酢漿草的HPLC指紋圖譜建立及2種有效成分的含量測(cè)定

李小雙 李銀 劉文靜 王廣成 鄭林 陳思穎 李勇軍

摘 要 目的：建立酢漿草的高效液相（HPLC）指紋圖譜，并同時(shí)測(cè)定其中異牡荊素、當(dāng)藥黃素的含量。方法：采用HPLC法。色譜柱為ACE Excel-5-C18，流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水溶液（梯度洗脫），流速為1 mL/min，柱溫為35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，進(jìn)樣量為10 μL。以異牡荊素峰為參照，繪制12批酢漿草藥材樣品的HPLC指紋圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，確定共有峰。按上述色譜條件同法測(cè)定異牡荊素、當(dāng)藥黃素的含量。結(jié)果：12批酢漿草藥材樣品共有19個(gè)共有峰，相似度均大于0.89，同時(shí)指認(rèn)異牡荊素、當(dāng)藥黃素2個(gè)共有峰。異牡荊素、當(dāng)藥黃素檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍分別為3.91～117.36 μg/mL（r=0.999 4）、9.88～118.56 μg/mL（r=0.999 2）;定量限分別為0.675、3.587 μg/mL;檢測(cè)限分別為0.205、1.087 μg/mL;精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD均小于2%;加樣回收率分別為95.46%～99.10%（RSD=1.23%，n=6）、95.34%～101.23%（RSD=2.74%，n=6）;平均含量分別為0.227～1.654、0.641～2.052 mg/g。結(jié)論：所建指紋圖譜可用于酢漿草藥材的質(zhì)量控制;含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于同時(shí)測(cè)定其中2種成分的含量。

關(guān)鍵詞 酢漿草;高效液相色譜法;指紋圖譜;異牡荊素;當(dāng)藥黃素;含量測(cè)定

酢漿草為酢漿草科植物酢漿草（Oxalis corniculata L.）的新鮮或干燥全草，又稱酸咪咪[1]，為貴州省少數(shù)民族常用藥材，具有清熱利濕、涼血消腫等功效[2]。該藥主要分布于我國(guó)華北、華中、華南及西南等地區(qū)[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，酢漿草主要含有黃酮類、酚酸類等成分[4-7]，具有抗炎殺菌、活血化瘀、抗腫瘤、抗氧化、保肝等藥理活性[8-10]。本課題組前期的化學(xué)成分研究中，分離得到了其黃酮類的代表性成分異牡荊素、當(dāng)藥黃素[11]。藥理活性研究表明，異牡荊素具有抗癌、抗炎、抗氧化等作用[9]，當(dāng)藥黃素具有抗抑郁、抗炎等作用[12-13]。

指紋圖譜具有整體性、模糊性的特征，符合中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論的特點(diǎn)，是中藥質(zhì)量控制的有效手段;傳統(tǒng)單一化學(xué)成分的含量測(cè)定難以全面反映藥材質(zhì)量，而多指標(biāo)含量測(cè)定可在一定程度上更為有效地保證藥材質(zhì)量，中藥材指紋圖譜結(jié)合多指標(biāo)含量測(cè)定能全面地反映藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣，已成為中藥質(zhì)量控制的科學(xué)有效手段[14]。目前，酢漿草收錄于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[2]中，該標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)其生藥及薄層鑒別作出規(guī)定;現(xiàn)有的關(guān)于酢漿草質(zhì)量控制的研究中，也僅有對(duì)酢漿草中異牡荊素的定量研究[15]，且建立的指紋圖譜均未指認(rèn)共有峰[16-17]?；诖?，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）建立了酢漿草的指紋圖譜，并同時(shí)測(cè)定了其中異牡荊素、當(dāng)藥黃素的含量，旨在為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供參考。

