脈沖暴露下無機(jī)砷對大型溞急性毒性效應(yīng)

謝希琳，汪寧欣，周美霞

安徽工業(yè)大學(xué)能源與環(huán)境學(xué)院，馬鞍山 243032

砷(arsenic)的元素符號是As，在元素周期表中位于第四周期、第ⅤA族，是一種有毒類金屬[1]。砷主要分為有機(jī)砷和無機(jī)砷兩大類，一般來說無機(jī)砷比有機(jī)砷毒性更大[2]。水體中的無機(jī)砷主要是以五價砷(arsenate, As(Ⅴ))和三價砷(arsenite, As(Ⅲ))2種形式存在[3]。人們長期接觸無機(jī)砷化合物會導(dǎo)致多種疾病，例如導(dǎo)致色素沉淀、外周血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，并且誘發(fā)皮膚、肝臟、膀胱和前列腺等各種癌癥甚至?xí)?dǎo)致死亡[4-5]。雖然，世界衛(wèi)生組織(WHO)將飲用水砷濃度標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為10 μg·L-1[6]，但是在阿根廷、孟加拉國、智利、中國、印度、墨西哥和美國等很多國家仍然有不同程度的水體砷污染[7-8]。

大型溞(Daphniamagna)是實驗室中一種較常見的模式生物，因其個體小、繁殖快、產(chǎn)量多、易培養(yǎng)且對毒物的敏感性較高，經(jīng)常被用于環(huán)境中各類有毒有害物質(zhì)的生態(tài)毒理學(xué)研究[9]。郭婧穎等[10]以大型溞為受試生物，研究了典型持久性有機(jī)物雙酚AF對大型溞的急性和慢性毒性。陳麗萍等[11]研究了重金屬離子Hg2+、Ni2+和Mn2+對大型溞的48 h急性毒性，結(jié)果表明，3種重金屬離子對大型溞毒性大小依次為Hg2+>Ni2+>Mn2+。在新型環(huán)境污染物的研究中，大型溞仍有廣泛應(yīng)用。劉倩等[12]以大型溞作為受試生物，研究納米氧化鋅對大型溞致毒效應(yīng)，結(jié)果表明，納米氧化鋅釋放的鋅離子對大型溞具有一定的毒性。而Dokyung等[13]研究了2種不同類型的微塑料和鎳(Ni)對大型溞的混合毒性。

目前的水生生物毒性測試大部分根據(jù)經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)規(guī)定的毒性測試方法[14]進(jìn)行。其重要特點是將生物暴露于濃度持續(xù)穩(wěn)定的環(huán)境條件下。但是在自然水體環(huán)境中，污染物濃度處于時刻變化的狀態(tài)中，而非保持穩(wěn)定的狀態(tài)[15]。脈沖暴露的方式可以更好地模擬水體中污染物濃度變化下生物暴露的情況[16]。脈沖暴露方式是污染物進(jìn)入自然環(huán)境后較常見的暴露形式，所以也受到了越來越多的關(guān)注。Widianarko等[17]的研究關(guān)注脈沖暴露條件下重金屬鋅(Zn)對孔雀魚的毒性，結(jié)果表明，脈沖暴露條件相較于傳統(tǒng)持續(xù)暴露可以更好地模擬現(xiàn)場條件。Naddy和Klaine[18]通過慢性毒性實驗發(fā)現(xiàn)，在相同暴露時間內(nèi)，間隔較短、更頻繁的脈沖暴露會減小毒死蜱對大型溞的毒性。Hoang和Klaine[19]以大型溞為研究對象，研究重金屬硒(Se)脈沖方式暴露的毒性影響，發(fā)現(xiàn)暴露時間間隔越長，Se對大型溞的毒性越小。然而，Van der Hoeven和Gerritsen[20]在研究毒死蜱脈沖暴露方式對蚤狀溞的毒性時發(fā)現(xiàn)，脈沖暴露的方式并不能降低溞的死亡率。綜上所述，在脈沖暴露模式下，一方面，可能由于對環(huán)境的適應(yīng)和生理的恢復(fù)等使受試生物的耐受性增強(qiáng)，而導(dǎo)致毒性降低；另一方面，也可能由于能量的消耗和體內(nèi)的累積等降低生物的耐受性，而導(dǎo)致毒性增高[21-22]。因此，探討脈沖暴露模式下受試生物對毒物的耐受性還有待進(jìn)一步深入。

