茶樹草螺菌WT00C-Se發(fā)酵制備紅色納米單質(zhì)硒

田金寶,雷佳,周佳卉,倪雪晨,陳昌梅,王行國

(湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 湖北 武漢 430062)

0 引言

硒是一種動(dòng)植物必需的微量非金屬元素.在自然界，硒常常以無機(jī)和有機(jī)形式存在.硒的有機(jī)形式通常存在動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)，如硒代半胱氨酸、硒代甲硫氨酸以及硒蛋白.無機(jī)硒通常有4種價(jià)態(tài): 硒酸鹽(Se6+)，亞硒酸鹽(Se4+)，硒化物(Se2-)和單質(zhì)硒(Se0)[1].其中Se2-常作為各種生物制造硒蛋白的原料且具有揮發(fā)性[2].硒酸鹽(Se6+)和亞硒酸鹽(Se4+)是水溶性的，在環(huán)境中具有潛在的移動(dòng)性和生物可利用性[3].雖然Se6+吸附能力較弱，但其潛在的活性和生物利用率比Se4+要高[4].在含氧環(huán)境中，Se6+和Se4+占有優(yōu)勢(shì)，但濃度偏高時(shí)對(duì)生物呈現(xiàn)較強(qiáng)的生物毒性.在還原環(huán)境中，Se0更趨于熱力學(xué)穩(wěn)定但水溶性較差.單質(zhì)納米硒具有高生物活性、低毒性和高光電導(dǎo)率[5].利用單質(zhì)納米硒特定的物理性質(zhì)，人們已在光電、半導(dǎo)體、X 線感測(cè)等方面應(yīng)用.由于擁有高表面積和體積，單質(zhì)納米硒具有較強(qiáng)的吸附力和抗氧化功能，如抗羥自由基功效、抗DNA氧化作用以及抗微生物活性等[6].它們的生物反應(yīng)性顯示出單質(zhì)納米硒在免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、延緩衰老、抑制腫瘤、治療微生物感染方面的應(yīng)用潛力.單質(zhì)納米硒體外清除羥基自由基的效率為無機(jī)硒的5倍、有機(jī)硒的2.5倍、其毒性僅為亞硒酸鈉的1/7.

目前，單質(zhì)納米硒主要通過物理化學(xué)方法制備，如使用水熱/溶劑熱合成法、微波法、脈沖激光燒蝕、氣相沉積法、模板法和自組裝等方法制備硒納米材料[7].鑒于物理化學(xué)方法的非環(huán)境友好問題，人們開始利用化學(xué)-生物質(zhì)或微生物方法制備單質(zhì)納米硒.但目前尚處在研究開發(fā)階段.化學(xué)-生物質(zhì)方法的缺點(diǎn)主要是生物質(zhì)獲取的成本高，不宜規(guī)?；a(chǎn).利用微生物方法制備單質(zhì)納米硒雖然可行.但大多數(shù)微生物如大腸桿菌、羅爾斯通氏菌、深紅紅螺菌、莢膜紅細(xì)菌、熒光假單胞菌、固氮紅細(xì)菌等對(duì)硒酸鈉或亞硒酸鈉的耐受性低.僅見一株固氮紅細(xì)菌耐受高達(dá)125 mmol/L亞硒酸鈉.且能將亞硒酸鈉還原為紅色單質(zhì)硒，但高于此濃度它就無法生長[8-9].因此，開發(fā)新的微生物方法制備單質(zhì)納米硒是當(dāng)前廣受關(guān)注的重要課題，也是實(shí)現(xiàn)環(huán)境友好、低成本、規(guī)摸化生產(chǎn)的有效途徑.