1 材料

1.1 儀器

UltiMate3000型HPLC儀，包括系統(tǒng)控制器、低壓梯度組件、溫控樣品室、輸液泵、脫氣組件、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器、Chromeleon 7.0色譜工作站（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）;AE240型十萬分之一電子天平[梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司];Allegra64R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）;KQ-5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;WP-UP-Ⅱ-20型超純水機(jī)（四川沃特爾科技發(fā)展有限公司）。

1.2 藥品與試劑

當(dāng)藥黃素對(duì)照品（純度：≥98%）、異牡荊素對(duì)照品（純度：≥98%）均由貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制;甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

12批酢漿草樣品（編號(hào)：S1～S12，貴州維康子帆藥業(yè)股份有限公司），經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室劉春花副教授鑒定為酢漿草科酢漿草屬植物酢漿草（O. corniculata L.）的干燥全草。酢漿草藥材信息來源詳見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ACE Excel-5-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，10%A→26%A;10～20 min，26%A→27%A;20～30 min，27%A→29%A;30～36 min，29 A→32.5%A;36～46 min，32.5%A→39%A;46～57 min，39%A→55%A;57～71 min，55%A→80%A;71～77 min，80%A→95%A）;流速：1 mL/min;柱溫：35 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm;進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取異牡荊素對(duì)照品、當(dāng)藥黃素對(duì)照品各10 mg，精密稱定，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得異牡荊素、當(dāng)藥黃素質(zhì)量濃度分別為0.978、0.988 mg/mL的單一對(duì)照品貯備液。取上述異牡荊素對(duì)照品貯備液0.3 mL、當(dāng)藥黃素對(duì)照品貯備液0.4 mL，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制得含異牡荊素、當(dāng)藥黃素質(zhì)量濃度分別為0.0587、0.0790 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取酢漿草粉末（過50目篩）約1 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，加70%乙醇25 mL，超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz）處理30 min，取出，放冷，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，取上層液，置于離心管中以12 000 r/min離心10 min，取上清液，即得供試品溶液。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S2）適量，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣平行測(cè)定6次，以異牡荊素的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，19個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明方法精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S2）適量，分別于室溫下放置0、3、6、9、12、24 h時(shí)，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以異牡荊素的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，19個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取酢漿草藥材樣品（編號(hào)：S2）粉末約1 g，共6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按 “2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以異牡荊素的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，19個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.1.7 HPLC指紋圖譜的生成 取12 批酢漿草藥材樣品粉末，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按 “2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》進(jìn)行HPLC 圖譜分析，詳見圖1、圖2。

2.1.8 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》，以12批酢漿草藥材樣品的HPLC 對(duì)照指紋圖譜為對(duì)照，進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果，12 批酢漿草藥材樣品的相似度均大于0.89，表明各批酢漿草藥材樣品間化學(xué)成分一致性良好，詳見表2。

2.1.9 共有峰的指認(rèn)及相關(guān)分析 12批酢漿草藥材樣品共有19個(gè)共有峰。通過與混合對(duì)照品HPLC圖譜（圖3B）比對(duì)，指認(rèn)了2個(gè)共有峰，即8號(hào)峰為異牡荊素，9號(hào)峰為當(dāng)藥黃素。其中異牡荊素響應(yīng)值較高、分離度較好，故以此峰為參照，計(jì)算其他共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，詳見表3、表4。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 同“2.1.1”項(xiàng)。

2.2.2 溶液的制備 混合對(duì)照品溶液的制備同“2.1.2”項(xiàng);供試品溶液的制備同“2.1.3”項(xiàng);以甲醇為空白對(duì)照溶液。

