背角無齒蚌超氧化物歧化酶基因的克隆及多溴聯(lián)苯醚-47和多溴聯(lián)苯醚-209對其表達的影響

陳佳煒，邵向陽，黃天科，李媛，張龍慧，董艷美，王夢琪，張科，齊金旭，夏西超，邱茂林

平頂山學(xué)院醫(yī)學(xué)院，平頂山 476000

多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)是一類廣泛應(yīng)用于電子設(shè)備、塑料、紡織品和建筑材料中的阻燃劑，已被列入具有生態(tài)風(fēng)險性的持久性有機污染物[1-2]。隨其應(yīng)用不斷增加，PBDEs在環(huán)境中呈現(xiàn)持久性累積和生物體內(nèi)大量蓄積的趨勢，已成為威脅淡水生物的重要有機污染物[3]。PBDEs很難被環(huán)境中微生物所降解，容易在脂肪組織中累積下來，并且隨整個食物鏈出現(xiàn)放大效應(yīng)[3]。PBDEs在生物體中能夠催化活性氧(ROS)生成，干擾線粒體呼吸作用，導(dǎo)致ROS過量生成，三磷酸腺苷(ATP)合成減少，最終導(dǎo)致細胞死亡[3]。在PBDEs家族中，PBDE-47和PBDE-209應(yīng)用較為廣泛，在鰻鱺(Anguillajaponica)、海鱒(Salmotrutta)和貽貝(Mytilusedulis)等多種水生生物中被廣泛檢測到[4]。

超氧化物歧化酶(SOD)是生物機體防御過氧化損傷系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一，將氧自由基快速歧化為普通分子氧和過氧化氫，是一類敏感的分子生態(tài)毒理學(xué)指標(biāo)[5]。按其所含金屬輔基不同，SOD可分為銅/鋅SOD(Cu/ZnSOD)、錳SOD(MnSOD)、鐵SOD(FeSOD)和鎳SOD(NiSOD)[6]。Cu/ZnSOD和MnSOD主要存在于原核生物、甲殼動物、魚類和哺乳動物，其中，Cu/ZnSOD與機體正常生理功能實現(xiàn)和疾病發(fā)生有密切關(guān)系，也是為揭示機體氧化應(yīng)激過程而研究最多的一種酶[7]。Cu/ZnSODmRNA表達和酶活性常被用作環(huán)境污染潛在標(biāo)志物，尤其對重金屬、殺蟲劑和持久性有機污染物等環(huán)境應(yīng)激改變比較敏感[8-9]。

雙殼類是軟體動物一個重要類群，常年棲息在海洋、河流和湖泊底部，以濾食生活為主，是檢測環(huán)境污染的重要生物標(biāo)志物[10-11]。相對于海洋雙殼類動物而言，淡水貝類用于環(huán)境檢測和毒理學(xué)研究的步伐較為滯后。背角無齒蚌是雙殼類軟體動物主要成員之一，在多氯酚、重金屬和多氟烷基化合物等檢測中發(fā)揮積極作用，常作為淡水污染的指示性生物[12-13]。為了更好揭示PBDEs環(huán)境毒性，保護淡水資源和淡水生物，本研究以背角無齒蚌(Anodontawoodiana)為研究對象，克隆出AwSOD全基因序列，分析PBDE-47和PBDE-209對AwSOD時空表達的影響，為揭示PBDEs毒理效應(yīng)提供理論參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

背角無齒蚌購自南陽市水產(chǎn)市場，PBDE-47、PBDE-209和二甲亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)購自Sigma-Aldrich公司，PBDE-47和PBDE-209溶解于DMSO中以制備儲備液。TRIzol試劑、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、菌株DH5α、克隆載體pMDl9-T、連接酶、PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒和RACE試劑盒均購自TaKaRa公司，其余常規(guī)藥品均為進口或國產(chǎn)分析純。

