• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    臭氧暴露誘發(fā)小鼠急性肺部損傷及抗氧化劑的拮抗作用

    2020-04-08 02:22:08鄭子龍陳雨珊楊旭曾燕李金泉
    生態(tài)毒理學(xué)報(bào) 2020年6期
    關(guān)鍵詞:氧化應(yīng)激小鼠

    鄭子龍,陳雨珊,楊旭,2,曾燕,李金泉,*

    1. 武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院,腦科學(xué)先進(jìn)技術(shù)研究院,武漢 430081 2. 華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,武漢 430079

    在工業(yè)化、城市化和全球變暖三重壓力下,我國(guó)城市臭氧(ozone, O3)的污染風(fēng)險(xiǎn)不斷提高。城市臭氧污染主要是指城市近地面臭氧,是由氮氧化物和揮發(fā)性有機(jī)物等臭氧前體物質(zhì),在強(qiáng)烈的陽光紫外線照射下,發(fā)生光化學(xué)反應(yīng),生成主要成分為臭氧的光化學(xué)煙霧。近年來,隨著我國(guó)“大氣十條”方案的逐步落實(shí),空氣質(zhì)量改善顯著,PM2.5濃度下降明顯,但是臭氧污染的勢(shì)頭卻持續(xù)上升,導(dǎo)致在我國(guó)許多地區(qū)臭氧已超越PM2.5成為夏秋季各地空氣首要污染物[1-4]。我國(guó)生態(tài)環(huán)境部2019年空氣質(zhì)量數(shù)據(jù)顯示,全國(guó)337個(gè)地級(jí)及以上城市臭氧平均濃度同比上升6.5%,高達(dá)148 μg·m-3,接近我國(guó)空氣質(zhì)量臭氧污染紅線160 μg·m-3。作為一種強(qiáng)氧化劑,臭氧幾乎可與任何生物組織反應(yīng)并引起不利健康的影響。臭氧暴露會(huì)引起氣道炎癥、導(dǎo)致氣道狹窄、支氣管反應(yīng)性增加和肺功能下降[5]。此外,暴露于臭氧與患有阻塞性肺疾病(例如哮喘和慢性阻塞性肺疾病)的患者癥狀惡化、呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和死亡率增加緊密相關(guān)[6-7]。Francis等[8]研究發(fā)現(xiàn),暴露于臭氧后,趨化因子受體2(CCR2)在肺中的促炎和抗炎巨噬細(xì)胞積累中均起作用。Li等[9]研究發(fā)現(xiàn),線粒體活性氧(mtROS)和NLRP3炎性體均在臭氧誘導(dǎo)的肺部炎癥中起作用。然而,雖然臭氧污染帶來的健康風(fēng)險(xiǎn)已受到普遍關(guān)注,但相關(guān)防治策略及其生物學(xué)機(jī)制仍不清楚,亟待深入研究。

    核因子E2相關(guān)因子2 (Nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)是氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子,在編碼抗氧化劑和/或排毒酶和相關(guān)壓力響應(yīng)蛋白的基因的啟動(dòng)子區(qū)域中起重要作用[10-11]。Nrf2可調(diào)節(jié)血紅素加氧酶1(HO-1)、NADPH:醌氧化還原酶1(NQO-1)和γ-谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCL)等抗氧化酶,以減輕炎癥損害并中和炎性損傷引起的細(xì)胞/組織的活性氧(ROS)[12]。氧化/抗氧化失衡被認(rèn)為在肺部炎癥損傷中起到重要作用。激活以Nrf2為代表的抗氧化酶系統(tǒng)能夠減輕氧化應(yīng)激引起的肺損傷,但其在抑制臭氧吸入毒性從而減輕肺部炎癥中的作用仍有待研究。褪黑素(melatonin, MT)是一種松果體激素,有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫和調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律等多種生理功能[13],可抑制體內(nèi)氧化應(yīng)激[14-15],保護(hù)細(xì)胞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA免受氧化損傷[16]。因此,本研究通過構(gòu)建小鼠臭氧急性暴露模型,觀察臭氧暴露對(duì)肺組織氧化應(yīng)激和炎癥損傷的相關(guān)指標(biāo),通過抗氧化劑MT的處理,探究MT是否通過激活Nrf2及其下游抗氧化酶拮抗臭氧誘發(fā)小鼠急性肺部損傷,以期驗(yàn)證臭氧暴露誘導(dǎo)的肺部損傷機(jī)制。

    1 材料與方法(Materials and methods)