2.2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn) ? 取上述混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白對(duì)照溶液各10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，詳見圖3。結(jié)果，在該色譜條件下，空白對(duì)照對(duì)測(cè)定無干擾，各成分峰分離度較好，峰形對(duì)稱，理論板數(shù)按異牡荊素峰計(jì)不低于30 000。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.1.1”項(xiàng)下異牡荊素對(duì)照品貯備液0.02、0.09、0.15、0.20、0.30、0.60 mL，當(dāng)藥黃素對(duì)照品貯備液0.05、0.10、0.15、0.30、0.40、0.60 mL，置于6個(gè)5 mL量瓶?jī)?nèi)，分別用甲醇稀釋至刻度，制成系列混合對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以各待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果，異牡荊素回歸方程為y=0.423 1x+0.707 9（r=0.999 4）、當(dāng)藥黃素回歸方程為y=0.351 0x-0.469 1（r=0.999 2），表明異牡荊素、當(dāng)藥黃素分別在質(zhì)量濃度3.91～117.36、9.88～118.56 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

2.2.5 定量限與檢測(cè)限考察 分別精密量取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，以甲醇為溶劑倍比稀釋，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1計(jì)算定量限 、檢測(cè)限。結(jié)果，異牡荊素、當(dāng)藥黃素的定量限分別為0.675、3.587 μg/mL，檢測(cè)限分別為0.205、1.087 μg/mL。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 分別精密量取“2.1.1”項(xiàng)下各單一對(duì)照品貯備液0.30 mL，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣平行測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，異牡荊素、當(dāng)藥黃素峰面積的RSD分別為0.2%、0.2%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S2），分別于室溫下放置0、3、6、9、12、24 h時(shí)，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，異牡荊素、當(dāng)藥黃素峰面積的RSD分別為0.8%、1.1%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取酢漿草藥材（編號(hào)：S2）粉末約1 g，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量。結(jié)果，異牡荊素、當(dāng)藥黃素的平均含量分別為0.524、0.724 mg/g，RSD分別為0.5%、0.9%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的酢漿草藥材（編號(hào)：S2）粉末約0.5 g，共6份，精密稱定，分別加入適量的“2.1.1”項(xiàng)下各單一對(duì)照品貯備液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表5。

2.2.10 樣品含量測(cè)定 取12批酢漿草藥材樣品粉末適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定3次，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表6。

3 討論

在前期預(yù)試驗(yàn)中，筆者采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)樣品在190 ～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外吸收掃描，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)峰形較好，基線較平穩(wěn)，故選擇280 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。同時(shí)，本研究比較了乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液等流動(dòng)相系統(tǒng)的分離效果，發(fā)現(xiàn)以甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，各成分峰分離度較好、峰形對(duì)稱，故選擇甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相。 此外，本研究分別對(duì)不同提取溶劑（100%、70%、50%、20%甲醇和100%、70%、50%、20%乙醇）、提取方法（超聲提取和回流提?。⑻崛r(shí)間（15、30、60、90、120 min）進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)在相同的色譜條件下，70%乙醇為提取溶劑時(shí)峰數(shù)較多、分離度較好、響應(yīng)值較高，故選擇70%乙醇為提取溶劑;超聲提取和回流提取差異不明顯，考慮到環(huán)保節(jié)能、操作簡(jiǎn)便等因素，最終選擇超聲提取;當(dāng)超聲30 min時(shí)色譜峰數(shù)較多，且30 min后提取率[在考慮指紋圖譜整體色譜峰信息的同時(shí)結(jié)合異牡荊素、當(dāng)藥黃素的提取率（以這兩個(gè)指標(biāo)成分峰面積計(jì)）]無顯著增加，故選擇提取時(shí)間為30 min。

本研究結(jié)果顯示，12批酢漿草藥材樣品的相似度均大于0.89，相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.5%，但樣品相對(duì)峰面積RSD較大，提示各批藥材樣品的化學(xué)成分一致性雖較好，但其含量存在差異，該結(jié)果與含量測(cè)定結(jié)果一致，其原因可能為酢漿草的生長(zhǎng)可受環(huán)境、年限、采收時(shí)間、栽培等因素的影響[18]。

綜上所述，所建指紋圖譜可用于酢漿草藥材的質(zhì)量控制;含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于同時(shí)測(cè)定其中2種成分的含量。

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（收稿日期：2019-07-23 修回日期：2020-02-07）

（編輯：陳 宏）