背角無齒蚌殼長(6.5±0.5) cm，PBDE-47和PBDE-209染毒之前，動物置于實驗室自動水循環(huán)系統(tǒng)中適應(yīng)養(yǎng)殖2周，期間停止進食。隨后，動物處理實驗在長方形的塑料盒(40 cm×25 cm；10 cm高)中進行，每個盒子里面8只河蚌，飼養(yǎng)采用人工模擬池塘水(每1 L去離子水中含48 mg NaHCO3、33 mg CaCl2·2H2O、60 mg MgSO4·7H2O和0.5 mg KCl)，喂食小球藻(Chlorellavulgaris)。為了確定AwSOD基因的組織分布，對來自同一塑料盒內(nèi)5只動物進行解剖，取斧足、鰓、肝胰臟、閉殼肌、心臟、血淋巴和外套膜等組織。參考PBDE-47和PBDE-209對淡水生物水蚤毒性效應(yīng)研究結(jié)果[14]，動物處理實驗過程中，動物分為對照組、PBDE-47處理組(6.25、12.5、25、50和100 μg·L-1)和PBDE-209處理組(10、20、40、80和160 μg·L-1)，對照組用同體積DMSO處理，水中DMSO濃度不超過3‰[12]。分別在0、6、12、24和48 h每組中取出5只河蚌，解剖肝胰臟、鰓和血淋巴，液氮速凍，于-80 °C保存。

1.2 總RNA提取與cDNA模板制備

按照試劑盒說明書的要求，使用TRIzol法(Takara，大連)提取總RNA。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。用M-MLV第一鏈cDNA合成試劑盒(Takara，大連)合成第一鏈cDNA，作為PCR擴增反應(yīng)的模板。

1.3 AwSOD全基因序列的克隆

根據(jù)雙殼綱、腹足綱、昆蟲綱、甲殼綱和脊椎動物在內(nèi)其他物種的Cu/ZnSOD保守區(qū)域設(shè)計簡并引物SOD1和SOD2，用于擴增AwSODcDNA片段，將PCR產(chǎn)物克隆到pMDT-19(Takara，大連)、采用雙向測序，鑒定為Cu/ZnSOD部分序列。以部分cDNA序列中設(shè)計特異引物(表1)，根據(jù)RACE試劑盒說明書，采用巢式PCR方法擴增AwSODcDNA的5’和3’區(qū)域。擴增產(chǎn)物克隆載體、雙向測序、序列比對和拼接。

1.4 序列與系統(tǒng)發(fā)育的分析

在GenBank數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中用BLAST方法對AwSOD序列進行了比對和分析；采用DANMEN軟件對AwSOD基因進行多序列比對；采用信號肽預(yù)測數(shù)據(jù)庫(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)對AwSOD信號肽序列進行預(yù)測；采用SMART數(shù)據(jù)庫(http://smart.embl-heidelberg.de/)對AwSOD蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測；采用SWISS模型(http://swissmodel.expasy.org/)對AwSOD的三維結(jié)構(gòu)進行預(yù)測；用MEGA 5.0鄰位連接方法，構(gòu)建AwSOD系統(tǒng)進化樹。

1.5 real-time PCR定量檢測 AwSOD的表達

為了確定AwSOD轉(zhuǎn)錄水平，采用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒并按照說明書的要求進行定量分析。根據(jù)已有貝類內(nèi)參基因研究結(jié)果[15-16]，選取β-actin作為內(nèi)參基因，根據(jù)內(nèi)參基因和AwSOD特異引物分別分離對應(yīng)序列(表1)，瓊脂糖凝膠電泳僅檢測出一個擴增條帶，PCR產(chǎn)物回收、測序和鑒別；結(jié)合溶解曲線和擴增曲線結(jié)果確定內(nèi)參基因和目的基因表達的特異性和高效性。使用ABI7500實時檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems，美國)，采用兩步法，進行real-time PCR，構(gòu)建標(biāo)準曲線，通過2-△△CT分析AwSOD表達水平。

