不同產(chǎn)地茯苓中總蛋白的含量差異比較

羅心遙 劉俊 李慧君 王天合 楊玉瑩 夏和元 葉曉川

摘 要 目的：比較不同產(chǎn)地茯苓中總蛋白的含量差異。方法：以牛血清白蛋白為對照，0.4 mol/L氫氧化鈉溶液為提取溶劑，考馬斯亮藍(lán)G-250為顯色劑，采用紫外分光光度法于595 nm波長處測定茯苓中總蛋白含量，并通過聚類分析對34批（S1～S34）不同產(chǎn)地的茯苓進(jìn)行分類。結(jié)果：牛血清白蛋白檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為1.45～17.40 μg/mL（r=0.999 6）;精密度、穩(wěn)定性（20 min）、重復(fù)性試驗的RSD均小于3%;加樣回收率為100.14%～104.26%（RSD=1.43%，n=9）;34批不同產(chǎn)地茯苓中總蛋白的含量為0.388 4%～1.129 7%。聚類分析結(jié)果顯示，34批茯苓中，湖北省英山縣產(chǎn)茯苓（S2、S3）的總蛋白含量>1%，歸為一類;湖北、云南、安徽和湖南產(chǎn)茯苓（S1、S5～S10、S12、S13、S16、S17、S19～S21、S23～S25、S28、S30、S31）的總蛋白含量為0.653 5%～0.946 1%歸為一類;剩余批次含量為0.388 4%～0.601 2%，歸為一類。結(jié)論：所建方法可用于獲苓中總蛋白的含量測定。34批不同產(chǎn)地茯苓總蛋白含量以湖北省英山縣產(chǎn)茯苓最高，云南、安徽等地次之。

關(guān)鍵詞 茯苓;蛋白;含量測定;差異;聚類分析

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： Compare the difference of total protein content of Poria cocos from different producing areas. METHODs： Using bovine serum albumin （BSA） as control， 0.4 mol/L sodium hydroxide solution as exctraction solution， Coomassie brilliant blue G-250 as chromogenic reagent， visible spectrophotometry at 595 nm was used to determine the contents of total protein of P. cocos; cluster analysis was used to classify 34 batches （S1-S34） of P. cocos from different producing areas. RESULTS： The linear range of BSA was 1.45-17.40 μg/mL （r=0.999 6）. RSDs of precision， stability （20 min） and reproducibility tests were all lower than 3%; recoveries were 100.14%-104.26% （RSD=1.43%， n=9）. The contents of total protein in 34 batches of P. cocos from different producing areas were 0.388 4%-1.129 7%. The results of cluster analysis showed that among 34 batches of P. cocos， the total protein content of P. cocos produced in Yingshan county of Hubei province （S2， S3）was higher than 1%， clustered into one category; the total protein contents of P. cocos produced in Hubei， Yunnan， Anhui and Hunan （S1， S5-S10， S12， S13， S16， S17， S19-S21， S23-S25， S28， S30， S31） were 0.653 5%-0.946 1%， clustered into one categony， and the remaining batch content were 0.388 4%-0.601 2%， clustered into one category. CONCLUSIONS： Established method is suitable for the content determination of total protein content of P. cocos. The protein content of P. cocos from Yingshan county of Hubei province is the highest， followed by Yunnan and Anhui in 34 batches of P. cocos from different producing areas.

KEYWORDS? ?Poria cocos; Protein; Content determination; Difference; Cluster analysis

茯苓為多孔菌科真菌茯苓[Poria cocos（Schw.）Wolf]的干燥菌核，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，是我國公布的第一批食藥同源品種之一[2]。茯苓性平，味甘、淡，歸心、肺、脾、腎經(jīng)，具有利水滲濕、健脾和胃、寧心安神的功效[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，茯苓含有多糖類、三萜類、蛋白類以及甾體類等化學(xué)成分，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抑菌、抗炎、抗氧化、抗纖維化等作用[4-9]。目前，有關(guān)植物蛋白及真菌蛋白的藥用價值已引起學(xué)者的廣泛關(guān)注，多種植物蛋白及真菌蛋白被報道具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗腫瘤等生理活性[10-13]。而現(xiàn)有關(guān)于茯苓活性成分的研究主要集中在多糖及三萜類成分[4-5]，對其蛋白成分的研究甚少，其原因可能與茯苓蛋白的提取較為困難有關(guān)[14]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，以水為溶劑幾乎不能提取茯苓總蛋白，這增加了含量測定難度。為此，本研究采用紫外分光光度法，以0.4 mol/L氫氧化鈉溶液為提取溶劑測定茯苓中總蛋白的含量，并對全國8個省份34批不同產(chǎn)地茯苓中總蛋白的含量進(jìn)行檢測，同時結(jié)合聚類分析進(jìn)行分類，旨在為茯苓資源質(zhì)量評價及后續(xù)進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

