種氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子，其介導內(nèi)源性抗氧化劑保護，并抵抗與心血管疾病相關(guān)的氧化應激[36]，而且CKD導致的血管老化主要與Nrf2介導的抗氧化防御減弱相關(guān)[37]。研究報道在人主動脈平滑肌細胞(HASMC)中，重組sKL能上調(diào)Nrf2以及下游血紅素加氧酶(HO-1)和過氧化物酶-1(peroxiredoxin-1，Prx-1)的表達，并增加HASMC中還原型谷胱甘肽(細胞內(nèi)抗氧化劑)的含量，而且經(jīng)過sKL預處理的HASMC能顯著減少血管緊張素II(AngII)誘導的超氧化物產(chǎn)生，減弱AngII誘導的細胞凋亡，表明sKL通過激活Nrf2信號傳導發(fā)揮抑制AngII介導的細胞凋亡的作用[38]。

Cui等[39]的研究進一步證實了sKL對Nrf2的調(diào)控作用 。該研究顯示在過氧化氫(H2O2)誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)氧化損傷模型中，sKL通過激活PI3K/AKT途徑上調(diào)Nrf2/HO-1的表達，能清除活性氧含量，增強抗氧化酶(超氧化物歧化酶和HO-1)的活性，抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素6(IL-6)的分泌，從而顯著增強HUVEC的活性。

5.激活TRPV5離子通道 Ca2+的腎臟排泄對全身鈣穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要并且受到嚴格調(diào)節(jié)，大約95%～98%濾過的Ca2+沿著腎小管被重吸收[40]。瞬時受體陽離子通道亞家族V成員5(transient receptor potential cation channel，subfamily V，member 5，TRPV5)是在遠曲腎小管和集合管的頂膜中表達的選擇性Ca2+通道，主要介導Ca2+的跨細胞再吸收[41]。Wolf等[42]報道在內(nèi)源性FGFR缺乏的細胞系中，用純化的sKL能激活該細胞中的TRPV5通道，表明sKL具有不依賴FGF23的Ca2+調(diào)節(jié)作用，而且mKL-FGFR協(xié)同受體的激活抑制了1，25-二羥維生素D3的合成，并減少腸道對磷酸鹽和鈣的吸收[2]。因此，推測sKL激活TRPV5離子通道可能會抵消1，25-二羥維生素D3合成對鈣平衡的影響，使FGF23-Klotho-FGFR軸能夠獨立于鈣平衡調(diào)節(jié)體內(nèi)磷酸鹽平衡。

6.抑制FGFR1/ERK通路 研究發(fā)現(xiàn)sKL通過抑制FGFR1/ERK通路抑制血管鈣化。Zhang等[43]在人骨髓間充質(zhì)干細胞(hBMSCs)中發(fā)現(xiàn)，當hBMSCs與sKL孵育后能下調(diào)FGFR1和pERK1/2的表達，并減少成骨細胞特異性基因表達和礦物質(zhì)沉積，發(fā)揮減弱其成骨分化的作用。Hum等[44]的研究進一步證實了這一機制，在內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)敲除的db/db(db/db-eNOS-/-小鼠模型中，隨著瘦素受體活性的喪失和eNOS的破壞，該模型小鼠表現(xiàn)出血糖顯著的升高和進行性腎損傷。在db/db-eNOS-/-小鼠中，通過注射重組sKL能減輕模型小鼠的高磷血癥和血管鈣化。體外實驗顯示其減輕血管鈣化的作用與sKL下調(diào)FGFR1/ERK通路相關(guān)。

7.sKL與CKD相關(guān)并發(fā)癥的關(guān)系 血清sKL水平與CKD心血管并發(fā)癥之間存在較強相關(guān)性。在一項針對維持性血液透析(maintenance hemodialysis，MHD)患者的多中心前瞻性研究中發(fā)現(xiàn)，血清中低sKL水平與心房纖顫(AF)發(fā)作相關(guān)，而且sKL與AF的關(guān)聯(lián)性強于傳統(tǒng)的心血管危險因素(如腎衰竭、年齡、性別、動脈硬化和心臟瓣膜病等)[45]。另外，在非透析患者的外周血中，低sKL和高FGF23水平也與AF的發(fā)作顯著相關(guān)[46]。

sKL還與CKD患者心肌肥厚和血管的功能相關(guān)。Kim等[47]發(fā)現(xiàn)血清sKL水平與左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)呈顯著負相關(guān)，但與臂-踝脈搏波速度(baPWV)之間沒有顯著關(guān)聯(lián)，說明血清sKL是LVMI的獨立生物標志物，但與動脈僵硬度無關(guān)。

研究還發(fā)現(xiàn)，sKL與CKD骨代謝異常的相關(guān)性。Zheng等[48]報道MHD患者血清sKL水平與骨密度(BMD)的變化具有相關(guān)性。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，MHD患者股骨頸和腰椎的BMD都與sKL水平呈正相關(guān)，說明血清sKL水平的增加可降低終末期腎病患者的CKD-MBD和低骨密度風險。此外，血清sKL濃度降低還是MHD患者腦血管疾病(中風和無癥狀腦梗塞)的獨立危險因素[49]。

三、小結(jié)和展望

上述研究闡明，血清中sKL主要由腎臟產(chǎn)生、代謝和清除，其介導多種信號通路以改善足細胞結(jié)構(gòu)、降蛋白尿、調(diào)節(jié)氧化應激和炎癥反應、抑制纖維化、調(diào)節(jié)鈣磷代謝、抑制成骨分化和保護血管功能。研究發(fā)現(xiàn)血清中sKL具有作為CKD生物學標志物的潛力，通過檢測血清sKL的水平能對患者病情進行早期診斷并判斷遠期預后，有助于臨床的診斷和療效的評價。然而研究顯示，商用sKL抗體質(zhì)量的標準化和一致性結(jié)果不佳[50]，可能會導致檢測結(jié)果存在較大的偏差甚至影響最后的研究結(jié)論，這提示使用相關(guān)試劑檢測前需衡量其質(zhì)量和檢測的一致性，盡量減少測量所導致的偏差。

綜上所述，sKL在保護CKD患者腎功能、延緩病情進展以及作為生物學標志物方面發(fā)揮重要的作用，而且其作為CKD治療靶點具有較好的潛力。