表1 本研究中使用的引物的描述Table 1 Description of the primes used in this study

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

PBDE-47和PBDE-209處理后AwSOD的表達水平的顯著性差異采用單向方差分析(analysis of variance, ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果(Results)

2.1 背角無齒蚌 AwSOD分子結(jié)構(gòu)

背角無齒蚌AwSODcDNA全長由949個核苷酸組成(GenBank No., KU363382)，包含一個83 bp的5’非翻譯區(qū)(UTR)、401 bp的3’UTR。開放閱讀框由465 bp核苷酸組成，編碼155個氨基酸的多肽鏈，分子量為15.78 kDa，理論等電點為30.22(圖1)。終止信號(AATAAA)位于3’UTR的891～896處。AwSOD與其他的細胞質(zhì)Cu/ZnSOD序列比對表明，AwSOD包含Cys-7、Cys-57和Cys-146這3個半胱氨酸，其中Cys-57和Cys-146在所有Cu/ZnSOD中都是保守的，證實與分子內(nèi)二硫鍵的形成有關(guān)(圖2)。在AwSOD中，銅結(jié)合保守氨基酸殘基分別為His-46、His-48、His-64和His-120，鋅結(jié)合保守氨基酸殘基分別為His-64、His-72和His-81及Asp-8。AwSOD氨基酸序列中存在2個高度保守Cu/ZnSOD標(biāo)簽序列，分別為GKHGFHVHEFGDNT和GNAGARSACGVI(圖2)。

圖1 背角無齒蚌 AwSOD基因的cDNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列注：粗體標(biāo)示起始(ATG)和終止(TAA)密碼；波浪線標(biāo)示終止信號“AATAAA”；下劃線標(biāo)示 AwSOD標(biāo)簽序列；灰色陰影標(biāo)示Cu和Zn結(jié)合保守位點；方框標(biāo)示半胱氨酸殘基(Cys-57 and Cys-146)。Fig. 1 The cDNA nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of AwSOD gene of Anodonta woodianaNote: The start codon (ATG) and stop codon (TAA) are indicated in bold; putative polyadenylation signal “AATAAA” is showed with wavy line; the signal sequences of AwSOD are underlined; the binding residues of Cu and Zn are marked with shadow; two cysteines (Cys-57 and Cys-146) formed a disulphide bond are marked with boxs.

圖2 背角無齒蚌AwSOD與其他物種SOD序列多重比對注：紅色邊框標(biāo)示CuZnSOD標(biāo)簽序列；陰影標(biāo)示Cu(His-46, His-48, His-64和His-120)和Zn(His-64, His-72, His-81和Asp-84)結(jié)合保守位點；下劃線標(biāo)示半胱氨酸殘基(Cys-57和Cys-146)。Fig. 2 Multiple alignment of AwSOD of Anodonta woodiana with other species SODsNote: Two signature motifs sequences of CuZnSOD are marked as red box; the amino acids required for Cu (His-46, His-48, His-64, and His-120) and Zn (His-64, His-72 and His-81 and Asp-84) binding are shaded; two cysteines (Cys-57 and Cys-146) formed a disulphide bond are showed with double lines.

AwSOD二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)與Cu/ZnSOD具有較高的相似性，二級結(jié)構(gòu)包含9個β-折疊和2個α-螺旋，其中有Cys-57和Cys-146形成二硫鍵(圖3)。

圖3 背角無齒蚌AwSOD二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測注：(a) AwSOD二級結(jié)構(gòu)；(b) AwSOD的三級結(jié)構(gòu)。Fig. 3 Predicted secondary and tertiary structures of AwSOD deduced amino acids of Anodonta woodianaNote: (a) the secondary structure of AwSOD; (b) the tertiary structure of AwSOD.

