葉綠素及其在動物生產(chǎn)中的應用

■王賀澤 丁宏標 李習龍 畢研亮

（中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所，北京100081）

植物色素主要有類胡蘿卜素、葉黃素、花青素、姜黃素、葉綠素等，它們是主要起著色作用的植物次生代謝物，同時還具有抗氧化等多種活性[1]。葉綠素是一種雙羧酸的酯，其中一個羧基被甲醇所酯化，另一個羧基被葉綠醇所酯化，頭部含有一個卟啉環(huán)，有極性，尾部是葉綠醇（植醇）。葉綠素是高等植物、藻類、細菌進行光合作用的主要色素，可以分為葉綠素a、b、c、d、f 以及原葉綠素和細菌葉綠素等，其中葉綠素a 和葉綠素b 是高等植物葉綠體中主要的葉綠素。

早在1940 年，Gruskin[2]研究發(fā)現(xiàn)葉綠素可以用來治療胃腸道疾病、癌癥、貧血。在1998 年，Kiyoka等[3]發(fā)現(xiàn)綠茶中的葉綠素a 和葉綠素b 對12-氧-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯（TPA，12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate）誘導的腫瘤呈劑量依賴性抑制作用。Huws 等[4]發(fā)現(xiàn)了原生動物中多不飽和脂肪酸的含量與葉綠體有關。植烷酸的含量和葉綠素的含量有關，青綠飼料中富含葉綠素，有研究表明與飼喂混合日糧相比，飼喂青綠飼料奶牛的牛奶中的植烷酸含量從150 mg/100 g增加到450 mg/100 g[5]。近來也有越來越多的研究表明葉綠素與動物和人類的健康密切相關，Xie 等[6]發(fā)現(xiàn)葉綠素可以促進小鼠肝臟和腎臟中鉛的排泄，減少鉛的積累。Suparmi等[7]發(fā)現(xiàn)給小鼠注射葉綠素可以提高血紅蛋白和鐵蛋白水平，有可能治療溶血性貧血。但是目前關于葉綠素的研究還很少，本文旨在對葉綠素的專利技術進行分析和總結，為葉綠素的進一步研究提供了參考。

1 專利申請情況

利用中外文數(shù)據(jù)庫檢索了近年來與葉綠素相關的專利申請情況，并且對其進行了統(tǒng)計分析。1960年，美國最先申請了從木瓜中回收葉綠素方法的專利，而1985 年我國首次申請葉綠素從蠶沙中提取的專利。通過對2010 年至2018 年專利申請數(shù)量的分析，發(fā)現(xiàn)與葉綠素有關的專利申請量每年持續(xù)上升，表明研究者對本領域的關注度越來越高。從不同國家專利申請量來看，中國雖然申請時間較晚，但是申請量位居第一，約占47%，說明近年我國在葉綠素方面的研究不斷取得新的進展。

通過對已經(jīng)公布的專利分析發(fā)現(xiàn)，專利申請主要集中于以下幾個領域：葉綠素提取和純化的方法、葉綠素及其衍生物的應用、檢測葉綠素含量的方法及裝置等，其中前兩者專利申請數(shù)量較多，近年來已經(jīng)成為熱門的研究方向。

2 葉綠素來源

葉綠素廣泛存在于綠色植物中，生產(chǎn)中用于提取葉綠素的原料主要有蠶沙（蠶的糞便）、蔬菜、小球藻、植物葉片等，其中小球藻是自然界中葉綠素含量最高的生物，大約為4%～6%。而目前國內工業(yè)上提取葉綠素大部分使用蠶沙，蠶絲業(yè)是我國的傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)，每年蠶的養(yǎng)殖量不斷增加，因此蠶沙產(chǎn)量很大，但是大部分蠶沙沒有得到充分的利用，僅僅用作肥料、飼料。蠶沙便宜易得，而且葉綠素含量很高，利用蠶沙不僅可以得到富含葉綠素的產(chǎn)品，使用過的蠶沙還可以繼續(xù)用作肥料，這樣使蠶沙得到了合理充分地利用，提高了其經(jīng)濟價值，但是蠶沙也存在一些缺點：原料比較分散、容易受季節(jié)和天氣的限制等。