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    SPF級(jí)雄性Balb/c小鼠,購(gòu)買于湖北省疾病預(yù)防控制中心(國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),6~8周齡,體重(22±2) g,飼養(yǎng)于華中師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,12 h晝夜循環(huán)光照,溫度保持在22~24 ℃,濕度為40%~60%,小鼠飲食飲水充足供應(yīng)。臭氧暴露前,小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

    1.2 主要儀器

    KTB便攜式臭氧發(fā)生器(廣州創(chuàng)環(huán)臭氧電器設(shè)備有限公司),KP836便攜式臭氧檢測(cè)儀(江蘇羽翼科技有限公司)、DW-HL100型-80 ℃超低溫冰箱(中科美菱有限公司,中國(guó))、5415R低溫冷凍離心機(jī)(艾本德有限公司,德國(guó))、DNM-9602全長(zhǎng)酶標(biāo)儀(北京普朗新技術(shù)有限公司,中國(guó))、Dancer/MS3渦旋儀(艾卡儀器設(shè)備有限公司,德國(guó))、移液器(艾本德有限公司,德國(guó))、CFX96 Real-time PCR儀(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司,美國(guó))。

    1.3 主要試劑和檢測(cè)試劑盒

    褪黑素(Sigma公司,美國(guó))、小鼠IL-1β(貨號(hào):88-7013-22,靈敏度:8 pg·mL-1)、IL-33(貨號(hào):88-7333-22,靈敏度:25 pg·mL-1)、IL-4(貨號(hào):88-7044-22,靈敏度:4 pg·mL-1)、IL-17A(貨號(hào):88-7371-22,靈敏度:4 pg·mL-1)酶聯(lián)免疫試劑盒(eBioscience公司,美國(guó)),小鼠微量GSH試劑盒(南京建成生物工程研究所,中國(guó)),BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(生工生物工程股份有限公司,中國(guó)),戊巴比妥鈉(Sigma公司,美國(guó)),硫代巴比妥酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司,中國(guó)),蘇木精和伊紅(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司,中國(guó)),多聚甲醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司,中國(guó)),熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室,美國(guó)),Nrf2、HO-1和NQO-1引物(生工生物工程股份有限公司,中國(guó))。

    1.4 實(shí)驗(yàn)分組和染毒方案

    將24只Balb/c小鼠隨機(jī)分為4組,每組6只,分別為:(1)生理鹽水對(duì)照組(Control);(2)褪黑素對(duì)照組(MT);(3)臭氧暴露組(2.14 mg·m-3O3);(4)臭氧暴露+褪黑素保護(hù)組(2.14 mg·m-3O3+MT)。連續(xù)進(jìn)行7 d,每天上午8:00到11:00對(duì)臭氧暴露組與臭氧暴露+褪黑素保護(hù)組小鼠進(jìn)行2.14 mg·m-3的臭氧暴露,臭氧由便攜式臭氧發(fā)生器產(chǎn)生,根據(jù)便攜式臭氧檢測(cè)儀調(diào)節(jié)進(jìn)氣流量;對(duì)照組小鼠暴露于潔凈空氣。臭氧暴露后對(duì)MT組和2.14 mg·m-3O3+MT組小鼠按5 mg·kg-1濃度口服MT保護(hù)劑,連續(xù)進(jìn)行7 d。臭氧暴露濃度2.14 mg·m-3是參考已發(fā)表以及本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果制定的[17-19]。

    1.5 小鼠肺泡灌洗液的提取

    滅菌手術(shù)剪剝離小鼠頸部氣管至清晰暴露,氣管上段橫切剪一個(gè)0.1 cm左右小口,將氣管插管插入到小鼠氣管中固定,按壓小鼠肺部以排除其肺部空氣。分別注入1、0.8和0.8 mL生理鹽水至氣管插管中,輕輕揉壓小鼠肺部,使生理鹽水充分接觸肺部后緩慢回收3次肺泡灌洗液(BALF)保存。

    1.6 肺組織勻漿制備

    用預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗取出的小鼠肺組織,用吸水紙吸干后稱重,放入滅菌的2 mL玻璃勻漿器(上海信裕生物科技有限公司,中國(guó))中,加入預(yù)冷的PBS制備成10%的肺組織勻漿液,8 000 ×g、4 ℃離心10 min,取上清分裝后置于低溫環(huán)境保存。

    1.7 小鼠肺組織病理切片

    取部分肺組織,用4%多聚甲醛固定48 h,脫水后進(jìn)行石蠟切片(5 μm)與蘇木精-伊紅染色(H&E stain),于DM4000B光學(xué)顯微鏡(徠卡微系統(tǒng)有限公司,德國(guó))下觀察肺組織切片染色結(jié)果,并拍照分析。