2.2 AwSOD系統(tǒng)發(fā)育分析

BLAST分析表明，AwSOD氨基酸序列與Cu/ZnSOD具有較高的同源性，與褶紋冠蚌的同源性為97.42%，與海兔的同源性為61.39%，與斑馬魚的同源性為64.10%，與人的同源性為62.18%。為了研究AwSOD與其他物種Cu/ZnSOD之間親緣關(guān)系，采用MEGA 5.0近鄰連接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，分別從不同脊椎動物和無脊椎動物中選出了多個Cu/ZnSOD序列，其中包括人、家鼠、非洲爪蟾、斑馬魚、凡納濱對蝦、果蠅、光滑雙臍螺和牡蠣等。AwSOD與淡水貝類親緣關(guān)系最近，其次海洋雙殼類，最后是脊椎動物、腹足類和甲殼類(圖4)。

圖4 根據(jù)背角無齒蚌AwSOD氨基酸序列使用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig. 4 Phylogenetic relationship of AwSOD amino acid sequence between Anodonta woodiana and other organisms according to neighbor-joining method

2.3 AwSOD的組織分布

Real-time PCR結(jié)果顯示，背角無齒蚌AwSOD在斧足、鰓、肝胰臟、閉殼肌、外套膜和心臟殼中廣泛表達(圖5)。AwSOD在肝胰臟中的mRNA表達水平較高，在鰓和斧足為中等水平，在外套膜、閉殼肌和心臟中表達水平較低(圖5)。

圖5 背角無齒蚌不同組織中 AwSOD基因的表達(n=5)Fig. 5 Real-time PCR analysis of AwSOD transcript from different tissues of Anodonta woodiana (n=5)

2.4 PBDE-47和PBDE-209對肝胰腺 AwSOD表達的影響

在濃度6.25、12.5、25、50和100 μg·L-1的PBDE-47處理組中，肝胰腺中AwSODmRNA水平顯著增加，這種上調(diào)效應(yīng)在濃度6.25、12.5和25 μg·L-1PBDE-47處理組呈現(xiàn)時間和劑量依賴模式；與對照組相比，整個實驗過程中，AwSODmRNA水平在6.25、12.5和25 μg·L-1PBDE-47處理組中分別增加了70.58%(P<0.05)、2.10倍(P<0.01)和2.61倍(P<0.01)以上(圖6)。12.5 μg·L-1和25 μg·L-1的PBDE-47處理組中AwSODmRNA水平分別增加了3.57倍(P<0.01)和2.56倍(P<0.01)(圖6)。

圖6 PBDE-47對背角無齒蚌肝胰腺 AwSOD基因表達的影響注：每處理組的每個時間點n=5；*、**表示與相應(yīng)對照組相比有顯著差異( P<0.05、 P<0.01)；下同。Fig. 6 Temporal expression of AwSOD in the hepatopancreas of Anodonta woodiana after PBDE-47 challenge as measured by quantitative real-time PCRNote: Data are expressed as means±SE; n=5 in each group at each time point; *, **represent P<0.05, P<0.01, compared with control group at the same time.

與對照組相比，PBDE-209處理后肝胰腺中AwSODmRNA水平隨時間和劑量呈現(xiàn)增加趨勢。在10、20、40、80和160 μg·L-1的處理組中，AwSOD表達水平分別增加了1.03%、77.08%(P<0.05)、91.66% (P<0.05)、1.33倍(P<0.05)和2.60倍(P<0.01) (圖7)。

圖7 PBDE-209對背角無齒蚌肝胰腺 AwSOD基因表達的影響Fig. 7 Temporal expression of AwSOD in the hepatopancreas of Anodonta woodiana after PBDE-209 challenge as measured by quantitative real-time PCR

2.5 PBDE-47和PBDE-209對鰓 AwSOD表達的影響

在濃度6.25 μg·L-1和12.5 μg·L-1的PBDE-47處理組中，鰓中AwSODmRNA水平顯著增加；與對照組相比，整個實驗過程中AwSODmRNA水平在6.25 μg·L-1和12.5 μg·L-1的PBDE-47處理組中分別增加了1.23倍(P<0.05)和1.64倍(P<0.05)以上(圖8)。25 μg·L-1的PBDE-47處理組中，鰓中AwSODmRNA水平在24 h和48 h降至正常水平。25、50和100 μg·L-1的PBDE-47處理組中，鰓中AwSODmRNA水平在24 h和48 h低于正常水平，分別減少了46.96%和72.61%(P<0.05) (圖8)。