3 葉綠素提取方法

近年隨著研究的深入和技術的發(fā)展，研究者發(fā)明了多種提取方法，使葉綠素提取工藝流程不斷地得到完善。

3.1 有機溶劑萃取

有機溶劑萃取是傳統(tǒng)提取葉綠素常用的方法，主要工藝流程包括浸提、濃縮、洗滌、干燥等，最常用的有機溶劑有石油醚、乙醇、丙酮等。例如1992 年，公開號為CN1063704 的專利采用有機溶劑萃取的方法從竹葉中獲得葉綠素液[8]，這種方法操作復雜，提取速度較慢，耗時比較長，葉綠素容易受到破壞，提取的葉綠素純度不高，而且有機溶劑成本高、毒性大，殘留的溶劑還會對環(huán)境造成污染。

3.2 超臨界流體萃取

公開號CN101648955 利用超臨界流體萃取葉綠素的方法[9]，其是在室溫條件下利用無色、無味、無毒的CO2作為提取介質進行萃取，這種方法通過改變溫度和壓力就可以使溶劑在超臨界CO2流體中的溶解度大幅度改變，從而為物質的提取提供了更多的可能。與傳統(tǒng)提取方法相比，超臨界流體萃取極大地簡化了生產(chǎn)流程，提高了生產(chǎn)效率，而且CO2不會對環(huán)境造成污染，價格較低，可以循環(huán)使用，大大降低了生產(chǎn)成本。

3.3 超聲波提取

超聲波提取是近來應用越來越廣泛的一種方法，超聲波可以破碎細胞壁，加速細胞內物質的釋放，縮短提取時間。例如公開號CN103145718A 使用了超聲波提取葉綠素，在短時間內獲得了大量的葉綠素，并且發(fā)現(xiàn)超聲波時間為15 min 時葉綠素含量最高[10]。公開號CN106854209A 將振蕩提取、超聲波提取、振蕩結合超聲波提取三種方式進行比較，發(fā)現(xiàn)兩種方式聯(lián)合起來提取的葉綠素含量最高[11]。

3.4 其他提取方法

公開號CN1078750，該專利將水作為溶劑，通過結合酶工程技術，從蠶沙中制取葉綠酸鹽[12]，極大地降低了生產(chǎn)成本，節(jié)約了資源，同時減少了生產(chǎn)設備的資金投入。公開號CN1634920、CN102093369A 在提取葉綠素前，增加了微波預處理的工藝，破壞了組織細胞，使提取時間和有機溶劑使用量大大減少，提高了提取效率，使葉綠素提取工藝得到了一定的改善[13-14]。公開號CN102206221A 使用無機堿法提取葉綠素[15]，相對于超臨界流體萃取成本較低，而且獲得的產(chǎn)品中不會殘留有機溶劑。 公開號CN103641837A 采取酶解法[16]，使用酶將原料中的大分子物質進行酶解，在較短的時間內可以提取大量的葉綠素。

4 葉綠素及其衍生物的應用

葉綠素極不穩(wěn)定，光、熱、酸、堿等一些理化因素都會使其分解，因此在提取過程中容易使葉綠素受到破壞，這給葉綠素的應用帶來了很大的困難，所以常常制成葉綠酸鹽后應用于食品、醫(yī)藥、保健等方面，不僅保留了葉綠素原有的卟啉環(huán)結構，保持了綠色，而且提高了其穩(wěn)定性和水溶性，有利于葉綠素更廣泛的應用。生產(chǎn)中通常將葉綠素浸提液或葉綠素浸膏通過皂化、酸化等一系列步驟，用銅、鋅等其他金屬元素代替葉綠素中的鎂離子來制取葉綠素衍生物。

4.1 食品添加劑

在食品加工過程中通常會通過添加色素來改善食品的色澤，目前市場上色素主要包括天然色素和合成色素兩種，合成色素中含有苯環(huán)等許多對人體有害的基團，攝入量過多，對人體有很大的危害，目前一些國家已經(jīng)禁止使用合成色素。而天然色素是從天然資源中提取的色素，安全、無毒副作用，深受廣大消費者的青睞。例如公開號CN103509028A 使用傳統(tǒng)的葉綠素提取方法，再進行銅代制備了葉綠素銅鈉鹽，可以作為食品的著色劑，用于糕點、糖果等食品中改善其色澤[17]。