本研究選取大型溞為受試生物，運用不同的脈沖暴露方式，研究2種無機(jī)砷對大型溞的急性毒性作用及其生物效應(yīng)。通過改良的OECD暴露方法，探究不同暴露模式對大型溞毒性的影響，并且通過監(jiān)測生物存活率以及砷的生物富集量來評估無機(jī)砷的毒性作用，以期為生態(tài)毒理學(xué)提供相關(guān)的科學(xué)數(shù)據(jù)，為評價砷的環(huán)境風(fēng)險提供更有效的信息。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 生物培養(yǎng)

所用的大型溞來自中國科學(xué)院水生生物研究所，且均已在本實驗室培養(yǎng)3代以上。培養(yǎng)大型溞的自來水需要曝氣48 h后用0.45 μm的PC膜抽濾而獲得，放置于光照培養(yǎng)箱中。溫度保持在25 ℃±1 ℃，光暗循環(huán)比為12 h∶12 h，光強(qiáng)設(shè)置為2 000 lux，pH維持在8.0±1.0。每2天更換一次培養(yǎng)用水，同時挑出新生的大型溞。大型溞每天喂食一次離心濃縮后的萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)，喂食量為大溞1×105cells·mL-1，小溞5×104cells·mL-1。

喂食的萊茵衣藻來自中國科學(xué)院水生生物研究所，于3 L的錐形瓶中加入2 L蒸餾水經(jīng)高壓蒸汽滅菌鍋121 ℃滅菌20 min，冷卻后配制WC培養(yǎng)基[23]，培養(yǎng)基具體組分如表1所示。接入藻種后于恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，溫度保持在25 ℃±1 ℃，光暗循環(huán)比為12 h∶12 h，光強(qiáng)設(shè)置為2 000 lux(單獨設(shè)置一個臺燈以增加光照強(qiáng)度)，用空氣泵對其進(jìn)行曝氣處理，加速藻的生長，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，以3 000 r·min-1離心收集，放入4 ℃的冰箱保存。

表1 WC培養(yǎng)基組分Table 1 Chemical composition of WC medium

1.2 實驗試劑及儀器

As(Ⅴ)和As(Ⅲ)標(biāo)準(zhǔn)溶液(o2si smart solutions，百靈威科技有限公司，美國)，消解所用硝酸(HNO3)(BⅤ-Ⅲ級，北京化學(xué)試劑有限公司，中國)和體積分?jǐn)?shù)為30%的過氧化氫(H2O2)(分析純，上海沃凱生物技術(shù)有限公司，中國)。

磁力攪拌器(PHS-25，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司，中國)；電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)(NexION300，珀金埃爾默股份有限公司，美國)；人工氣候培養(yǎng)箱(RGX-350B，上海坤天實驗儀器公司，中國)；隔膜真空泵(GM-0.33A，天津市津騰實驗設(shè)備有限公司，中國)；高速離心機(jī)(LXJ-IIB，上海安亭科學(xué)儀器廠，中國)；立式高壓蒸汽滅菌鍋(LS-SOHD，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備公司，中國)；垂直送風(fēng)凈化工作臺(SW-CJ-1D，上海鼎科公司，中國)。