圖1 茶樹內(nèi)生草螺菌硒酸鹽還原生成紅色單質(zhì)硒的代謝途徑

茶樹內(nèi)生草螺菌WT00C和WT00F是本實(shí)驗(yàn)室從野外觀賞茶樹中分離的兩株革蘭氏陰性內(nèi)生細(xì)菌.并且在實(shí)驗(yàn)室里實(shí)現(xiàn)了規(guī)模化培養(yǎng)[10].茶樹內(nèi)生草螺菌WT00C全基因組測(cè)序[11]發(fā)現(xiàn)它擁有硒酸鹽還原途徑，即通過腺苷酰硫酸焦磷酸化酶將硒酸鹽還原成亞硒酸鹽后，再經(jīng)過谷胱甘肽、谷胱甘肽還原酶將其還原為谷胱甘肽-硒醇并最終生成零價(jià)的單質(zhì)硒(圖1).前期研究證明，茶樹內(nèi)生草螺菌能利用硒酸鹽還原途徑合成紅色單質(zhì)硒[12].茶樹內(nèi)生草螺菌不僅在低硒酸鹽濃度下還原硒酸鹽.而且,能在高達(dá)800 mmol/L硒酸鹽中也能還原硒酸鹽生成紅色單質(zhì)硒.只是硒酸鹽濃度越高，它的生長抑制期越長，即細(xì)菌生長周期耗時(shí)越久.例如,當(dāng)硒酸鹽濃度為75 mmol/L時(shí),茶樹內(nèi)生草螺菌生長抑制期大約為7 h.而硒酸鹽濃度為200 mmol/L時(shí),它的生長抑制期為12 h[12].由于紅色單質(zhì)硒產(chǎn)率依賴硒酸鹽濃度，硒酸鹽濃度越高，紅色單質(zhì)硒產(chǎn)率也越高.因此,本研究的目的是開發(fā)出一種能在高硒酸鹽濃度條件下有效生產(chǎn)紅色單質(zhì)硒的菌株,并實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn).本研究報(bào)道如何獲取茶樹內(nèi)生草螺菌WT00C-Se,并利用它在200 mmol/L硒酸鹽濃度條件下生產(chǎn)紅色單質(zhì)硒的方法，為細(xì)菌生產(chǎn)紅色單質(zhì)硒提供了一種全新的思路，也為后續(xù)產(chǎn)業(yè)化提供了技術(shù)支撐.

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌菌株與培養(yǎng)茶樹草螺菌WT00C由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存.茶樹草螺菌WT00C-Se來自200 mmol/L硒酸鈉LB培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)28 h 的茶樹草螺菌WT00C.參照文獻(xiàn)[10],細(xì)菌日常在含有5 μg/mL壯觀霉素和10 μg/mL 氨芐青霉素的營養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基(蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、加水至1 L, pH 7.2)中34 ℃培養(yǎng)，-80 ℃貯存.放大培養(yǎng)時(shí)，先用NB培養(yǎng)基活化，再用LB 培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g、NaCl 10 g、酵母提取物5 g、加水至1 L, pH 7.2)37 ℃培養(yǎng).

1.2 200 mmol/L 硒酸鹽條件下茶樹草螺菌生長曲線的測(cè)定取-80 ℃凍存的茶樹草螺菌，劃線涂布在含有5μg/mL壯觀霉素和10 μg/mL氨芐青霉素的NB固體培養(yǎng)基上，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，挑取單菌落并接種于5 mL NB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃、200 r/min搖床中活化過夜.將過夜活化培養(yǎng)至OD600值為0.6.按照1∶100比例轉(zhuǎn)接至100 mL的含200 mmol/L 硒酸鈉的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔兩小時(shí)取樣并檢測(cè)OD600值，根據(jù)測(cè)得的數(shù)值繪制生長曲線.同時(shí),將茶樹草螺菌WT00C接種至不含硒酸鈉的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)并用作參照.每個(gè)點(diǎn)的數(shù)值為3次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)誤為≤10%.

1.3 茶樹草螺菌WT00C-Se硒酸鈉還原活性測(cè)試參考文獻(xiàn)[12]報(bào)道的方法,取茶樹草螺菌WT00C-Se并按1∶100比例接種至含0、50、75、100、150、200 mmol/L硒酸鈉的200 mL LB培基中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)18 h.肉眼觀察培養(yǎng)基顏色變化.

1.4 茶樹草螺菌WT00C-Se紅色單質(zhì)硒產(chǎn)率條件優(yōu)化首先按1∶100比例接種草螺菌WT00C-Se至含0、10、25、75 mmol/L 硒酸鈉的LB培養(yǎng)基中,恒溫?fù)u床37 ℃,200 r/min活化.待OD600值為0.8時(shí)，再將4種活化的細(xì)菌按1∶100的比例分別接種于含150 mmol/L 和200 mmol/L 硒酸鈉 的LB液體培養(yǎng)基中.每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)，每瓶總體積為200 mL，共72瓶.接種后仍在恒溫?fù)u床 37 ℃,200 r/min條件下培養(yǎng).為了消除細(xì)菌生長的差異引起的誤差,首先待所有樣品中細(xì)菌的OD600值為1.0,再分別計(jì)時(shí)培養(yǎng)12 h和24 h,并分別在這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣純化紅色單質(zhì)硒.最后稱重計(jì)算產(chǎn)率并進(jìn)行比較.