圖8 PBDE-47對背角無齒蚌鰓 AwSOD基因表達的影響Fig. 8 Temporal expression of AwSOD in the gill of Anodonta woodiana after PBDE-47 challenge as measured by quantitative real-time PCR

與對照組相比，PBDE-209處理組鰓中AwSODmRNA水平顯著增加。在10、20、40、80和160 μg·L-1的處理組中，AwSOD表達水平分別增加了68.68%(P<0.05)、86.87%(P<0.05)、1.28倍(P<0.05)、1.54倍(P<0.01)和1.75倍(P<0.01)(圖9)。

圖9 PBDE-209對背角無齒蚌鰓 AwSOD基因表達的影響Fig. 9 Temporal expression of AwSOD in the gill of Anodonta woodiana after PBDE-209 challenge as measured by quantitative real-time PCR

3 討論(Discussion)

本研究結(jié)果顯示，AwSOD中未發(fā)現(xiàn)信號肽序列，提示AwSOD屬于胞質(zhì)Cu/ZnSOD家族成員，已經(jīng)過加工并具備了成熟模式。AwSOD氨基酸序列與其他Cu/ZnSODs序列多重比對表明，2個半胱氨酸殘基Cys-57和Cys-146與CuZnSODs氨基酸殘基具有高度保守性，可能與二級結(jié)構(gòu)中二硫鍵的形成有關(guān)[17-18]。在AwSOD和其他Cu/ZnSODs序列中，Cu和Zn結(jié)合氨基酸殘基相對比較保守，這些保守的氨基酸有助于AwSOD結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和催化的作用[19]。同時，在相對惡劣環(huán)境條件下，這些氨基酸殘基對穩(wěn)定Cu/ZnSODs構(gòu)象具有潛在作用，有助于Cu和Zn穩(wěn)定Cu/ZnSOD三級結(jié)構(gòu)[20]。

AwSOD在不同組織中呈現(xiàn)不同的表達模式，其中，在肝胰腺組織中AwSODmRNA的表達水平最高，這與肝胰臟作為主要代謝組織和主要防御器官有關(guān)。相同的現(xiàn)象在南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)和擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)中也被發(fā)現(xiàn)[21-22]。相當(dāng)于哺乳動物的肝臟和昆蟲的脂肪體而言，水生無脊椎動物肝胰腺具有肝臟和胰腺雙重功能，不僅是重要的消化器官，而且在非特異性免疫中發(fā)揮著重要的作用[21-22]。肝胰腺具有較高的代謝活性，水體中污染物進入機體后通過代謝過程會產(chǎn)生大量的ROS。AwSOD基因高表達提示其可作為一種重要的肝臟解毒酶。其他組織中AwSOD的廣泛分布有助于將氧自由基快速轉(zhuǎn)化為普通分子氧(O2)和過氧化氫(H2O2)。

