飼料中添加廚余發(fā)酵產(chǎn)物對“中科3號”異育銀鯽肝臟、腸道及腎臟顯微結(jié)構(gòu)的影響

■劉 洋 敖慧玲 蔣家鵬 劉立鶴* 劉 軍

（1.武漢輕工大學(xué)動物科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，湖北武漢430023；2.動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點實驗室，湖北武漢430023）

廚余垃圾也稱餐廚垃圾，主要由米和面粉類食物殘余、蔬菜及其他有機生活垃圾等組成，富含淀粉、蛋白質(zhì)、脂類、纖維素、維生素和無機鹽等多種營養(yǎng)物質(zhì)[1]。廚余垃圾除了具有高水分、高油脂和高鹽分等特點，還具有明顯的空間地域特征。長期以來，填埋、焚燒是廚余垃圾最主要的處理方式，其次相當比例的廚余垃圾用于喂潲水畜禽，此外，堆肥和厭氧發(fā)酵也是常見的處理方式。隨著我國社會經(jīng)濟、城市化和人民生活水平的提高，廚余垃圾產(chǎn)量日益增長，2017 年更是達到了驚人的2.15 億噸[2]，隨著城市周邊土地資源的日益匱乏和環(huán)境污染加劇，尤其受到近期非洲豬瘟肆虐的影響，使得餐廚垃圾利用微生物快速處理，變廢為寶，實現(xiàn)資源化利用變得越來越緊迫。

近年來水產(chǎn)養(yǎng)殖蓬勃發(fā)展，水產(chǎn)配合飼料需求強大，導(dǎo)致水產(chǎn)飼料原料缺口巨大，每年國內(nèi)年需求量達8 000萬噸，而缺口達4 000萬噸以上，且蛋白飼料原料價格連年上漲已嚴重影響了我國飼料業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[3]。而廚余垃圾經(jīng)快速發(fā)酵后，具有營養(yǎng)豐富、安全的特征，在水產(chǎn)飼料上應(yīng)用經(jīng)濟價值巨大。鯽魚是我國傳統(tǒng)的廣溫性雜食性魚類，具有生長快、食性廣、抗病力佳、適應(yīng)性強的特征，便于養(yǎng)殖[4]。2017 年鯽魚淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量已達281.8 萬噸[5]，“中科3號”異育銀鯽是由中國科學(xué)院水生生物研究所研究團隊歷時10 余年培育出的新品種，適宜各種水體養(yǎng)殖具有生長快，抗病力強的特點。目前，已在江蘇、湖北、廣東和廣西等多個省建立了良種擴繁和苗種生產(chǎn)基地[6]，發(fā)展態(tài)勢迅猛。

不同飼料原料對動物及魚類內(nèi)臟組織形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)的變化極其顯著[7-8]，因此，本試驗添加不同比例廚余發(fā)酵產(chǎn)物（FPKW）的飼料飼喂“中科3號”異育銀鯽60 d，添加不同比例FPKW對鯽魚不同組織顯微結(jié)構(gòu)和形態(tài)的影響，初步確定FPKW在鯽魚飼料中的適宜添加量，進而可為解決廚余垃圾處理和飼料原料短缺兩者應(yīng)用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗魚種

試驗用“中科3 號”異育鯽魚魚種購于湖北省名特優(yōu)魚類良種場孝感三汊基地，運至武漢輕工大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地，在2個2 m×2 m×2 m暫養(yǎng)池中馴養(yǎng)2周，期間投喂基礎(chǔ)飼料。試驗開始時前停食1 d，挑選體表無損傷，大小一致的魚苗作為試驗魚。