    1.8 各項(xiàng)生物學(xué)指標(biāo)的測(cè)定

    小鼠肺泡灌洗液細(xì)胞因子包括IL-1β、IL-33、IL-4和IL-17A的測(cè)定,均采用商用酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒進(jìn)行測(cè)定,按照ELISA試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

    還原型谷胱甘肽(GSH)含量測(cè)定:2-硝基苯甲酸(DTNB)可以在黑暗的條件下與GSH反應(yīng)形成黃色化合物1,3,5-三硝基苯(TNB),在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值,同時(shí)采用GSH標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,使用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算GSH的含量。使用改良的BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品蛋白質(zhì)濃度。

    硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定丙二醛(MDA)含量:MDA可與TBA縮合,形成紅色產(chǎn)物,在532 nm處有最大吸收峰。取200 μL肺組織勻漿液,加入800 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%的TBA溶液,沸水浴15 min后,8 000 ×g、4 ℃下離心10 min,取上清液200 μL于酶標(biāo)板,分別在450、532和600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,按照公式CMDA=(6.45(OD532 nm-OD600 nm)-0.56OD450 nm)/Cprotein,計(jì)算出MDA含量(μmol·g-1protein)。樣品蛋白質(zhì)濃度使用改良的BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定。

    目的基因mRNA表達(dá)測(cè)定:Trizol法提取總mRNA,對(duì)mRNA含量及純度進(jìn)行測(cè)定。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明建立反應(yīng)體系反轉(zhuǎn)錄成cDNA,根據(jù)目的基因引物進(jìn)行RT-qPCR測(cè)定,最后采用2-△△CT法分析目的基因表達(dá)情況。引物序列如表1所示。

    表1 RT-qPCR測(cè)試的引物序列Table 1 Primer sequence for RT-qPCR

    1.9 統(tǒng)計(jì)分析

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,利用Graph Pad8.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及繪圖,組間各指標(biāo)比較均采用單因素方差分析,隨后進(jìn)行Holm-Sidak多重比較檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果(Results)

    2.1 小鼠肺組織病理學(xué)改變

    如圖1所示,與對(duì)照組相比,2.14 mg·m-3O3組小鼠氣道發(fā)生了明顯的重塑現(xiàn)象,包括氣道壁增厚,氣道腔變得狹窄,并且炎細(xì)胞浸潤(rùn)顯著性增加;與2.14 mg·m-3O3組相比,2.14 mg·m-3O3+MT組小鼠炎細(xì)胞浸潤(rùn)和氣道重塑現(xiàn)象均顯著減輕。

    圖1 不同處理組小鼠肺組織蘇木精-伊紅染色圖注:MT表示褪黑素;(a)對(duì)照組(生理鹽水組),(b) MT(5 mg·kg-1)處理組,(c) 2.14 mg·m-3 O3處理組,(d) 2.14 mg·m-3 O3+MT(5 mg·kg-1)處理組。Fig. 1 H&E stain of lung section of mice in different treatment groupsNote: MT stands for melatonin; (a) control group (saline group), (b) MT (5 mg·kg-1) treatment group, (c) 2.14 mg·m-3 O3 treatment group, (d) 2.14 mg·m-3 O3+MT (5 mg·kg-1) treatment group.

    2.2 小鼠肺組織細(xì)胞因子含量的變化

    如圖2所示,與對(duì)照組相比,MT處理組并沒有引起小鼠肺組織中IL-1β、IL-33、IL-4和IL-17A的含量發(fā)生顯著性改變;2.14 mg·m-3O3組的IL-1β、IL-33、IL-4和IL-17A的含量增高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與2.14 mg·m-3O3組相比,2.14 mg·m-3O3+MT組小鼠肺組織IL-1β、IL-33、IL-4和IL-17A含量均降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

    圖2 小鼠肺泡灌洗液細(xì)胞因子含量注:**表示P<0.01,與生理鹽水組相比;##表示P<0.01,與2.14 mg·m-3 O3組相比。Fig. 2 Cytokine concentration in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of miceNote: **represents P<0.01, compared with the control group; ## represents P<0.01, compared with the 2.14 mg·m-3 O3 group.

    2.3 小鼠肺組織GSH和MDA含量的變化

    如圖3所示,與對(duì)照組相比,2.14 mg·m-3O3組的GSH含量降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);MDA含量顯著性升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);MT組GSH和MDA含量無明顯改變。與2.14 mg·m-3O3組相比,2.14 mg·m-3O3+MT組肺組織GSH含量上升,MDA含量下降,且均具有顯著性差異(P<0.01)。

    圖3 小鼠肺組織谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量注:*表示P<0.05,**表示P<0.01,與對(duì)照組相比;##表示P<0.01,與2.14 mg·m-3 O3組相比。Fig. 3 The content of glutathione (GSH) and malondialdehyde (MDA) in mice lungNote: *represents P<0.05, **represents P<0.01, compared with the control group; ## represents P<0.01, compared with the 2.14 mg·m-3 O3 group.