表2 SM 7培養(yǎng)基組分Table 2 Chemical composition of SM 7 medium

1.3 實驗設(shè)置

1.3.1 持續(xù)暴露急性毒性實驗

實驗所用大型溞為同一母系同一批次生殖7 d左右的溞。實驗前將蒸餾水滅菌，冷卻后配制培養(yǎng)基，采用Elendt M 7培養(yǎng)基[24]簡化后的SM 7培養(yǎng)基，培養(yǎng)基具體組分如表2所示，然后配制含砷的培養(yǎng)液。實驗設(shè)置6個不同的砷濃度組，分別為0、0.5、1.5、3、4.5、6和7.5 mg·L-1，每個濃度組設(shè)置3個平行樣，調(diào)pH為8.0左右，倒入50 mL小燒杯中靜置平衡6 h左右，每個處理組中放入10只大型溞。加入大型溞前1 h對大型溞進(jìn)行簡單的預(yù)處理：將大型溞放入干凈的培養(yǎng)基中，使其適應(yīng)并排空腸道中的食物。實驗持續(xù)48 h(即0 h脈沖暴露實驗)，實驗期間不需要給大型溞喂食也不需要更換培養(yǎng)基。實驗過程中每3 h記錄一次大型溞的死亡個數(shù)，并及時將死亡大型溞挑出烘干待測。實驗結(jié)束后使用隔膜真空泵將大型溞過濾出來，并使用配制的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)沖洗大型溞表面殘留的砷溶液，收集樣品放入離心管中。PBS緩沖液配制方法：使用SM 7培養(yǎng)基，1 L中加入2 mL提前配制好的磷酸氫二鉀(K2HPO4)溶液。采用HNO3+H2O2消解樣品：向樣品中加入0.5 mL HNO3，常溫下靜置10 min，再轉(zhuǎn)移入80 ℃烘箱中消解10 min，拿出冷卻至室溫后加入2 mL體積分?jǐn)?shù)為30%的H2O2，接著放入110 ℃烘箱中消解40 min，拿出冷卻至室溫后使用Milli-Q水(7146，賽默飛世爾公司，美國)定容至10 mL。使用ICP-MS測量樣品中富集的總砷含量。

1.3.2 脈沖暴露急性毒性實驗

實驗所用大型溞的要求及濃度組的設(shè)置同持續(xù)暴露實驗。實驗前1 h對大型溞進(jìn)行簡單的預(yù)處理，將大型溞放入干凈的SM 7培養(yǎng)基，使其適應(yīng)并排空腸道中的食物。實驗設(shè)計4、8和12 h這3種形式的脈沖暴露，如圖1所示。其中，4 h的脈沖暴露方式中包含了0～4 h、8～12 h、16～20 h、24～28 h、32～36 h和40～44 h的非脈沖暴露階段以及4～8 h、12～16 h、20～24 h、28～32 h、36～40 h和44～48 h的脈沖暴露階段，總共分為12個時間段；8 h的脈沖暴露方式中包含了0～8 h、16～24 h和32～40 h非脈沖暴露階段以及8～16 h、24～32 h和40～48 h脈沖暴露階段，共6個時間段；12 h的脈沖暴露包含了0～12 h、24～36 h非脈沖暴露階段以及12～24 h、36～48 h脈沖暴露階段，共4個時間段。3種不同間隔脈沖暴露中，在非脈沖暴露階段將培養(yǎng)基更換為不含無機(jī)砷的培養(yǎng)液(SM 7培養(yǎng)液)。每隔3 h觀察實驗情況，及時挑出死亡溞放入標(biāo)記好的離心管中。實驗結(jié)束后使用隔膜真空泵抽濾得到實驗大型溞，并使用配制好的PBS緩沖液沖洗大型溞表面殘留的砷溶液。收集好放入離心管中，消解后測樣。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean ± SD)的形式表示，數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計軟件Sigmaplot 10.0進(jìn)行處理(Systat國際軟件公司)。數(shù)據(jù)中顯著性差異分析使用SPSS 25.0軟件中的ANOVA的方法來進(jìn)行(P<0.05時，差異顯著)。

圖1 脈沖暴露方式示意圖Fig. 1 Schematic diagram for pulse exposure mode

2 結(jié)果(Results)

2.1 As(Ⅲ)對大型溞的急性毒性實驗

實驗開始后，每隔3 h記錄大型溞的存活情況，得到0、4、8和12 h脈沖暴露模式下As(Ⅲ)對大型溞的急性毒性，其存活率隨時間的變化如圖2所示。由圖2可知，不論哪種暴露方式，除空白組，所有處理組大型溞的存活率均隨著實驗時間的增加不斷降低；且存活率隨著As(Ⅲ)濃度的增加而降低。以12 h脈沖暴露為例：暴露30 h時，As(Ⅲ)濃度為1.5、4.5和6 mg·L-1時，大型溞存活率分別為95.00%、31.67%和1.67%。以48 h終點死亡率作為毒性指標(biāo)可知，與持續(xù)暴露的方式(即0 h脈沖暴露實驗)相比，脈沖暴露模式一定程度上可以降低As(Ⅲ)對大型溞的毒性。以3 mg·L-1As(Ⅲ)濃度組為例：在實驗終點48 h處，12 h脈沖暴露方式下大型溞的存活率為38.33%，而0 h脈沖暴露實驗中大型溞的存活率只有1.66%。As(Ⅲ)脈沖暴露的時間越長，其對大型溞的毒性減弱作用也越明顯。以As(Ⅲ)最高濃度組7.5 mg·L-1濃度組為例：0 h脈沖暴露方式下，大型溞在12 h全部死亡；8 h脈沖暴露方式下，大型溞16 h時全部死亡；12 h脈沖暴露模式下，大型溞100%死亡時間為24 h。