1.2 廚余發(fā)酵產(chǎn)物

FPKW 由標優(yōu)美生態(tài)工程股份有限公司友情提供，在Biom 生物環(huán)保廚余機BYM-F1-10加入廚余生物消化劑活化后，于每日12：00稱重并加入南京建鄴區(qū)新城科技園員工食堂的濾干廚余垃圾10 kg，持續(xù)投料30 d，第35 d 停機取出所得產(chǎn)物，經(jīng)烘干、粉碎、過篩后即為FPKW，將樣品置于-20 ℃冰箱備用。FPKW水分采用105 ℃常壓干燥法測定；粗蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測定；粗脂肪含量采用索氏抽提法測定，有機提取溶劑為乙醚；粗灰分含量采用馬弗爐550 ℃灼燒法測定[9]。經(jīng)分析其營養(yǎng)成分水：分含量為7.6%、粗灰分含量為5.7%、粗蛋白含量為18.7%、粗脂肪含量為20.4%、粗纖維含量為8.9 %，并且發(fā)酵產(chǎn)物中未檢測出黃曲霉毒素和沙門氏菌等有害物質(zhì)。

1.3 試驗飼料

將FPKW按0%、3%、6%、9%、12%、15%的比例配置成6種等氮日糧，分別記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組，添加30%組作為極高添加量組，配成等氮日糧記為Ⅶ組，其中1組為對照組，飼料配方及營養(yǎng)水平見表1。配置飼料時，各種原料均粉碎過60目篩，微量添加原料采用逐級擴大法進行充分混合，待所有組分混勻后，用常州市海江藥化機械廠生產(chǎn)的XZL-250旋轉(zhuǎn)式制粒機制作顆粒飼料，陰干后，置于-20 ℃下冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

表1 飼料配方及營養(yǎng)水平（干重基準）

1.4 養(yǎng)殖試驗管理

養(yǎng)殖試驗在武漢輕工大學(xué)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行，試驗缸直徑80 cm，高80 cm，盛水300 L的藍色圓形玻璃缸，每個處理組設(shè)3 個重復(fù)，每個重復(fù)放置(7.4±0.21) g 25尾魚，試驗期為60 d，日投餌3次，使其自由采食，投餌量為魚總體重的2%～3%，每次投餌前關(guān)閉循環(huán)水，投餌結(jié)束待收集糞便后打開循環(huán)水，每周根據(jù)魚體攝食和增重適當調(diào)整投飼量。試驗用水為循環(huán)水，水溫維持(20±1) ℃，24 h充氣增氧，D.O＞5 mg/l，NH3-N＜0.1 mg/l，pH值為7.0～7.5。

1.5 鯽魚組織切片制作與觀察

試驗結(jié)束停飼1 d，魚體解剖和樣品采集按照李承林主編的魚類學(xué)教程中消化器官解剖及泌尿器官與生殖器官解剖方法進行[10]，將魚體左側(cè)向上，置于解剖盤中，左手握魚，右手握剪，先在肛門前方剪一小的橫切口，然后將一剪尖插入此切口，沿腹中線向前剪開至鰓蓋下方，進入體內(nèi)的剪尖稍向上挑，貼內(nèi)壁剪。然后自臀鰭前緣向左側(cè)背方體壁剪上去，沿脊柱下方向前至鰓蓋后緣，將左側(cè)體壁全部剪去，顯示出內(nèi)臟，用眼科剪和眼科鑷從胃后部剪下，分離出腸道、肝臟，再用剪刀將圍心腹腔隔膜的背緣除去，露出頭腎，分離出腎臟。用吸頭吸取無菌PBS沖洗消化道外壁，輕柔擠出腸道內(nèi)容物，用無菌剪刀剪開腸道，用吸頭吸取無菌PBS 沖洗數(shù)次，洗干凈內(nèi)容物，放到干凈培養(yǎng)皿上，切取中腸、肝臟及腎臟組織塊裝入對應(yīng)無菌離心管中，放入冰盒中。

解剖試驗共七組，每組三個重復(fù)，每個重復(fù)2 條魚，共42 條魚。解剖試驗完成后剩余魚體單獨放入自封袋，標記，在-80 ℃保存待測。

將取樣完成的鯽魚肝臟、腸道及腎臟組織樣品用Davidson's 固定液固定5 h，隨后在室溫下以50%，70%、95%、100%濃度乙醇按梯度脫水各60 min，脫水后的樣品移入水楊酸甲酯試劑中透明30 min，透明后的樣品放入裝有融化的石蠟蠟杯中浸蠟2 h，隨后將樣品包埋于石蠟中使樣品凝固成塊，橫縱方向連續(xù)切制5 μm 厚的薄片，將切好的蠟片放在載玻片上置于45 ℃的展片臺上烤干，H.E染色用曲長慶等[11]制作高質(zhì)量動物組織切片的方法進行染色，中性樹脂封片用于切片觀察。腸道及肝臟樣品于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，將腸道和肝臟解凍之后，分別稱取1 g 組織，剪碎后，按W∶V=1∶10加入4 ℃、0.9%的生理鹽水，在冰浴下用電動勻漿器勻漿。