    2.4 Nrf2、HO-1和NQO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化

    如圖4所示,與對(duì)照組相比,2.14 mg·m-3O3組小鼠肺部Nrf2、HO-1和NQO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量降低,且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。MT單獨(dú)作用并不會(huì)造成肺組織中Nrf2、HO-1和NQO-1表達(dá)量發(fā)生改變;與2.14 mg·m-3O3組相比,2.14 mg·m-3O3+MT組的小鼠肺組織Nrf2、NQO-1和HO-1的表達(dá)量都發(fā)生上調(diào),且均具有顯著性差異(P<0.01或P<0.05)。

    圖4 Nrf2與抗氧化基因NQO-1和HO-1的表達(dá)注:Nrf2代表核因子-E2相關(guān)因子2基因,HO-1代表血紅素加氧酶1基因,NQO-1代表NADPH:醌氧化還原酶1基因;**表示P<0.01,與生理鹽水組相比,#表示P<0.05、##表示P<0.01,與2.14 mg·m-3 O3組相比。Fig. 4 Expression of Nrf2 and antioxidant genes NQO-1 and HO-1Note: Nrf2 stands for nuclear factor E2-related factor 2; HO-1 stands for heme oxygenase 1 gene; NQO-1 stands for NADPH:quinone redox enzyme 1 gene; **represents P<0.01, compared with the control group; # represents P<0.05, ## represents P<0.01, compared with the 2.14 mg·m-3 O3 group.

    3 討論(Discussion)

    本研究使用Balb/c小鼠,通過構(gòu)建臭氧急性暴露小鼠模型,探究抗氧化劑對(duì)臭氧誘發(fā)肺組織損傷的拮抗作用。研究結(jié)果表明,臭氧暴露后模型小鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)加劇,氣道重塑,IL-1β、IL-33、IL-4和IL-17A等多種細(xì)胞因子的表達(dá)升高,同時(shí),抗氧化元件Nrf2及其下游抗氧化酶mRNA表達(dá)下調(diào),出現(xiàn)更為嚴(yán)重的肺組織氧化損傷。更為重要的是,通過抗氧化劑MT的使用,模型小鼠肺組織氧化應(yīng)激水平顯著降低。同時(shí),拮抗了臭氧暴露對(duì)小鼠肺組織造成的炎癥損傷以及病理學(xué)改變。

    氧化損傷是機(jī)體氧化還原平衡被打破向氧化水平升高方向轉(zhuǎn)化后造成的細(xì)胞和組織的損傷,在各類過敏性疾病的發(fā)病過程中都起著重要作用[20]。氧化應(yīng)激是多種病理損傷的關(guān)鍵因素,高水平的氧化應(yīng)激與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、遺傳物質(zhì)和細(xì)胞膜的損傷有關(guān)。臭氧作為具有高度活性的氧化劑,可通過產(chǎn)生ROS導(dǎo)致細(xì)胞毒性[21],造成組織出現(xiàn)不同程度的損傷[20,22]。體內(nèi)具有可以清除ROS的還原性多肽如GSH,它的消耗可以反映機(jī)體氧化還原平衡被打破的程度[23]。ROS過量后會(huì)造成對(duì)細(xì)胞和組織中脂質(zhì)物質(zhì)的氧化,而MDA則是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物。本研究表明,臭氧暴露后肺組織勻漿中MDA含量的上升、GSH含量的下降,表明小鼠肺部氧化還原平衡被打破,造成了明顯的氧化損傷。此外,小鼠肺組織中的細(xì)胞因子IL-1β、IL-33、IL-4和IL-17A含量顯著上升表明了臭氧暴露在小鼠模型中引發(fā)了明顯的炎癥反應(yīng)。H&E染色也發(fā)現(xiàn)臭氧暴露后小鼠氣道出現(xiàn)重塑和明顯的炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