圖2 4種暴露模式下As(Ⅲ)對大型溞存活率的影響注：(a)、(b)、(c)和(d)分別表示0、4、8和12 h脈沖暴露條件下的實驗。Fig. 2 The effect of As(Ⅲ) on D. magna survival under different exposure patternsNote: (a), (b), (c) and (d) represent experiments under 0, 4, 8 and 12 h pulse exposure conditions.

2.2 As(Ⅴ)對大型溞的急性毒性實驗

與As(Ⅲ)急性毒性實驗相同，實驗開始后每隔3 h記錄大型溞的存活情況，得到0、4、8和12 h脈沖暴露模式下As(Ⅴ)對大型溞的急性毒性，其存活率隨時間的變化如圖3所示。4種脈沖暴露方式下，除空白組外，大型溞的存活率均隨著時間的增加不斷降低；且存活率均隨As(Ⅴ)濃度的增加而降低。當(dāng)實驗進(jìn)行到24 h時，以8 h脈沖暴露為例，As(Ⅴ)濃度分別為1.5、4.5和7.5 mg·L-1時，大型溞存活率分別為100%、90%和50%。通過比較終點存活率可知，與持續(xù)暴露的方式相比，脈沖暴露模式同樣在一定程度上可以減弱As(Ⅴ)對大型溞的毒性。以4.5 mg·L-1As(Ⅴ)濃度組為例：在實驗終點48 h處，12 h脈沖暴露方式下大型溞的存活率為83.33%，而0 h脈沖暴露實驗中大型溞的存活率為8.30%。與持續(xù)暴露的方式相比，As(Ⅴ)脈沖暴露的時間間隔越長，其對大型溞毒性的降低作用也越明顯。以As(Ⅴ)最高濃度組7.5 mg·L-1濃度組為例：4 h脈沖暴露方式下，大型溞在32 h全部死亡；8 h脈沖暴露方式下，大型溞在40 h時全部死亡；但是在12 h脈沖暴露模式下，實驗終點48 h處大型溞仍有8.33%的存活率。

圖3 4種暴露模式下As(Ⅴ)對大型溞存活率的影響注：(a)、(b)、(c)和(d)分別表示0、4、8和12 h脈沖暴露條件下的實驗。Fig. 3 The effect of As(Ⅴ) on D. magna survival under different exposure patternsNote: (a), (b), (c) and (d) represent experiments under 0, 4, 8 and 12 h pulse exposure conditions.

2.3 大型溞中無機(jī)砷富集情況

通過擬合不同暴露方式下2種無機(jī)砷對大型溞48 h的劑量效應(yīng)曲線來進(jìn)一步比較對大型溞的毒性效應(yīng)(圖4)。如圖4(a)所示，在As(Ⅲ)暴露實驗中，0、4和8 h脈沖暴露模式下3條劑量效應(yīng)曲線相隔較近，而12 h脈沖暴露模式下的劑量效應(yīng)曲線則有明顯右移，這說明，相較于持續(xù)暴露，短時間間隔的As(Ⅲ)脈沖暴露(4 h、8 h間隔)并未起到明顯的降低毒性的作用，只有較長時間間隔的As(Ⅲ)脈沖暴露(12 h間隔)才能起到緩解毒性效應(yīng)的作用。與As(Ⅲ)不同，在As(Ⅴ)暴露下，4、8和12 h脈沖暴露模式都會使劑量效應(yīng)曲線產(chǎn)生明顯的右移(圖4(b))，換言之，短時間間隔的脈沖暴露即能降低As(Ⅴ)對大型溞毒性效應(yīng)。

圖4 不同暴露方式下As(Ⅲ) (a)和As(Ⅴ) (b)對大型溞的劑量效應(yīng)曲線注：0 h、4 h、8 h和12 h表示0、4、8和12 h脈沖暴露方式。Fig. 4 The dose-effect curve of As(Ⅲ) (a) and As(Ⅴ) (b) to D. magna under different exposure patternsNote: 0 h, 4 h, 8 h and 12 h means 0, 4, 8 and 12 h pulse exposure patterns.