采用倒置顯微鏡(XSP-16A)觀察肝臟、腸道和腎臟組織的形態(tài)并拍照，每個切片隨機選取6個視野進行拍照，以明美顯微數(shù)碼測量分析系統(tǒng)（Mshot Image Analysis System）采集圖像并測量腸絨毛高度（絨毛頂端至絨毛基部）、肌肉層厚度及腸絨毛數(shù)量（每張圖片隨機取10個點測定后取平均值）。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)使用“平均值±標準差”表示，數(shù)據(jù)用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，若差異顯著，則進一步采用Duncans'法進行多重比較分析組間差異性，P＜0.05表示具有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 FPKW 添加比例對“中科3 號”異育銀鯽肝臟顯微結(jié)構(gòu)的影響(見圖1)

由圖1 可知，0%、3%～12% FPKW 組鯽魚肝細胞排列整齊，界限清晰，肝細胞索明顯，肝血竇，少量細胞具有脂肪粒。15% FPKW組肝細胞核偏移，肝細胞被脂肪粒填充，細胞腫大。30% FPKW組肝臟細胞脂肪變性，肝細胞核溶解或變形。

2.2 FPKW 添加比例對“中科3 號”異育銀鯽腸道顯微結(jié)構(gòu)的影響（見圖2、表2）

由圖2 可知，對照組腸絨毛細胞結(jié)構(gòu)完整，細長且呈指狀，形態(tài)較好，可見少量杯狀細胞，上皮細胞核整齊有序排列在細胞基部，紋狀緣完整，杯狀細胞稀疏分布，3%～12% FPKW 組腸絨毛形態(tài)細長，上皮細胞核排列混亂，紋狀緣完整，由表2 可以看出，3%～12% FPKW組腸絨毛高度及數(shù)量均高于對照組，肌層厚度則低于對照組。15%和30% FPKW 組腸絨毛寬厚且短，固有層變寬，上皮細胞核排列混亂，杯狀體顯著增多，腸絨毛高度均高于對照組但低于12% FPKW組，腸絨毛數(shù)量均低于其他組別，30% FPKW 組肌層厚度顯著高于其他組(P＜0.05)。

圖1 飼料中添加不同比例廚余發(fā)酵產(chǎn)物對異育銀鯽肝臟組織的影響(×400)

圖2 飼料中添加不同比例廚余發(fā)酵產(chǎn)物對異育銀鯽腸道組織的影響(×400)

表2 不同比例廚余發(fā)酵產(chǎn)物對異育銀鯽腸道結(jié)構(gòu)的影響

2.3 FPKW 添加比例對“中科3 號”異育銀鯽腎臟顯微結(jié)構(gòu)的影響(見圖3)

對照組腎臟結(jié)構(gòu)正常，腎小球、近端小管、遠端小管結(jié)構(gòu)完整清晰，可見致密斑；3%～12% FPKW 組腎臟結(jié)構(gòu)清晰完整，腎皮質(zhì)結(jié)構(gòu)完整，其中9% FPKW組可見部分細胞毛細血管擴張或出血，12% FPKW組可見細胞纖維化，腎小管腫大；15% FPKW 組腎組織淤血壞死，炎性細胞浸潤，近端小管、遠端小管腫大或壞死；30% FPKW組腎組織淤血或壞死，組織纖維鈣化，炎性細胞大量滋生，腎小體、腎小管細胞腫大或壞死。

圖3 飼料中添加不同比例廚余發(fā)酵產(chǎn)物對異育銀鯽腎臟組織的影響(×400)