    褪黑素是松果體的一種激素,也存在于許多的植物中,該化合物具有多種有利的生物學(xué)和治療活性,例如用于抗氧化劑、抗炎劑、抗腫瘤劑、抗糖尿病藥和心臟保護(hù)劑的生產(chǎn)[24-25]。Ding等[26]的研究表明,在實(shí)驗(yàn)性腦外傷中,褪黑素可刺激抗氧化酶活性并降低氧化應(yīng)激效應(yīng)。本研究擬通過口服暴露褪黑素減輕臭氧暴露對(duì)小鼠肺部造成的損傷。研究結(jié)果表明,褪黑素處理后,臭氧暴露組小鼠肺組織MDA含量顯著性下降,GSH含量顯著性上升;且肺泡灌洗液中細(xì)胞因子IL-1β、IL-33、IL-4和IL-17A含量也顯著性下降。這表明,褪黑素的使用不僅可以降低肺組織中的氧化損傷,還可以抑制炎癥反應(yīng),減輕肺組織病理學(xué)的改變。Nrf2是氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)中的一種強(qiáng)大的氧化還原傳感器,也是啟動(dòng)許多抗氧化基因的基本要素[27]。在本實(shí)驗(yàn)中,沒有經(jīng)過臭氧暴露的小鼠由于體內(nèi)的氧化還原處于平衡狀態(tài),所以MT的單獨(dú)作用并不會(huì)引起Nrf2的活化及其相關(guān)抗氧化基因HO-1和NQO-1的表達(dá)。但是,當(dāng)臭氧暴露后,肺組織中的氧化還原平衡被打破,此時(shí)MT可以通過激活Nrf2通路實(shí)現(xiàn)其抗氧化功能。

    綜上所述,臭氧急性暴露能顯著增加小鼠肺組織中的氧化應(yīng)激和炎癥水平,造成肺組織病理學(xué)改變和損傷;而抗氧化劑的使用可增加Nrf2及其下游抗氧化酶的表達(dá),有效降低臭氧暴露后小鼠肺組織氧化應(yīng)激水平,拮抗臭氧對(duì)小鼠肺組織的炎癥損傷,進(jìn)一步驗(yàn)證了臭氧暴露引起的肺部損傷是通過氧化性損傷機(jī)制介導(dǎo)的。