研究發(fā)現(xiàn)，PBDE-47和PBDE-209處理后背角無齒蚌肝胰腺和鰓AwSOD表達水平顯著升高，提示這可能與增強機體ROS清除能力和提高脅迫耐受性有關(guān)。伴隨PBDE-47和PBDE-209在機體中的不斷累積，細胞中ROS生成增加，誘發(fā)細胞氧化應(yīng)激，線粒體出現(xiàn)呼吸爆發(fā)，細胞出現(xiàn)功能性受損。在脅迫條件下，生物本身SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶和硫過氧化物酶表達水平提升，以提高機體清除ROS能力，維持機體穩(wěn)態(tài)。長時間Cd暴露后，非洲爪蟾(Xenopuslaevis)和青鳉(Oryziasjavanicus)Cu/ZnSODmRNA表達水平顯著上調(diào)[23]。白斑桿狀病毒染毒后，日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)鰓和血淋巴中Cu/ZnSOD表達水平顯著升高[24]。乳球菌處理后，羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)血淋巴中Cu/ZnSOD表達水平顯著增加[25]。馬拉硫磷、硫丹和二者混合物處理后，南美白對蝦(L.vannamei)血淋巴中Cu/ZnSOD表達水平顯著增加[26]。Cd2+脅迫后，褶紋冠蚌(Cristariaplicata)Cu/ZnSOD基因mRNA水平和酶活性迅速升高，并在72 h和48 h達到峰值，提示Cu/ZnSOD是用于監(jiān)測早期水體重金屬污染的重要靶分子[27]。由此可見，Cu/ZnSOD在維持機體氧自由基代謝平衡、免受氧化損傷、ROS清除和機體保護性防御中起著重要作用。PBDE-47和PBDE-209處理后背角無齒蚌肝胰腺和鰓AwSOD表達水平顯著升高與增強機體抗氧化能力和耐受性有關(guān)。

與對照組相比，不同濃度PBDE-47暴露后，肝胰腺中AwSOD在高劑量組出現(xiàn)先升高后降低的現(xiàn)象，而在鰓中，AwSOD表達水平在6 h顯著上調(diào)，后期出現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象，提示這種表達模式與PBDE-47毒性效應(yīng)和劑量效應(yīng)有關(guān)。正常情況下，動物體內(nèi)ROS保持相對較低的水平，ROS生成后將迅速被一系列抗氧化酶迅速清除，以維持ROS水平與抗氧化酶活性之間的平衡[28-29]。抗氧化酶是機體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要標(biāo)志之一。鰓作為貝類重要免疫器官，鰓絲直接接觸PBDE-47和PBDE-209，并通過鰓絲呼吸作用迅速進入機體，產(chǎn)生大量ROS，相對于肝胰腺而言，PBDE-47對鰓氧化應(yīng)激效應(yīng)更為直接和明顯。持續(xù)高劑量長時間的PBDE-47暴露，導(dǎo)致進入體內(nèi)PBDE-47超過鰓的解毒極限，則鰓會受到損傷，大量鰓組織中細胞凋亡，處理后期出現(xiàn)表達水平下調(diào)現(xiàn)象[30]。相同現(xiàn)象在褶紋冠蚌中也被發(fā)現(xiàn)，Pb2+脅迫后，褶紋冠蚌Cu/ZnSODmRNA的表達先升高后降低，在48 h達到最大值[27]。在PBDE-209處理組中，AwSOD的表達呈時間和劑量依賴性，與所選擇的濃度未達到臨界值，動物在這種濃度可以產(chǎn)生足夠的抗氧化能力，從而保持機體PBDE-209氧化和抗氧化酶還原作用之間的平衡；實驗中選定濃度未檢測到PBDE-209半數(shù)致死濃度進一步證實了這一現(xiàn)象。

研究顯示，地表水中PBDE-47含量為0.25 ng·L-1，PBDE-209含量為1.0 ng·L-1[31]。軟體動物調(diào)查結(jié)果顯示，PBDE-47、PBDE-99、PBDE-154和PBDE-153含量為0.39～3.65 ng·g-1，PBDE-209作為主要持久性有機污染物含量為10.2～284 ng·g-1[32]。PBDE-47和PBDE-209對淡水資源的負面效應(yīng)和水生生物的累積效應(yīng)已成為不可忽視的問題。PBDE-47和PBDE-209對背角無齒蚌機體氧化應(yīng)激作用是一個綜合的效應(yīng)，其產(chǎn)生氧化應(yīng)激后抗氧化系統(tǒng)啟動，涉及多種抗氧化酶的參與。從AwSOD組織特異性表達及PBDE-47和PBDE-209對其表達的誘導(dǎo)作用，背角無齒蚌是用于淡水污染監(jiān)測的重要生物之一。