3 討論

隨著FPKW 添加量從0%增加至12%時，“中科3號”異育銀鯽的肝臟、腸、腎臟細胞顯微結(jié)構(gòu)完整，細胞形態(tài)較好，均無損傷，這暗示FPKW 作為一種鯽魚的飼料原料是可行的，試驗證實鯽魚飼料中適量添加FPKW對鯽魚的生理代謝、消化性能并無任何不良影響，這與本研究中鯽魚的生長性能指標和酶活測定數(shù)據(jù)相一致。徐健[12]的研究，用發(fā)酵餐廚垃圾喂養(yǎng)黑水虻幼蟲，獲得了顯著的增重效果，且對黑水虻幼蟲成活率無不良影響，這也證實發(fā)酵后餐廚產(chǎn)物作為飼料或飼料原料的營養(yǎng)價值。魯琳等[13]將廚余垃圾經(jīng)微生物發(fā)酵后用于虹鱒魚飼料，研究也證實適量的廚余發(fā)酵產(chǎn)物對虹鱒生長性能有一定促進作用，鑒于冷水魚類對飼料原料的使用更加嚴苛，這也充分說明了FPKW 可以作為水產(chǎn)動物，尤其是魚類的飼料來源。盡管魯琳等[13]對虹鱒的研究中，廚余垃圾最適添加量僅為2.5%，與本研究在鯽魚中的應(yīng)用研究有較大差異，造成這種差異最大的可能是虹鱒和鯽魚對天然餌料的選擇性和適應(yīng)性存在較大差異，在長期的進化中，魚類通常具有通過調(diào)整消化酶活性和消化道，尤其是肝腸組織結(jié)構(gòu)以適應(yīng)餌料（或飼料）變化的能力[14-15]。有研究證實，草食性魚類和雜食性魚類對碳水化合物和纖維素的適應(yīng)性和耐受性較強[16-18]，鯽魚是一種廣譜雜食性魚類，對餌料的來源和種類具有更強的耐受能力，尤其對碳水化合物和纖維素的適應(yīng)性較強。曾訓(xùn)江等[19]研究指出，湘云鯽魚幼魚對粗蛋白含量為27%的飼料中可消化碳水化合物的需要范圍為28.67%～34.74%，纖維素的適應(yīng)范圍為13.25%～18.91%。本試驗鯽魚飼料中廚余發(fā)酵產(chǎn)物添加量高達12%，均未對鯽魚的生長和臟器細胞形態(tài)造成不良影響，也從一個側(cè)面佐證了FPKW的營養(yǎng)成分和毒素分析。相比而言，虹鱒屬于冷水性偏肉食性魚類，對飼料更為挑剔，對飼料中纖維素、淀粉含量以及蛋白質(zhì)、脂肪的品質(zhì)都較為敏感，尤其是一些毒素都更加敏感，這或許是造成添加量差異的重要原因。此外，本研究好氧發(fā)酵工藝是在相對封閉的箱體中，菌種發(fā)酵條件穩(wěn)定，受到環(huán)境有害微生物的污染大大減少，從而有效避免了廚余垃圾發(fā)酵過程中因污染而導(dǎo)致有害有毒物質(zhì)的滋生，也是導(dǎo)致添加量顯著增加的一個原因。本試驗中3%～12%FPKW 組鯽魚肝臟、腸道及腎臟顯微結(jié)構(gòu)形態(tài)無損傷也可能與FPKW 的處理方法有關(guān)。有研究表明，發(fā)酵飼料不僅可以提高鯉魚餌料利用率還可以提高其消化功能和非特異性免疫機能[20]。馮建等[9]用發(fā)酵豆粕替代魚粉的實驗中，發(fā)酵豆粕超過30%時會對大黃魚幼魚肝臟造成損傷，這與鯽魚顯微組織切片觀察的結(jié)果一致。