    猜你喜歡
    氧化應(yīng)激小鼠
    小鼠大腦中的“冬眠開關(guān)”
    基于炎癥-氧化應(yīng)激角度探討中藥對(duì)新型冠狀病毒肺炎的干預(yù)作用
    米小鼠和它的伙伴們
    氧化應(yīng)激與糖尿病視網(wǎng)膜病變
    Avp-iCre轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定
    尿酸對(duì)人肝細(xì)胞功能及氧化應(yīng)激的影響
    乙肝病毒S蛋白對(duì)人精子氧化應(yīng)激的影響
    氧化應(yīng)激與結(jié)直腸癌的關(guān)系
    加味四逆湯對(duì)Con A肝損傷小鼠細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用
    槲皮素及其代謝物抑制氧化應(yīng)激與炎癥
    黄色视频在线播放观看不卡| 51国产日韩欧美| 国内精品宾馆在线| 91精品国产九色| 国产精品人妻久久久久久| 欧美日韩综合久久久久久| a级毛片在线看网站| www.色视频.com| 综合色丁香网| 一边摸一边做爽爽视频免费| 蜜桃在线观看..| 国产免费一级a男人的天堂| 日日撸夜夜添| 我要看黄色一级片免费的| 自线自在国产av| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 99九九在线精品视频| 国产精品蜜桃在线观看| 久久久久国产网址| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产成人av激情在线播放 | videosex国产| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 最新的欧美精品一区二区| 一级片'在线观看视频| av电影中文网址| 亚洲人成网站在线播| 欧美+日韩+精品| 国产极品天堂在线| 黑人欧美特级aaaaaa片| 97精品久久久久久久久久精品| 国产免费又黄又爽又色| 满18在线观看网站| 国产精品三级大全| 亚洲av免费高清在线观看| av在线app专区| 久久久国产精品麻豆| 亚洲精品日韩av片在线观看| 美女福利国产在线| 十八禁高潮呻吟视频| 精品酒店卫生间| 哪个播放器可以免费观看大片| 99九九线精品视频在线观看视频| 亚洲精品456在线播放app| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 日本av免费视频播放| 久久影院123| 免费黄色在线免费观看| 熟女av电影| 午夜福利网站1000一区二区三区| 欧美另类一区| 99热这里只有是精品在线观看| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 蜜臀久久99精品久久宅男| 精品久久国产蜜桃| 亚洲欧美清纯卡通| 丝袜在线中文字幕| 成年人免费黄色播放视频| 色94色欧美一区二区| 日本午夜av视频| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 伦精品一区二区三区| av播播在线观看一区| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 男女免费视频国产| 国产精品人妻久久久影院| 免费日韩欧美在线观看| 久久婷婷青草| 超色免费av| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲成人一二三区av| 午夜福利,免费看| av在线观看视频网站免费| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲精品国产色婷婷电影| 狂野欧美激情性bbbbbb| 99re6热这里在线精品视频| 国产一区二区三区av在线| 午夜免费鲁丝| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 亚洲av男天堂| 在现免费观看毛片| 赤兔流量卡办理| 日韩一本色道免费dvd| 黑人猛操日本美女一级片| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| 69精品国产乱码久久久| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 91久久精品电影网| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲av不卡在线观看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 99热国产这里只有精品6| 国产成人免费无遮挡视频| 成年av动漫网址| 欧美最新免费一区二区三区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 欧美精品亚洲一区二区| 国产在线视频一区二区| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 一级黄片播放器| 高清视频免费观看一区二区| 精品一区二区免费观看| 丝袜脚勾引网站| 午夜视频国产福利| 亚洲精品视频女| 在线观看国产h片| 妹子高潮喷水视频| 久久久国产精品麻豆| 一本色道久久久久久精品综合| av女优亚洲男人天堂| 少妇的逼水好多| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产成人av激情在线播放 | 成人手机av| 免费观看性生交大片5| 久久精品国产a三级三级三级| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 日韩大片免费观看网站| 亚洲欧美一区二区三区国产| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 日韩欧美精品免费久久| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | 欧美日韩av久久| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲精品视频女| 亚洲精品久久午夜乱码| 高清在线视频一区二区三区| 国产精品 国内视频| 制服人妻中文乱码| 老熟女久久久| 日韩一本色道免费dvd| 国产综合精华液| 18禁观看日本| 久久久亚洲精品成人影院| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 超碰97精品在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| 美女国产视频在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡 | 亚洲成人手机| 久热这里只有精品99| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 久久青草综合色| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 国产精品免费大片| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 午夜久久久在线观看| 下体分泌物呈黄色| 亚洲在久久综合| 亚洲国产av新网站| 秋霞在线观看毛片| 高清午夜精品一区二区三区| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 插逼视频在线观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲精品av麻豆狂野| 三上悠亚av全集在线观看| 精品熟女少妇av免费看| 一级毛片电影观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产黄色免费在线视频| 免费观看性生交大片5| 老女人水多毛片| 日韩一本色道免费dvd| 国精品久久久久久国模美| 在线观看人妻少妇| 免费高清在线观看视频在线观看| 一区二区三区乱码不卡18| 午夜免费观看性视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 男男h啪啪无遮挡| 久久狼人影院| www.