為了更進(jìn)一步探究不同暴露模式下無機(jī)砷毒性效應(yīng)不同的原因，48 h時分別測定了0 h脈沖暴露與12 h脈沖暴露實驗中大型溞體內(nèi)的砷富集量(圖5)。這2種暴露模式下，大型溞體內(nèi)的無機(jī)砷含量隨無機(jī)砷濃度的升高呈現(xiàn)出增加的趨勢，體內(nèi)富集的砷和溶液中的砷濃度之間的關(guān)系符合朗格繆爾方程，其相關(guān)性系數(shù)(r2)范圍分別為0.9574～0.9983和0.9830～0.9993。持續(xù)暴露條件下，比較2種無機(jī)砷在大型溞體內(nèi)的富集量可知，As(Ⅲ)暴露下的富集量都小于As(Ⅴ)暴露下的富集量，且這種差異隨著濃度增加而增加。持續(xù)暴露實驗中，2種無機(jī)砷的3 mg·L-1處理組，As(Ⅲ)暴露下，大型溞體內(nèi)無機(jī)砷的富集濃度為78.26 μg·g-1dw，As(Ⅴ)暴露下，無機(jī)砷的富集濃度為93.09 μg·g-1dw；無機(jī)砷暴露濃度為6 mg·L-1時，As(Ⅲ)和As(Ⅴ)暴露下，大型溞體內(nèi)無機(jī)砷的富集濃度為79.03 μg·g-1dw和171.91 μg·g-1dw。在12 h脈沖暴露條件下，As(Ⅲ)的富集量與As(Ⅴ)富集量沒有顯著性差異性(P>0.05)。

圖5 無機(jī)砷在大型溞體內(nèi)的生物富集量注：(a) 0 h脈沖暴露(持續(xù)暴露)；(b) 12 h脈沖暴露。Fig. 5 Inorganic arsenic bioaccumulation in D. magnaNote: (a) 0 h pulse exposure (continued exposure); (b) 12 h pulse exposure.

比較不同暴露模式下大型溞體內(nèi)砷富集情況，發(fā)現(xiàn)持續(xù)暴露模式下，會有更多砷富集在大型溞體內(nèi)，推測這也可能是造成持續(xù)暴露較脈沖暴露死亡率高的原因，因此，通過作出不同暴露方式下大型溞存活率隨大型溞體內(nèi)富集砷濃度變化的關(guān)系圖(圖6)來進(jìn)一步分析不同暴露模式對大型溞的毒性差異。0 h脈沖暴露和12 h脈沖暴露下，以大型溞體內(nèi)富集砷為指標(biāo)得出的As(Ⅲ)的半數(shù)致死濃度(LC50)值分別為5.03 μg·g-1dw和1.75 μg·g-1dw，As(Ⅴ)的LC50分別為10.01 μg·g-1dw和2.25 μg·g-1dw。這說明，不同暴露模式下對大型溞的毒性差異并不能單純歸結(jié)于體內(nèi)富集砷濃度的不同，需要進(jìn)一步比較不同暴露模式下大型溞生理生化條件的改變等因素。

圖6 不同暴露方式下大型溞存活率隨體內(nèi)無機(jī)砷濃度變化關(guān)系圖注：(a) As(Ⅲ)；(b) As(Ⅴ)。Fig. 6 Relationship between survival proportion of D. magna and internal inorganic arsenic concentration under different exposure patternsNote: (a) As(Ⅲ); (b) As(Ⅴ).