腸絨毛數(shù)量以及腸肌層厚度直接影響著機體消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力[21]，有大量研究表明，部分甘油酯及不飽和脂肪酸能促進腸道結(jié)構(gòu)發(fā)育，提高腸道抗氧化及免疫功能，對保護魚類腸道健康有顯著作用[22-23]。有研究證實大豆黃酮可促進大菱鲆（Scophthalmus maximus）腸道組織結(jié)構(gòu)的發(fā)育成熟，腸絨毛長度的增加[24]；膽汁酸可促進齊口裂腹魚（Schizothorax prenanti）腸絨毛數(shù)量的增加[25]等。本試驗中隨著FPKW 添加比例達到9%時，異育銀鯽腸組織切片中呈現(xiàn)出腸絨毛高度增加，肌層厚度降低，絨毛數(shù)量增多等特征，這說明適當?shù)腇PKW對異育銀鯽的腸道生長發(fā)育與吸收能力有一定促進作用，而廚余中食物來源較復(fù)雜，通常都存在一定量的豆制品，是否與某些特殊的物質(zhì)有關(guān)，還有待進一步研究證實。

本試驗中廚余物的主要來源為餐廚垃圾，其中含有大量油脂和脂肪酸，同時也含有大量鹽分。15%和30% FPKW組腸道組織杯狀細胞顯著增多，上皮細胞核增加，這可能與FPKW 中的高油脂、脂肪酸敗有一定關(guān)系。腸上皮細胞不僅能起到消化作用還具有免疫作用，當腸上皮細胞受損或受到炎性細胞侵擾時，它將通過來源于隱窩的干細胞增殖、分化、遷移來補充維持組織更新[26]，在腸道黏膜受損時，杯狀細胞分泌的三葉狀蛋白可與細胞因子和生長因子發(fā)生協(xié)同作用，加快上皮細胞的愈合[27]。丙二醛是脂質(zhì)氧化的終產(chǎn)物，有研究證實丙二醛（MAD）可以對草魚腸道黏膜屏障造成損傷[28]，這可能引發(fā)了腸上皮細胞免疫機制使得上皮細胞核及杯狀細胞顯著增多，從腸道切片可知FPKW 不超過12%時未引起異育銀鯽腸道結(jié)構(gòu)的明顯變化，這可能是魚類腸道微生物數(shù)量龐大且復(fù)雜，其組成變化與環(huán)境因子及宿主個體密切相關(guān)，在維持腸道健康，促進腸道發(fā)育，抵抗病原入侵，調(diào)節(jié)機體能量吸收和脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮著重要作用，對某些不利因子具有一定耐受限度[29-30]。另外FPKW中的高油脂可能也是引起鯽魚肝細胞脂肪性變性，肝細胞被脂肪滴填充腫大或壞死特征的主要因素，有研究表明，飼料中脂肪含量過高會造成飼料效率及蛋白質(zhì)效率降低并使腹腔體脂過度沉積[31]，對鯽魚的肝臟造成損害。廚余物添加飼料中的高油脂可能部分被氧化，過多的氧化油脂若不能被肝臟中抗氧化酶及時有效分解，將會引起鯽魚氧化應(yīng)激反應(yīng)而使肝臟受到損傷。如任澤林等[32]用氧化魚油飼喂鯉后發(fā)現(xiàn)鯉肝胰臟細胞受損。

在本研究中，15%、30%FPKW 組腎小體、腎小管細胞腫大，炎性細胞大量滋生，組織纖維鈣化、淤血或壞死，這可能與FPKW 中的高鹽分性質(zhì)有關(guān)，大量的流行病學(xué)調(diào)查及實驗研究表明鹽作為重要的環(huán)境因素，在高血壓的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[33-34]。這不僅影響了血壓調(diào)節(jié)，而且還可能獨立于血壓對心、腦、腎等器官的損害產(chǎn)生作用。國內(nèi)外文獻報道，高鹽可誘導(dǎo)高血壓大鼠腎臟纖維化[35-37]。鯽魚可能因長期食入高鹽飼料，引起腎組織負擔加重，腎臟受損。Galat 等[38]和林華英等[39]分別在研究鹽度對褐色鮭(Salmo clarki lewisi)和鱸（Micropterus salmonides）腎組織結(jié)構(gòu)影響時也發(fā)現(xiàn)其在高鹽條件下，魚的腎組織退化，腎小球縮小甚至消失，腎小管縮短等病理現(xiàn)象。

4 結(jié)論

綜上所述，廚余發(fā)酵產(chǎn)物在飼料中的添加比例不超過12%是可行的。