1800型紫外-可見分光光度計（日本Shimadzu公司）;BT25S型十萬分之一分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司];Milli-Q型純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）;DZF-6050型真空干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司）;KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;88-1型大功率磁力攪拌器（常州國華電器有限公司）。

1.2 藥材與試劑

分別收集來自全國8個省份不同地區(qū)不同種植田的茯苓共34批（編號：S1～S34），經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院葉曉川教授鑒定均為多孔菌科真菌茯苓[P. cocos（schw.）wolf]的干燥菌核。茯苓藥材信息來源見表1。牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)品（批號：EZ2811E172，純度：≥98.0%）、考馬斯亮藍(lán)G-250顯色劑（批號：EZ2811F373）均購自賽國生物科技有限公司;無水乙醇、磷酸、氫氧化鈉均為分析純，水為超純水。

[編號 產(chǎn)地 采收時間 編號 產(chǎn)地 采收時間 S1 湖北英山石頭咀鎮(zhèn) 2018.07 S18 云南大理市永平縣 2018.04 S2 湖北英山石頭咀鎮(zhèn) 2018.11 S19 云南大理市永平縣 2018.07 S3 湖北英山石頭咀鎮(zhèn) 2018.11 S20 云南麗江永勝鎮(zhèn) 2018.04 S4 湖北英山雷家店鎮(zhèn) 2018.11 S21 云南景谷傣族彝族自治縣 2018.07 S5 湖北英山雷家店鎮(zhèn) 2018.11 S22 云南寧洱哈尼族彝族自治縣 2018.07 S6 湖北英山吉利中藥材公司種植基地 2018.11 S23 云南普洱市孟連縣 2018.12 S7 湖北羅田縣九資河鎮(zhèn) 2018.11 S24 云南保山騰沖市 2018.04 S8 湖北羅田縣九資河鎮(zhèn) 2018.07 S25 云南保山騰沖市 2017.11 S9 湖北羅田縣九資河鎮(zhèn) 2018.11 S26 云南保山騰沖市 2018.12 S10 湖北羅田縣九資河鎮(zhèn) 2018.11 S27 云南保山騰沖市 2018.12 S11 湖北麻城縣木子店鎮(zhèn) 2017.09 S28 湖南懷化鶴城區(qū) 2018.04 S12 湖北麻城縣木子店鎮(zhèn) 2018.11 S29 河南商城縣黃柏山 2017.11 S13 湖北恩施土家族苗族自治州利川市 2018.03 S30 安徽安慶岳西縣 2017.07 S14 云南楚雄大地基鄉(xiāng) 2018.04 S31 安徽安慶岳西縣 2018.12 S15 云南楚雄大地基鄉(xiāng) 2018.07 S32 貴州銅仁德江縣 2018.07 S16 云南楚雄猛虎鄉(xiāng) 2018.12 S33 福建南平順昌縣 2017.10 S17 云南楚雄雙柏縣 2018.12 S34 廣西岑溪馬路鎮(zhèn) 2018.07 ]

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液 取BSA標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加水溶解，制成質(zhì)量濃度為0.174 mg/mL的BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液，于4 ℃冰箱中保存，備用。

2.1.2 供試品溶液 取茯苓（編號：S1）適量，粉碎，過40目篩。取上述粉末2 g，精密稱定，加入0.4 mol/L氫氧化鈉溶液70 mL，置于磁力攪拌器上攪拌15 min，濾過，精密吸取續(xù)濾液5 mL，置于25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.2 檢測波長的確定

分別精密吸取“2.1”項下BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液各1 mL，加入考馬斯亮藍(lán)G-250顯色劑5 mL，混勻，以水為空白，在300～800 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，考察其最佳吸收波長。結(jié)果，BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液均在595 nm波長附近有最大吸收，因此選擇595 nm作為檢測波長，詳見圖1。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.1.1”項下BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6 mL，置于10 mL試管中，加水至1.0 mL，再分別加入考馬斯亮藍(lán)G-250顯色劑5 mL，混勻，以水為空白，于595 nm波長處測定吸光度，以系列BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果，BSA的回歸方程為y=43.101x+0.036 6（r=0.999 6），表明BSA質(zhì)量濃度在1.45～17.40 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度的線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗

精密吸取“2.1.1”項下BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2 mL，置于10 mL試管中，加水至1.0 mL，加入考馬斯亮藍(lán)G-250顯色劑5 mL，混勻，以水為空白，于595 nm波長處連續(xù)測定6次吸光度。結(jié)果，BSA吸光度的RSD為0.02%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取“2.1.2”項下供試品溶液（編號：S1）適量，加入考馬斯亮藍(lán)G-250顯色劑5 mL，混勻，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 min時，以水為空白，于595 nm波長處測定吸光度。結(jié)果，吸光度的RSD為1.58%（n=11），表明供試品溶液在室溫下放置20 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗

取茯苓樣品（編號：S1）粉末2 g，共6份，精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，加入考馬斯亮藍(lán)G-250顯色劑5 mL，混勻，以水為空白，于595 nm波長處測定吸光度并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算茯苓總蛋白的含量。結(jié)果，茯苓總蛋白的平均含量為0.946 1%，RSD為2.74%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗

取已知含量的茯苓樣品（編號：S1）2 g ，共9份，精密稱定，分別按已知蛋白含量的80%、100%、120%加入BSA標(biāo)準(zhǔn)品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，加入考馬斯亮藍(lán)G-250顯色劑5 mL，混勻，以水為空白，于595 nm波長處測定吸光度并計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.8 不同產(chǎn)地茯苓中總蛋白的含量測定

取34批茯苓樣品（編號：S1～S34）粉末2 g，每批平行取3份，精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，然后加入考馬斯亮藍(lán)G-250顯色劑5 mL，混勻，以水為空白，于595 nm處測定吸光度并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算茯苓總蛋白含量，結(jié)果見表3。

2.9 聚類分析

為評價茯苓產(chǎn)地與總蛋白含量的相關(guān)性，將34批茯苓總蛋白含量測定結(jié)果代入SPSS 22.0軟件，采用聚類分析法結(jié)合平均歐式距離（d）進(jìn)行分析，生成34批不同產(chǎn)地茯苓總蛋白含量的聚類分析樹狀圖，詳見圖2。

由圖2可知，當(dāng)d=10時，34批茯苓可聚分為3類，其中S2、S3聚為一類，該類樣品總蛋白含量最高（均>1%），均產(chǎn)于湖北省英山縣石頭咀鎮(zhèn);S1、S5～S10、S12、S13、S16、S17、S19～S21、S23～S25、S28、S30、S31聚為一類，該類樣品總蛋白含量較高（0.653 5%～0.946 1%），? ?來自于湖北、云南、安徽和湖南;S4、S11、S14、S15、S18、S22、S26、S27、S29、S32～S34聚為一類，該類樣品總蛋白含量相對較低（0.388 4%～0.601 2%），來自于湖北、云南、河南、廣西、福建和貴州。由此可知，湖北和部分云南產(chǎn)茯苓總蛋白的含量明顯高于其他產(chǎn)地，其中湖北省英山縣石頭咀鎮(zhèn)的3個批次茯苓中總蛋白含量均較高。

3 討論

3.1 樣品前處理條件的選擇

蛋白質(zhì)的提取方法主要有回流提取法、酶提取法、超聲波提取法、攪拌法等[15-16]。本課題組前期比較了超聲波提取法和磁力攪拌法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)磁力攪拌法可使茯苓粉末更加充分溶解，從而使試驗更加準(zhǔn)確、快捷，故選擇磁力攪拌法。

本研究取茯苓樣品（編號：S1），在料液比（1 ∶ 20，g/mL）、提取溶劑濃度為0.1 mol/L的條件下，考察了不同溶劑（鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉）對茯苓總蛋白提取率的影響。結(jié)果顯示，以氫氧化鈉溶液為溶劑時，茯苓總蛋白的提取效果最佳。筆者在研究中發(fā)現(xiàn)，茯苓粉碎成粉末后，具有明顯的疏水性，除堿性溶液外，其在超純水、酸性溶液和鹽溶液中幾乎提取不出蛋白，如楊嵐等[14]采用水和50%乙醇為提取溶劑，所得水溶性蛋白約4.0×10-6%～7.8×10-6%，醇溶性蛋白約4.38×10-5%～6.11×10-5%，與茯苓總蛋白含量相差甚遠(yuǎn)（1.7×10-3%～2.5×10-3%），且測得的總蛋白含量也較低。