2.4 不同暴露模式比較

運用4種暴露方式下2種無機(jī)砷對大型溞的48 h-LC50值作出柱狀圖，進(jìn)行更為直觀的比較，如圖7所示。通過對比As(Ⅲ)與As(Ⅴ)對大型溞48 h-LC50值可知，在相同濃度無機(jī)砷暴露下，短時間脈沖暴露所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)要高于長時間脈沖暴露所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。以As(Ⅲ)為例，當(dāng)脈沖暴露時間縮短至0 h時，As(Ⅲ)對大型溞的48 h-LC50值為1.91 mg·L-1，而當(dāng)脈沖暴露的時間為12 h時，As(Ⅲ)對大型溞的48 h-LC50值提高為2.73 mg·L-1，即大型溞對As(Ⅲ)耐受性增強(qiáng)了。As(Ⅴ)的脈沖暴露實驗結(jié)果呈現(xiàn)出同樣的趨勢，12 h脈沖暴露會降低As(Ⅴ)對大型溞的毒性。

圖7 4種暴露方式下2種無機(jī)砷對大型溞的48 h半數(shù)致死濃度(48 h-LC50)注：不同小寫字母表示As(Ⅲ)暴露組別間的顯著性差異，不同大寫字母表示As(Ⅴ)暴露組別間的顯著性差異。Fig. 7 The 48 h half lethal concentration (48 h-LC50) of two inorganic arsenic to D. magna under different exposure patternsNote: Different lowercase letters indicate the significant differences between groups exposed to As(Ⅲ) and different capital letters indicate the significant differences between groups exposed to As(Ⅴ).

3 討論(Discussion)

2種無機(jī)砷相比，As(Ⅴ)對大型溞的毒性小于As(Ⅲ)。Wang等[25]的研究結(jié)果表明，As(Ⅴ)和As(Ⅲ)對大型溞48 h-LC50分別為3.51 mg·L-1和1.91 mg·L-1；李妍麗和柯林[26]的研究結(jié)果表明，As(Ⅲ)對小球藻生長的毒性大于As(Ⅴ)。Chowdhury等[27]的研究結(jié)果表明，As(Ⅲ)對硅藻的毒性作用強(qiáng)于As(Ⅴ)。產(chǎn)生這樣毒性效應(yīng)差異的原因可能與2種無機(jī)砷的致毒機(jī)理相關(guān)。As(Ⅴ)并不直接與酶的活性位點反應(yīng)，而是在生物體內(nèi)還原為As(Ⅲ)后發(fā)揮毒性作用；As(Ⅴ)與As(Ⅲ)都抑制線粒體的能量鏈功能，生物系統(tǒng)吸收As(Ⅲ)速度比As(Ⅴ)快；As(Ⅲ)與蛋白質(zhì)中的巰基有很高的親和力，導(dǎo)致酶失活的速度更快[28-30]。這些可以合理地解釋本研究的結(jié)果。

持續(xù)暴露模式下砷的富集量顯著高于脈沖暴露模式下的，As(Ⅴ)暴露下大型溞對砷的富集程度明顯高于As(Ⅲ)暴露下。Suhendrayatna等[31]將大型溞暴露于2種不同濃度的無機(jī)砷溶液中，As(Ⅴ)暴露下大型溞對砷的富集量高于As(Ⅲ)暴露下。黃飛等[32]研究綠藻胞外聚合物對無機(jī)砷的生物累積時，發(fā)現(xiàn)蛋白小球藻細(xì)胞內(nèi)As(Ⅴ)吸收累積量顯著高于As(Ⅲ)。這與本研究的結(jié)果是一致。這可能由于As(Ⅴ)比As(Ⅲ)更容易通過大型溞消化器官的膜組織并被吸收[31]。持續(xù)暴露模式中大型溞體內(nèi)無機(jī)砷的富集量明顯高于脈沖暴露模式中，推測這也可能是造成持續(xù)暴露較脈沖暴露中大型溞死亡率高的原因。0 h脈沖暴露和12 h脈沖暴露下，以大型溞體內(nèi)富集砷為指標(biāo)，As(Ⅲ)的LC50分別為5.03 μg·g-1dw和1.75 μg·g-1dw，As(Ⅴ)的LC50分別為10.01 μg·g-1dw和2.25 μg·g-1dw。這說明，不同暴露模式下對大型溞的毒性差異并不能單純歸結(jié)于體內(nèi)富集砷濃度的不同，而可能與不同暴露模式下大型溞生理生化條件的改變相關(guān)。而12 h脈沖暴露條件下，As(Ⅲ)暴露下與As(Ⅴ)暴露下大型溞體內(nèi)的無機(jī)砷富集量無顯著差異性，出現(xiàn)這樣現(xiàn)象的原因有待進(jìn)一步研究。在脈沖暴露模式下，大部分吸附位點上，砷的富集符合朗格繆爾模型，這種情況下吸附濃度增長趨勢近似于直線。這可能由于暴露時間的減少減緩了富集平衡過程。