1.5 發(fā)酵罐發(fā)酵首先按1∶100比例接種茶樹草螺菌WT00C-Se至含75 mmol/L 硒酸鈉的LB培養(yǎng)基中,恒溫?fù)u床37 ℃、200 r/min活化至OD600值為0.8.在5 L發(fā)酵罐(BIOTECH, 上海保興)中加入3 L LB 液體培養(yǎng)基并按廠家要求消毒滅菌.然后，加入硒酸鈉至終濃度200 mmol/L, 再按1∶100的接種量接入30 mL活化的細(xì)菌種子液,并按優(yōu)化條件在37 ℃、200 r/min發(fā)酵35 h.發(fā)酵停止后，收集發(fā)酵罐內(nèi)的細(xì)菌溶液.

1.6 納米硒球制備參考文獻(xiàn)[12]報(bào)道的方法，將收集的細(xì)菌培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至離心管中，1 000 r/min離心10 min并收集上清.上清液再經(jīng)10 000 r/min 離心10 min，收集沉淀并用無菌的1 mol/L PBS 緩沖液重懸沉淀.爾后再經(jīng)無菌的50%～70%蔗糖密度梯度15 000 r/min 離心20 min.小心吸取50%蔗糖和70%蔗糖中間的紅色區(qū)帶，并用無菌的100 mmol/L PBS 緩沖液重懸.轉(zhuǎn)移至新的蔗糖密度梯度溶液上再離心一次.吸取的紅色區(qū)帶用無菌的100 mmol/L PBS 緩沖液重懸后，10 000 r/min離心10 min并收集沉淀.重復(fù)這一過程兩次.得到純凈的納米硒球.

1.7 紅色納米單質(zhì)硒制備收集菌液于500 mL 離心瓶中，4 ℃、1 000 r/min離心兩次，每次10 min.收集上清部分并除去細(xì)菌沉淀.4 ℃、8 000 r/min離心上清部分30 min并收集沉淀物.用生理鹽水離心洗滌(4 ℃、12 000 r/min、8 min)3次后，用生理鹽水重懸沉淀物并混勻.在冰浴、功率為100 W的條件下超聲處理重懸液10 min后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min并收集沉淀物.用1.5 mol/L Tris-HCl、1%SDS(pH 8.3)離心洗滌(4 ℃、12 000 r/min、8 min)沉淀物兩次，最后用無菌水洗滌1次.用無菌水重懸沉淀物后，按V重懸液∶V正辛醇=2∶1的比例加入正辛醇.充分混勻后，4 ℃、12 000 r/min 離心8 min并置于4 ℃ 24 h.小心移去全部液體后，沉在離心管底部納米硒顆粒(SeNPs)分別用氯仿、乙醇和無菌水12 000 r/min 離心8 min各洗滌一次以除去蛋白雜質(zhì).最后使用真空冷凍干燥儀(LGJ-10, 北京松源華興)干燥獲得的紅色單質(zhì)硒.稱重后儲(chǔ)存于4 ℃.

1.8 掃描電鏡(SEM)觀察參考文獻(xiàn)[12]報(bào)道的方法，取樣后在4 ℃、8 000 r/min離心5 min 后得到菌體沉淀.用磷酸緩沖液清洗沉淀3次后，加入2.5%的戊二醛溶液固定3 h，再用磷酸緩沖液清洗3次，最后從低濃度乙醇到高濃度乙醇(10%～100%)梯度脫水自然干燥.待乙醇揮發(fā)完畢后，取部分干粉樣品通過導(dǎo)電膠粘結(jié)在樣品座上，通過離子濺射方式在樣品表面鍍金以增加導(dǎo)電性.鍍金完畢后，使用掃描電子顯微鏡(JSM 6510LV, 日本JEOL會(huì)社)觀察并拍照.