本研究又考察了不同濃度氫氧化鈉溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mol/L）及不同料液比（1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 25、1 ∶ 30、1 ∶ 35、1 ∶ 40、1 ∶ 45、1 ∶ 50，g/mL）對茯苓總蛋白提取率的影響。結(jié)果顯示，總蛋白含量可隨氫氧化鈉溶液濃度的升高而呈先上升后下降的趨勢，且當(dāng)氫氧化鈉溶液濃度為0.4 mol/L 時，提取的總蛋白含量最高，推測其原因可能為氫氧化鈉濃度過大會導(dǎo)致蛋白變性，溶解度降低;當(dāng)料液比為1 ∶ 35（g/mL）時，提取的蛋白含量最高，且隨著料液比的增加，蛋白含量無明顯變化;考慮到實際成本，設(shè)置料液比為1 ∶ 35（g/mL）。

3.2 蛋白含量測定方法的選擇

常用的蛋白定量測定方法有凱氏定氮法、雙縮脲法、考馬斯亮藍(lán)G-250比色法等[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，凱氏定氮法易受測定體系中其他含氮化合物的干擾，無法測定準(zhǔn)確的含量[18]。故本研究比較了雙縮脲法和考馬斯亮藍(lán)G-250比色法，發(fā)現(xiàn)前者由于靈敏度低，不適合茯苓總蛋白的測定?？捡R斯亮藍(lán)G-250比色法的原理為蛋白與染料結(jié)合生成深藍(lán)色的結(jié)合物，后者在595 nm波長處有最大吸收值，具靈敏度高、抗干擾性強(qiáng)的特點[17]，并具有一定的專屬性，因此采用此法進(jìn)行茯苓總蛋白的定量測定。筆者在研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)茯苓蛋白樣品加入呈酸性的考馬斯亮藍(lán)G-250顯色劑時會立刻導(dǎo)致茯苓酸性多糖析出，且沉淀顯藍(lán)色，離心后的上清液在595 nm波長處檢測的吸光度為負(fù)值，故可推斷茯苓中蛋白與酸性多糖結(jié)合在一起形成了糖蛋白。針對加入顯色劑出現(xiàn)沉淀而導(dǎo)致無法檢測的問題，本研究對提取茯苓總蛋白氫氧化鈉溶液濃度及提取液稀釋倍數(shù)進(jìn)行了探索;同時考慮到不同產(chǎn)地茯苓中總蛋白含量可能存在較大差異，導(dǎo)致吸光度偏大或偏小，最終確定將樣品稀釋5倍，并確保加入顯色劑后20 min內(nèi)樣品穩(wěn)定，解決了采用考馬斯亮藍(lán)G-250比色法測定茯苓中總蛋白含量有沉淀析出的難題。

3.3 不同產(chǎn)地茯苓中總蛋白含量差異分析

34批不同產(chǎn)地茯苓中總蛋白含量測定結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地茯苓中總蛋白含量存在差異，其含量范圍為0.388 4%～1.129 7%，聚類分析可將其分為三大類，湖北、云南、湖南和安徽4個茯苓主產(chǎn)區(qū)的總蛋白含量較其他產(chǎn)區(qū)高，其中湖北省英山縣石頭咀鎮(zhèn)的茯苓總蛋白含量最高。有研究指出，湖北、云南和安徽是茯苓的主產(chǎn)區(qū)，茯苓藥材品質(zhì)較好[18-19]，與本研究聚類分析結(jié)果一致。本課題組前期研究結(jié)果顯示，茯苓酸性多糖具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能[20]，本研究又發(fā)現(xiàn)茯苓總蛋白可能與酸性多糖結(jié)合形成糖蛋白，由此推測茯苓酸性多糖可能以糖蛋白形式發(fā)揮免疫活性，而蛋白含量高低可能影響其藥理活性，后續(xù)可對此進(jìn)行深入研究。

綜上所述，本法可用于茯苓中總蛋白含量的測定。34批不同產(chǎn)地茯苓中總蛋白含量存在一定差異，其中以湖北英山縣產(chǎn)茯苓的總蛋白含量最高，可為后續(xù)茯苓質(zhì)量評價及活性研究提供參考。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 顧觀光.神農(nóng)本草經(jīng)[M].楊鵬舉，校注. 3版.北京：學(xué)苑出版社，2007：98.

[ 2 ] 王利亞.茯苓的開發(fā)與應(yīng)用[J].食品科技，1997，4（8）：16-17.