相比于持續(xù)暴露，脈沖暴露模式下，暴露過程中的間隔時間可能為生物提供了生理恢復(fù)的機(jī)會，從而降低有毒物質(zhì)的毒性效應(yīng)。本實驗中，短時間脈沖暴露(4 h、8 h)比長時間脈沖暴露(12 h)毒性效應(yīng)大，這可能是由于短時間脈沖暴露的恢復(fù)時間短，使大型溞體內(nèi)無機(jī)砷累積量超過了毒性閾值，在恢復(fù)期內(nèi)恢復(fù)效應(yīng)更弱。Naddy和Klaine[18]、Hoang等[15]都采用了不同時間間隔的脈沖暴露方式，研究Cu、Zn、Se和毒死蜱對大型溞的慢性毒性，發(fā)現(xiàn)大型溞的死亡率與實驗組濃度和暴露間隔時間有關(guān)。Tsui和Wang[33]研究汞(Hg)對大型溞的毒性時發(fā)現(xiàn)，在外界暴露濃度相同的情況下，脈沖暴露模式下大型溞的死亡率比持續(xù)暴露模式下低，Hg對大型溞的24 h-LC50在脈沖暴露和持續(xù)暴露模式下分別為54.7 μg·L-1提升至25.8 μg·L-1。

當(dāng)毒物累積的濃度超過生物的耐受量時生物體就會受到毒性作用，其作用的強(qiáng)烈程度與毒物的累積濃度有關(guān)。而毒物在生物體內(nèi)的累積又取決于暴露持續(xù)時間和濃度。本研究中大型溞的存活率就相對地取決于脈沖暴露持續(xù)時間和濃度。以As(Ⅴ)暴露實驗為例，在1.5 mg·L-1As(Ⅴ)的4 h脈沖暴露中，48 h時大型溞存活率為80%(圖3(b))，當(dāng)As(Ⅴ)暴露濃度倍增(3 mg·L-1)而脈沖暴露時間減少(0 h脈沖暴露)時，48 h時大型溞存活率為81.67%(圖3(a))。這說明，在As(Ⅴ)的脈沖暴露中，脈沖暴露時間和暴露濃度的作用大體相同。這與Hoang和Klaine[34]對Se脈沖暴露的研究結(jié)果一致。但是，在1.5 mg·L-1As(Ⅴ)的8 h脈沖暴露中，48 h時大型溞存活率為100%(圖3(c))，當(dāng)As(Ⅴ)暴露濃度倍增(3 mg·L-1)而脈沖暴露時間減少(4 h脈沖暴露)時，48 h時大型溞存活率為12.5%(圖3(b))。這一結(jié)果表明，在As(Ⅴ)的暴露實驗中，暴露時間的作用要強(qiáng)于暴露濃度。As(Ⅲ)脈沖暴露實驗與As(Ⅴ)脈沖暴露實驗結(jié)果較為類似。毒物的作用模式可能會影響暴露時間和暴露濃度對毒物毒性貢獻(xiàn)的相對權(quán)重，并且毒物在生物體內(nèi)累積程度所處的階段也會對此產(chǎn)生一定影響。毒物在生物體內(nèi)的累積量是否超過某一關(guān)鍵耐受量很重要，在這一關(guān)鍵耐受量的兩側(cè)，暴露時間和暴露濃度的作用可能不同。

綜上所述,無論是持續(xù)暴露還是脈沖暴露，As(Ⅲ)對大型溞的毒性效應(yīng)高于As(Ⅴ)。脈沖暴露模式下，大型溞死亡率與暴露間隔時間有關(guān)。脈沖間隔時間可能為大型溞提供了生理條件恢復(fù)的機(jī)會，或脈沖暴露中的暴露階段可能對大型溞有馴化作用，使得大型溞對無機(jī)砷產(chǎn)生了耐受性。脈沖暴露時間越短所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)越高。這種脈沖暴露的時間與毒性效應(yīng)之間的關(guān)系以及砷脈沖暴露中的大型溞體內(nèi)酶活性改變及耐受性機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。