1.9 透射電鏡(TEM)觀察參考文獻(xiàn)[12]報(bào)道的方法，將100 μL 純化的紅色納米球懸液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，加入900 μL 無菌水混合均勻.小心取出碳支持膜型銅網(wǎng)，正面朝上放置于濾紙片上.取20 μL 樣品，分次滴于銅網(wǎng)上，每次滴加前需晾干再進(jìn)行下一次滴加.晾干后,將樣品放入透射電子顯微鏡(Tencnai G20，美國FEI 公司)進(jìn)行觀察并拍照.

2 結(jié)果與分析

圖2 茶樹草螺菌在含200 mmol/L 硒酸鈉LB培基中的生長曲線WT00C-Se: 在含200 mmol/L 硒酸鈉LB培基中生長28 h的茶樹草螺菌

2.1 茶樹草螺菌WT00C-Se具有較強(qiáng)的硒酸鹽耐受性使用含200 mmol/L 硒酸鈉的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，茶樹草螺菌WT00C顯示12 h的生長抑制期.爾后,恢復(fù)生長并在30 h達(dá)到穩(wěn)定生長期(圖2).當(dāng)茶樹草螺菌WT00C生長至28 h時(shí), 收獲、保存細(xì)菌培養(yǎng)物并命名為茶樹草螺菌WT00C-Se.將茶樹草螺菌WT00C-Se重新接種至含200 mmol/L 硒酸鈉的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng).從圖2可見，在200 mmol/L 硒酸鈉條件下37℃培養(yǎng)，茶樹草螺菌WT00C-Se的生長抑制期僅6 h.恢復(fù)生長后在24 h達(dá)到穩(wěn)定生長期.與茶樹草螺菌WT00C相比, 在200 mmol/L硒酸鈉相同條件下生長,茶樹草螺菌WT00C-Se的生長周期縮短了6 h.結(jié)果提示, 茶樹草螺菌WT00C經(jīng)過一輪高濃度硒酸鹽培養(yǎng)后，其生理生化特性發(fā)生了明顯的變化.與原始的茶樹草螺菌WT00C相比, 茶樹草螺菌WT00C-Se具有較強(qiáng)的硒酸鹽耐受性.

圖3 在含200 mmol/L 硒酸鈉LB培基中生長28 h的茶樹草螺菌(WT00C-Se)重新接種至0～200 mmol/L硒酸鈉LB培基中培養(yǎng)18 h的結(jié)果

2.2 茶樹草螺菌WT00C-Se擁有較強(qiáng)的硒酸鹽還原活性茶樹草螺菌WT00C-Se雖然具有較強(qiáng)的硒酸鹽耐受性并縮短生長周期6 h.但未知它是否仍具有較強(qiáng)的硒酸鹽還原活性.為了檢測(cè)它是否具有硒酸鹽還原能力，將茶樹草螺菌WT00C-Se接種到分別含有0、50、75、100、150和200 mmol/L硒酸鈉的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng).由圖3可知，在含有硒酸鈉的LB培養(yǎng)基中，15 h即可見培養(yǎng)基顏色變紅，18 h培養(yǎng)基顏色已轉(zhuǎn)為深紅，尤其在200 mmol/L硒酸鈉的LB培養(yǎng)基中顏色最深.這個(gè)結(jié)果表明茶樹草螺菌WT00C-Se依然能有效地將硒酸鹽(Se6+)還原生成紅色單質(zhì)硒(Se0).為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，使用含200 mmol/L硒酸鈉的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)茶樹草螺菌WT00C-Se，然后在不同的生長階段取樣并在掃描電子顯微鏡下觀察，結(jié)果見圖4.由圖4可知，培養(yǎng)6 h時(shí), 草螺菌WT00C-Se細(xì)胞呈多細(xì)胞連接體狀態(tài)，說明它們已開始分裂增殖，且其中少數(shù)細(xì)胞表面附有紅色納米硒球顆粒(圖4a).培養(yǎng)17 h時(shí)(對(duì)數(shù)生長期),細(xì)菌細(xì)胞多呈短棒狀，表面附有的紅色納米硒球顆粒的細(xì)胞增多(圖4b).當(dāng)培養(yǎng)至24 h時(shí)(穩(wěn)定生長期), 絕大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞表面附有紅色納米硒球顆粒(圖4c).由此可見, 茶樹草螺菌WT00C-Se在恢復(fù)生長時(shí)就開始還原硒酸鹽生成紅色納米單質(zhì)硒.隨著生長期的進(jìn)程, 還原硒酸鹽合成紅色納米單質(zhì)硒的效率逐漸增強(qiáng).直至穩(wěn)定生長期，還原硒酸鹽合成紅色納米單質(zhì)硒的效率達(dá)到最大，與草螺菌WT00C[12]相似.圖4d顯示放大的細(xì)菌和表面附著的紅色納米硒球顆粒.這個(gè)結(jié)果再次證明茶樹草螺菌WT00C-Se能有效地將六價(jià)的硒酸鹽還原生成零價(jià)的紅色單質(zhì)硒.