4.2 保健治病

葉綠素衍生物對人體有許多益處，可以抗腫瘤、抗菌、促進傷口愈合、保護肝臟、治療貧血等疾病。缺鐵是全世界最普遍的微量營養(yǎng)素缺乏，卟啉鐵是營養(yǎng)學家普遍認為治療貧血的最有效的鐵源。例如，公開號CN104370923A 用二價鐵離子代替鎂離子，制備了葉綠素鐵鋅鹽[18]，公開號CN101671341 利用富含葉綠素的原料和硫酸亞鐵制備鐵葉綠素[19]，可以促進血紅蛋白的合成，對治療缺鐵性貧血和再生障礙性貧血有顯著的效果。葉綠素對鐵的調節(jié)有雙重作用，公開號CN106902111A 發(fā)現(xiàn)葉綠素還可以促進鐵的排泄，防止鐵過載造成的肝臟、腎臟損傷，而且無副作用[20]。公開號CN1406940 發(fā)明了葉綠素鉻的制備方法，制造出了具有生物活性的葉綠素鉻[21]，其操作簡便、成本極低、毒性較低，可用于治療糖尿病、新生兒黃疸等疾病。公開號CN102199153A 制備的葉綠素銅鈉鹽在醫(yī)藥上得到了廣泛的應用，不僅可以用作食品添加劑、著色劑，還具有抗癌、抗氧化、抗腫瘤等作用[22]。公開號CN110090210A 發(fā)現(xiàn)給存在急性微循環(huán)障礙的動物注射葉綠素衍生物，血流灌注量、血細胞聚集程度、血細胞運動速率都有所下降[23]，這表明葉綠素衍生物對改善腸系膜微循環(huán)障礙有明顯的效果。

4.3 飼料添加劑

目前使用的飼料中添加了許多化學物質、人工合成物質等，這些成分會對動物的生長發(fā)育和內分泌產(chǎn)生不利的影響，其中一些有害的化學成分還會隨著人們的食用進入人體內，從而危害人體的健康。公開號CN101318963A 將從劍、蕃麻葉中提取的葉綠素直接作為飼料添加劑[24]，不僅充分利用了劍、蕃麻葉原料，而且減少了麻渣對環(huán)境的污染。公開號CN106578367A 制備了適用于多類飼料的葉綠酸鹽[25]，不僅天然、無毒副作用，而且可以提高動物的免疫力，促進動物的生長，改善畜產(chǎn)品的品質。隨著近來食品安全事件的頻繁出現(xiàn)，人們對畜產(chǎn)品質量的關注度也越來越高。畜禽的肌纖維數(shù)量、肌氨酸和硫胺素含量等都會影響畜禽肉品質、風味、口感。公開號CN106632359A 從桑葉渣中提取了脫鎂葉綠素，并將其和富馬酸亞鐵等物質結合使用后，減小了肌纖維的直徑，增加了肌氨酸和硫胺素含量，從而改善了肉品質、風味、口感[26]。公開號CN107912606A 在半干青貯飼料中添加葉綠素銅鈉鹽，有利于維持動物腸道菌群的平衡[27]。公開號CN105995142A 發(fā)現(xiàn)在鴨飼料中添加菠菜葉綠素，鴨的產(chǎn)蛋率提高了34.56%，而且鴨蛋品質也得到了改善[28]。

4.4 其他作用

葉綠素已經(jīng)廣泛應用于日常用品中，例如，公開號CN107325106A 利用紅豆杉制備了葉綠素浸膏用于化妝行業(yè)中，具有美容養(yǎng)顏、抗皺、抗衰老的功效[29]。公開號CN101559031 首次發(fā)明了富含葉綠素銅鈉的新型花露水[30]，無毒，無刺激，不僅可以驅蚊止癢，還有提高免疫力，抗?jié)兊茸饔?。近幾年還有許多專利發(fā)明了含有葉綠素的牙膏，具有祛除口臭、殺菌消炎、除菌斑、保護牙齒健康的功效。

5 小結

隨著科研工作者不斷深入地研究，葉綠素的提取方法不斷得到改善，而且有越來越多的研究者將葉綠素作為飼料添加劑研究其對動物機體的作用。開發(fā)天然色素不僅可以充分地利用自然資源，降低生產(chǎn)成本，還可以減少環(huán)境污染，同時青綠飼料中含有豐富的葉綠素，但是養(yǎng)殖行業(yè)趨向于集約化大規(guī)模發(fā)展，使青綠飼料使用量大大減少，開發(fā)葉綠素可以避免飼料添加劑的過度使用，從而生產(chǎn)出綠色健康的畜產(chǎn)品。但是目前還有以下幾個方面有待進行研究：葉綠素作為飼料添加劑的最佳添加水平；葉綠素對動物的生長性能及其他方面的影響；葉綠素在動物機體的作用途徑和機制。因此對于葉綠素還需要做進一步的研究，以最大限度地發(fā)揮葉綠素在動物生產(chǎn)中的應用潛力。