色视频.com| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲成人av在线免费| 一级毛片电影观看| 午夜福利视频在线观看免费| 国产黄频视频在线观看| 在线 av 中文字幕| 亚洲av二区三区四区| 少妇的逼好多水| 久热久热在线精品观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 麻豆精品久久久久久蜜桃| 久久久国产精品麻豆| 一级a做视频免费观看| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲第一区二区三区不卡| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 性色av一级| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产深夜福利视频在线观看| 91国产中文字幕| 午夜福利影视在线免费观看| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 日本av手机在线免费观看| av在线app专区| 免费高清在线观看视频在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 国产在线视频一区二区| 有码 亚洲区| 中文字幕制服av| 国产免费一级a男人的天堂| av在线播放精品| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 国产熟女欧美一区二区| 一级黄片播放器| 日韩电影二区| 亚洲精品aⅴ在线观看| 69精品国产乱码久久久| av卡一久久| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲中文av在线| 国产有黄有色有爽视频| 一区二区av电影网| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲美女搞黄在线观看| 色94色欧美一区二区| 亚洲av男天堂| 99久久精品国产国产毛片| 久久狼人影院| 一级,二级,三级黄色视频| av天堂久久9| 啦啦啦啦在线视频资源| 在线精品无人区一区二区三| 69精品国产乱码久久久| 久久韩国三级中文字幕| 国产日韩欧美亚洲二区| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 少妇的逼好多水| 麻豆乱淫一区二区| 国产探花极品一区二区| 极品人妻少妇av视频| 三级国产精品片| 日本-黄色视频高清免费观看| 综合色丁香网| 日韩成人伦理影院| 国产精品三级大全| 精品一区二区三卡| 七月丁香在线播放| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲一区二区三区欧美精品| 下体分泌物呈黄色| 在线看a的网站| 久久精品久久精品一区二区三区| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 日日啪夜夜爽| 又大又黄又爽视频免费| 少妇人妻精品综合一区二区| 我的老师免费观看完整版| 午夜免费鲁丝| 午夜福利,免费看| 少妇的逼好多水| 亚洲图色成人| a级毛片在线看网站| videossex国产| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产一区亚洲一区在线观看| 日日啪夜夜爽| 久久久久精品久久久久真实原创| 特大巨黑吊av在线直播| 欧美精品一区二区免费开放| 人妻系列 视频| 永久网站在线| 亚洲高清免费不卡视频| 国产精品不卡视频一区二区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 久久久久久久国产电影| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 美女国产高潮福利片在线看| 全区人妻精品视频| 午夜91福利影院| 欧美激情国产日韩精品一区| 欧美国产精品一级二级三级| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 免费观看a级毛片全部| 亚洲五月色婷婷综合| 中文字幕人妻丝袜制服| 日韩免费高清中文字幕av| 黄色配什么色好看| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 全区人妻精品视频| 国产免费一区二区三区四区乱码| 久久鲁丝午夜福利片| 多毛熟女@视频| 国产色爽女视频免费观看| 91国产中文字幕| 久热这里只有精品99| 99热网站在线观看| 高清在线视频一区二区三区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产精品国产三级专区第一集| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产成人精品无人区| 亚洲欧美清纯卡通| 国产成人精品福利久久| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产不卡av网站在线观看| 一级片'在线观看视频| 一个人免费看片子| 黑人高潮一二区| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 久久久久久伊人网av| 飞空精品影院首页| 美女主播在线视频| 18禁动态无遮挡网站| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲av综合色区一区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| 一边摸一边做爽爽视频免费| 一级,二级,三级黄色视频| 美女国产高潮福利片在线看| 母亲3免费完整高清在线观看 | 午夜激情久久久久久久| 国产淫语在线视频| 九色成人免费人妻av| 精品久久久噜噜| 亚洲精品乱久久久久久| 日本91视频免费播放| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲人成网站在线播| 国产一区二区在线观看日韩| 99热这里只有精品一区| 精品国产一区二区久久| 亚洲av在线观看美女高潮| 91国产中文字幕| 青春草国产在线视频| 亚洲精品视频女| 亚洲欧美一区二区三区国产| 18在线观看网站| 亚洲人与动物交配视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 欧美3d第一页| 国产一区二区在线观看日韩| 久久精品国产亚洲av天美| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 午夜日本视频在线| 人妻系列 视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产成人aa在线观看| 国产永久视频网站| 日韩一区二区三区影片| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 少妇熟女欧美另类| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 99热这里只有是精品在线观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 人妻系列 视频| 国产精品国产三级专区第一集| 久久人人爽人人片av| 视频在线观看一区二区三区| 热re99久久精品国产66热6| 国产极品天堂在线| 亚洲久久久国产精品| 黄片播放在线免费| 91精品三级在线观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 久久精品人人爽人人爽视色| 一二三四中文在线观看免费高清| 免费高清在线观看日韩| 婷婷色综合www| 亚洲第一区二区三区不卡| 免费日韩欧美在线观看| 久久久亚洲精品成人影院| 久久久久国产精品人妻一区二区| 免费人妻精品一区二区三区视频| 飞空精品影院首页| 亚洲国产av影院在线观看| 伊人久久国产一区二区| 大码成人一级视频| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 少妇高潮的动态图| 能在线免费看毛片的网站| 色网站视频免费| 日韩免费高清中文字幕av| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 国产黄频视频在线观看| 中文字幕制服av| 亚洲av成人精品一二三区| 伊人久久国产一区二区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 精品视频人人做人人爽| 青春草亚洲视频在线观看| 久久久久久久久久成人| 在线观看免费高清a一片| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 大片免费播放器 马上看| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲精品日本国产第一区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 韩国av在线不卡| 中文欧美无线码| 特大巨黑吊av在线直播| 国产成人免费观看mmmm| 国产一区有黄有色的免费视频| 五月玫瑰六月丁香| 赤兔流量卡办理| 黑人欧美特级aaaaaa片| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 精品国产国语对白av| 日本免费在线观看一区| 国产片特级美女逼逼视频| a级毛片在线看网站| 三级国产精品片| 哪个播放器可以免费观看大片| 99热这里只有精品一区| 久久久久视频综合| 赤兔流量卡办理| 青青草视频在线视频观看| 久久鲁丝午夜福利片| 99久久综合免费| 亚洲第一区二区三区不卡| 熟女人妻精品中文字幕| 午夜av观看不卡| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲国产av影院在线观看| 欧美精品高潮呻吟av久久| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 91精品一卡2卡3卡4卡| av国产精品久久久久影院| 国产男女超爽视频在线观看| 成年人午夜在线观看视频| freevideosex欧美| 午夜精品国产一区二区电影| 日韩中文字幕视频在线看片| 久久毛片免费看一区二区三区| 色视频在线一区二区三区| 成人亚洲精品一区在线观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 亚洲精品日本国产第一区| 日韩av在线免费看完整版不卡| 婷婷色av中文字幕| 国产一区二区在线观看av| 欧美一级a爱片免费观看看| 丰满乱子伦码专区| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 99久久综合免费| 在线看a的网站| 人妻系列 视频| 久久免费观看电影| 水蜜桃什么品种好| 亚洲精品,欧美精品| 亚洲人成网站在线播| 婷婷色综合大香蕉| 久热久热在线精品观看| 少妇人妻 视频| 亚洲第一av免费看| 18禁在线播放成人免费| 亚洲成色77777| 国产老妇伦熟女老妇高清| 久久99精品国语久久久| 国产在线一区二区三区精| 一级片'在线观看视频| 尾随美女入室| 亚洲高清免费不卡视频| 母亲3免费完整高清在线观看 | 国产成人免费无遮挡视频| 免费观看av网站的网址| 人妻系列 视频| 人人妻人人澡人人看| 日本欧美视频一区| 欧美性感艳星| 成人亚洲欧美一区二区av| 黄色视频在线播放观看不卡| 婷婷色综合大香蕉| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 成人二区视频| 各种免费的搞黄视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 大片免费播放器 马上看| 欧美精品一区二区大全| 999精品在线视频| 免费大片18禁| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲精品第二区| 国产国语露脸激情在线看| 精品一区二区三卡| 久久99热这里只频精品6学生| 亚洲经典国产精华液单| 黄色视频在线播放观看不卡| 少妇丰满av| 男人添女人高潮全过程视频| 中国国产av一级| 老司机影院毛片| 女性被躁到高潮视频| 久久久午夜欧美精品| 亚洲人成网站在线播| 国产亚洲欧美精品永久| 国产在线视频一区二区| 五月天丁香电影| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲少妇的诱惑av| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产精品.久久久| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 满18在线观看网站| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 午夜免费鲁丝| 国产有黄有色有爽视频| 午夜激情福利司机影院| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 日日啪夜夜爽| 亚洲国产精品专区欧美| 亚洲精品一二三| videossex国产| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲少妇的诱惑av| 青春草亚洲视频在线观看| 99国产综合亚洲精品| 麻豆乱淫一区二区| 99久久中文字幕三级久久日本| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 午夜老司机福利剧场| 久久99精品国语久久久| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产综合精华液| 天堂中文最新版在线下载| 蜜桃国产av成人99| 黑人高潮一二区| 十八禁网站网址无遮挡| 热99国产精品久久久久久7| 制服诱惑二区| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| xxxhd国产人妻xxx| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产爽快片一区二区三区| 国产精品欧美亚洲77777| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲五月色婷婷综合| 日日撸夜夜添| 国产精品99久久久久久久久| 在现免费观看毛片| 五月伊人婷婷丁香| 秋霞伦理黄片| 国产免费一区二区三区四区乱码| 只有这里有精品99| 天天影视国产精品| 免费观看无遮挡的男女| 日韩av在线免费看完整版不卡| 十八禁高潮呻吟视频| 9色porny在线观看| 天堂中文最新版在线下载| 特大巨黑吊av在线直播| 97在线视频观看| 久久久久久久久久人人人人人人| 久久久精品区二区三区| 777米奇影视久久| av有码第一页| 99热全是精品| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产在线免费精品| 久久精品夜色国产| 日韩大片免费观看网站| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 水蜜桃什么品种好| 亚洲av.av天堂| 国产精品99久久久久久久久| 曰老女人黄片| 日本vs欧美在线观看视频| 高清视频免费观看一区二区| 男人爽女人下面视频在线观看| 少妇人妻 视频| 久久亚洲国产成人精品v| 热99国产精品久久久久久7| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 777米奇影视久久| 女人久久www免费人成看片| 久久人人爽人人片av| 亚洲精品色激情综合| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 熟女人妻精品中文字幕| 精品一区二区免费观看| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲精品日本国产第一区| 日本wwww免费看| 中国美白少妇内射xxxbb| 精品国产国语对白av| 18在线观看网站| 亚洲少妇的诱惑av| 国产黄片视频在线免费观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 丝瓜视频免费看黄片| 日韩三级伦理在线观看| 欧美日本中文国产一区发布| 国产成人aa在线观看| 草草在线视频免费看| 国产伦理片在线播放av一区| av女优亚洲男人天堂| 桃花免费在线播放|