圖4 37 ℃、200 mmol/L硒酸鈉LB培養(yǎng)基培養(yǎng)不同時(shí)間的茶樹草螺菌(WT00C-Se)電子掃描電鏡(SEM)觀察

2.3 茶樹草螺菌WT00C-Se生產(chǎn)紅色單質(zhì)硒的條件優(yōu)化既然茶樹草螺菌WT00C-Se能有效地將硒酸鹽還原生成紅色單質(zhì)硒且又縮短生長周期6 h，它們應(yīng)該可以替代原來的天然菌株茶樹草螺菌WT00C，用于紅色單質(zhì)硒的生產(chǎn).考慮到茶樹草螺菌WT00C-Se來自含200 mmol/L 硒酸鈉LB培養(yǎng)基培養(yǎng)28 h的細(xì)菌，在培養(yǎng)過程中它或許需要在培養(yǎng)基中添加一定量的硒酸鹽來維護(hù)它特有的生理特性.因此，在活化階段分別加0、10、25和75 mmol/L 硒酸鈉至活化用的培養(yǎng)基內(nèi).活化后再轉(zhuǎn)接至含150和200 mmol/L硒酸鈉的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并分3個(gè)階段取樣純化紅色單質(zhì)硒、稱重并計(jì)算產(chǎn)率.考慮到不同濃度的硒酸鹽影響細(xì)菌的生長速度，第一階段讓所有的細(xì)菌培養(yǎng)物OD600值達(dá)到1.0時(shí)再取樣分析以消除不同生長帶來的誤差.第二階段是讓細(xì)菌培養(yǎng)物OD600值達(dá)到1.0時(shí)再繼續(xù)培養(yǎng)12 h，而第三階段則是讓細(xì)菌培養(yǎng)物OD600值達(dá)到1.0時(shí)再繼續(xù)培養(yǎng)24 h.實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖5)表明:(1)無論是在150 mmol/L還是在200 mmol/L硒酸鈉中培養(yǎng)，3個(gè)階段獲得的結(jié)果顯示活化時(shí)未加硒酸鹽其紅色單質(zhì)硒產(chǎn)率都是最低的；(2)在3個(gè)階段中，200 mmol/L硒酸鈉培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)紅色單質(zhì)硒產(chǎn)率明顯高于150 mmol/L硒酸鈉；(3)與10、25 mmol/L 硒酸鈉比較，使用75 mmol/L 硒酸鈉活化細(xì)菌，紅色單質(zhì)硒產(chǎn)率最優(yōu)；(4)使用75 mmol/L 硒酸鈉活化細(xì)菌，轉(zhuǎn)接至200 mmol/L硒酸鈉培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第二階段，紅色單質(zhì)硒產(chǎn)率巳達(dá)(550±28)μg/mL.這個(gè)數(shù)值與相同條件下培養(yǎng)至第三階段獲得的產(chǎn)率(562±16)μg/mL比較，沒有顯著性差異(p>0.05).因此，茶樹草螺菌WT00C-Se生產(chǎn)紅色單質(zhì)硒的優(yōu)化條件設(shè)定為: 使用75 mmol/L 硒酸鈉LB培養(yǎng)基活化茶樹草螺菌WT00C-Se，然后按1∶100比例接種至含200 mmol/L 硒酸鈉LB培養(yǎng)基中，并在37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)30 h.

圖5 不同條件活化的茶樹草螺菌生成紅色單質(zhì)硒的產(chǎn)率比較

2.4 茶樹草螺菌WT00C-Se發(fā)酵生產(chǎn)紅色單質(zhì)硒根據(jù)上述優(yōu)化條件，使用5 L發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)紅色單質(zhì)硒.發(fā)酵條件設(shè)置為：溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min、pH值為7.0、通氣量為1 L/ min、LB培養(yǎng)基中加入終濃度為200 mmol/L硒酸鈉、活化茶樹草螺菌WT00C-Se時(shí)使用含75 mmol/L硒酸鈉的培養(yǎng)基、細(xì)菌接種比例為1∶100、總體積3 L、發(fā)酵時(shí)間為30 h.剛開始發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，發(fā)酵液呈橙黃色(見圖6a).發(fā)酵培養(yǎng)30 h后培養(yǎng)基顏色由橙黃色變成鮮紅色(圖6b)，說明發(fā)酵罐內(nèi)的茶樹草螺菌WT00C-Se已還原硒酸鈉并生成了紅色單質(zhì)硒.按照前面描述的納米硒球制備方法，獲得純凈的納米硒球.透射電子顯微鏡觀察顯示，納米硒球呈圓球形, 直徑為10～200 nm(見圖6c).按照前面描述的紅色單質(zhì)硒制備方法，獲得純凈的紅色單質(zhì)硒(圖6d).經(jīng)過3次發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，獲得的紅色單質(zhì)硒產(chǎn)率平均值為(560±43)μg/mL，即每升培養(yǎng)物可制備560 mg純凈的紅色單質(zhì)硒.

圖6 茶樹草螺菌發(fā)酵生產(chǎn)紅色單質(zhì)硒

3 討論

在高達(dá)200 mmol/L硒酸鈉條件下，茶樹草螺菌WT00C雖然有長達(dá)12 h的生長抑制期.但它仍能恢復(fù)生長并在30 h達(dá)到穩(wěn)定生長期.這個(gè)結(jié)果與前期研究結(jié)論[12]一致.有趣的是,將它在200 mmol/L硒酸鈉條件下生長28 h后再次接入含200 mmol/L硒酸鈉的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，其生長抑制期縮短為6 h，并在24 h到達(dá)穩(wěn)定生長期.與原來的茶樹草螺菌WT00C相比，這個(gè)新命名的茶樹草螺菌WT00C-Se在200 mmol/L硒酸鈉條件下整個(gè)生長期提前了6 h.雖然有許多微生物還原硒酸鹽或亞硒酸鹽的報(bào)道[13-19]但它們都是在低濃度條件下進(jìn)行研究，尚未見高濃度(>100 mmol/L)條件下還原硒酸鹽或亞硒酸的研究報(bào)道.現(xiàn)在普遍接受的觀點(diǎn)是，硒酸鹽或亞硒酸進(jìn)入細(xì)胞后其硒基團(tuán)取代了酶或蛋白中的巰基，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激壓力增大而表現(xiàn)出它們的生物學(xué)毒性[20-24].茶樹草螺菌WT00C-Se表現(xiàn)出較強(qiáng)的硒酸鹽耐受性，說明它的生理生化性質(zhì)與茶樹草螺菌WT00C不同，至少擁有較強(qiáng)的抗氧化能力.本實(shí)驗(yàn)室正在進(jìn)行詳細(xì)的分子機(jī)理研究.

茶樹草螺菌WT00C-Se具有較強(qiáng)的硒酸鹽耐受性，并縮短生長周期6 h.使用搖瓶培養(yǎng)和掃描電鏡觀察細(xì)胞的方法，證明茶樹草螺菌WT00C-Se具有較強(qiáng)的硒酸鹽還原能力.因此，利用茶樹草螺菌WT00C-Se還原硒酸鹽、生產(chǎn)紅色單質(zhì)硒成為一種新的技術(shù)選擇.我們通過條件優(yōu)化，找到茶樹草螺菌WT00C-Se還原硒酸鹽生產(chǎn)紅色單質(zhì)硒的優(yōu)化條件，并使用小型發(fā)酵罐成功生產(chǎn)出紅色單質(zhì)硒.依據(jù)我們?cè)O(shè)定的發(fā)酵條件，每升培養(yǎng)物可制備560 mg純凈的紅色單質(zhì)硒.這些研究結(jié)果不僅為利用微生物生產(chǎn)紅色單質(zhì)硒提供了一種全新的思路，且為今后產(chǎn)業(yè)化提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐.