馬鈴薯細菌多樣性解析及促生高產(chǎn)IAA菌株的篩選

崔偉國，尹彥舒，張方博，崔 曼，楊 茉，張樹清，鄭紅麗*，高 淼*

（1．內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2．中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點實驗室，北京 100081）

馬鈴薯是繼小麥、水稻和玉米之后的世界第四大糧食作物［1］。馬鈴薯種植戶為了追求更高的產(chǎn)量和效益，種植中大量使用化肥，導致土壤板結(jié)、肥料利用率降低、環(huán)境污染等諸多問題。用微生物肥料替代化學肥料，既可以促進作物生長、改善土壤，又可以減少環(huán)境污染［2-3］。植物促生菌對植物的促生作用是通過多種機制和途徑實現(xiàn)的［4］。研究發(fā)現(xiàn)，某些微生物可以產(chǎn)生植物生長激素吲哚乙酸（IAA）［5］，IAA參與了許多生理生化過程的調(diào)節(jié)與控制，具有廣泛的生理作用，IAA可以促進細胞分裂、葉片增大、莖伸長、不定根的形成、種子的生長、果實的生長、座果和頂端優(yōu)勢等［6］，對于促進植物生長具有重要作用；某些微生物會產(chǎn)生1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）脫氨酶，它可以降解乙烯的合成前體ACC，并減少逆境條件下乙烯的產(chǎn)生量［7］；還具有溶磷的能力，能夠?qū)⑼寥乐须y以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為植物可吸收利用的狀態(tài)［8］。植物根系周圍存在著數(shù)以萬計的IAA產(chǎn)生菌，包括Pseudomonas，Rhizobium，Azospirillum，Enterobacter，Azotobacter，Klebsiella，Alcaligenes，Pantoea 和 Streptomyces［9］。林英等［10］從香樟根際土壤分離的產(chǎn)IAA菌株，經(jīng)16S rDNA分子鑒定屬于Bacillus，Pseudomonas和Lysinibacillus 3個屬。王嬌等［11］從七葉樹的根莖中分離、篩選出的高產(chǎn)IAA的菌株，經(jīng)鑒定屬于Bacilluc，Leclercia，Pantoea和Morganella 4個屬。本文從馬鈴薯根際土壤和葉片中用不同的培養(yǎng)基分離馬鈴薯優(yōu)勢細菌，分析馬鈴薯細菌的多樣性；從中篩選高效分泌IAA菌株，研究其促生特性和對馬鈴薯幼苗促生能力，為馬鈴薯及其它植物研制微生物菌肥提供資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源

馬鈴薯植株和根際土壤樣品于2018年6月30日，采自河北省張家口市沽源縣的馬鈴薯大田。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

土壤浸提液培養(yǎng)基，R2A瓊脂培養(yǎng)基［12］，阿須貝培養(yǎng)基［13］，DF培養(yǎng)基［14］，無機磷培養(yǎng)基和有機磷培養(yǎng)基［15］，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，配方詳見上述參考文獻。

ADF培養(yǎng)基：將1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）溶于超純水，用細菌濾器進行抽濾滅菌，加到不含（NH4）2SO4的無菌DF培養(yǎng)基中，使ACC終濃度為3.0 mmol/L。

1.2 試驗方法

1.2.1 馬鈴薯細菌的分離

稱取10 g馬鈴薯根際土土壤樣品，加入裝有玻璃珠的90 mL無菌水中，180 r/min充分振蕩0.5 h，即根際土母液菌懸液；馬鈴薯葉片內(nèi)生菌的分離：從馬鈴薯植株取完整的葉片10 g，將葉片清洗干凈后，采用超聲波表面滅菌法進行表面滅菌，然后將葉片放入研缽充分研磨后加到帶玻璃珠的90 mL的無菌水中，180 r/min充分振蕩0.5 h，即葉片母液菌懸液。將上述菌懸液分別用無菌水稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4和10-5梯 度， 取10-3、10-4、10-53個連續(xù)的稀釋度100 μL在已經(jīng)制備好的固體培養(yǎng)基平板上進行涂布，每個梯度設置3個重復。同時以無菌蒸餾水作空白對照，所有平板放置于30℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d后，挑選顏色、形態(tài)不同的細菌單菌落進行平板劃線，純化以后轉(zhuǎn)入甘油管進行保存，即分離到馬鈴薯根際土壤和葉片中的細菌。

1.2.2 細菌16S rDNA基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育分析

16S rDNA基因擴增、序列測定參考文獻［16］，測序結(jié)果上傳至http：//ezbiocloud.net/數(shù)據(jù)庫進行比對。用MEGA7.0（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）軟件，采用鄰近法（Neighbor-Joining）聚類分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值為1 000。

1.2.3 產(chǎn)IAA能力測定

產(chǎn)IAA細菌的定性測定：將分離純化后的細菌接種于含L-色氨酸（100 mg/L）的液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min的搖床中黑暗震蕩培養(yǎng)24 h后，取50 μL菌懸液滴于白色陶瓷板上，同時加入50 μL Salkowski比色液（50 mL 35% HClO4+1 mL 0.5 mol/L FeCl3）。并加入50 μL未接菌的液體培養(yǎng)基與等體積的混合溶液為對照。將充分混合的白色陶瓷板放置于室溫避光處，30 min后觀察結(jié)果，顏色變紅者表示能夠產(chǎn) IAA［17］。

產(chǎn)IAA細菌的定量測定：對初篩獲得的產(chǎn)IAA的細菌進行定量測定，培養(yǎng)條件同上。每株菌3個重復，先測定培養(yǎng)了24 h的菌懸液的OD600值，計算菌體的生長，然后將菌懸液以10 000 r/min離心10 min后，取上清液加入等體積Salkowski比色液，避光靜置30 min，取出立即測定其OD530值，以加了比色液的CK調(diào)零，計算IAA的產(chǎn)量。計算菌濃度OD600值為1時，單位體積發(fā)酵液中IAA的含量。標準曲線的繪制采用分析純的IAA梯度稀釋制備。

1.2.4 產(chǎn)ACC脫氨酶能力測定

參考Glick的方法［18］，將分離到的產(chǎn)IAA的菌株先接種于ADF培養(yǎng)基中，以空白ADF培養(yǎng)基作為陰性對照，初步篩選ACC脫氨酶陽性菌株。菌體蛋白含量測定采用比色法，測定595 nm處的吸光度值；以α-酮丁酸為底物，用紫外分光光度計調(diào)零，測定540 nm處的吸光度值，對照α-酮丁酸標準曲線和牛血清白蛋白測定標準曲線計算菌株的ACC脫氨酶活性。ACC脫氨酶表示方法為：反應條件下，每毫克菌體蛋白每小時催化ACC脫氨形成α-酮丁酸的微摩爾數(shù)，單位：μ mol/（mg蛋白質(zhì)·h）。

1.2.5 溶磷能力測定

將馬鈴薯產(chǎn)IAA菌株用移液槍吸取3 μ L于無機磷和有機磷培養(yǎng)基平板上［19］，每個菌株設置3個重復，將平板置于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周后觀察，菌株周圍是否有溶磷圈的形成及其直徑大小，以此來判斷該菌株有無溶磷能力。

1.2.6 產(chǎn)IAA細菌對馬鈴薯幼苗促生效果研究

促生試驗：第一輪處理接種產(chǎn)IAA的7株菌， 分 別 是MLS-34-25、MLS-34-46、MLS-34-71、MLS-34-77、MLS-34-79、MLS-35-3、MLS-35-18，每個處理設置3個重復；對照組，不接菌。第二輪處理接種2株菌，分別是MLS-34-25和MLS-34-79，每個處理設置3個重復；對照組，不接菌。將菌株接于液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)3 d，使發(fā)酵液濃度為1.0×109～9.0×109cfu/mL，保存?zhèn)溆谩?/p>

將種植馬鈴薯的土壤進行高溫滅菌，按照土壤、蛭石體積比2∶1進行混合，裝盆待用。

馬鈴薯出芽以后，切取大小一致的帶芽的馬鈴薯薯塊進行播種。每盆種植一顆馬鈴薯種子。當馬鈴薯出苗兩周以后，挑取長勢一致的幼苗，以灌根法每盆分別接種上述菌液100 mL，對照組加100 mL清水。30 d后，觀察馬鈴薯的生長情況，測定其株高，地上部分鮮重和干重，分析不同產(chǎn)IAA的菌株對馬鈴薯生長的影響。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

單因素方差分析采用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗（F＜0.05），其中P＜0.05代表存在顯著性差異。多組樣本間差異顯著性分析在SPSS里采用Duncan’s multiple range test對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯細菌的分離及16S rDNA的鑒定

本文采用不同的培養(yǎng)基從河北省張家口市沽源縣的馬鈴薯根際土壤和葉片中共分離到馬鈴薯優(yōu)勢細菌78株。分別以78株細菌的總DNA為模板，采用16S rDNA基因通用引物27F和1492R，PCR擴增到16S rDNA基因大小約1.5 kb，菌株全部測序成功。序列結(jié)果經(jīng)http：//ezbiocloud.net/數(shù)據(jù)庫進行比對，基于最高相似度菌株結(jié)果顯示：78株馬鈴薯細菌屬于19個屬（表1）。優(yōu)勢菌屬是Pantoea，占菌株總數(shù)的55.13%。馬鈴薯根際土用土壤浸提液培養(yǎng)基分離出1株優(yōu)勢細菌，占菌株總數(shù)的1.28%，屬于Pseudarthrobacter 1個菌屬；馬鈴薯根際土用R2A瓊脂培養(yǎng)基分離出27株優(yōu)勢細菌，占菌株總數(shù)的34.62%，屬于Pantoea，Stenotrophomonas，Lysobacter，Arthrobacter，Bacillus，Klebsiella，Pseudomonas，Brevibacterium，Chitinophaga，Microbacterium，Myroides，Rhodococcus，Sphingopyxis 13個菌屬；馬鈴薯根際土用阿須貝培養(yǎng)基分離出31株優(yōu)勢細菌，占菌株總數(shù)的39.74%，屬于 Pantoea，Pseudomonas，Ensifer，Mesorhizobium，Stenotrophomonas，Chitinophaga，Sphingobacterium，Agromyces，Variovora 9個菌屬；馬鈴薯葉片內(nèi)生菌用阿須貝培養(yǎng)基分離出19株優(yōu)勢菌，占菌株總數(shù)24.36%，屬于Pantoea，Bacillus，Pseudomonas 3個菌屬。采用鄰近法，將78株馬鈴薯細菌及其最高相似度菌株16S rDNA基因序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析（圖 1）。

圖1 馬鈴薯產(chǎn)IAA菌及其最高相似度菌株16S rDNA基因序列基于鄰近法的系統(tǒng)進化發(fā)育樹

表1 馬鈴薯78株細菌的分類信息表

2.2 馬鈴薯細菌產(chǎn)IAA能力研究

以分離獲得的78株馬鈴薯細菌為供試菌株，采用Salkowski比色液顯色法定量測定菌株產(chǎn)IAA能力。結(jié)果顯示：78株馬鈴薯細菌中，有58株細菌具有分泌IAA的能力，占菌株總數(shù)的74.36%，其中從馬鈴薯根際土篩選出42株產(chǎn)IAA細菌，屬于Pantoea，Bacillus，Pseudomonas，Arthrobacter，Klebsiella，Sphingobacterium，Brevibacterium，Lysobacter，Mesorhizobium，Microbacterium，Pseudarthrobacter，Sphingopyxis，Stenotrophomonas 13個菌屬；從馬鈴薯葉片篩選16株產(chǎn)IAA細菌，屬于Pantoea，Bacillus 2個菌屬。不同菌株產(chǎn)IAA的能力有很大的差異，供試菌株產(chǎn)IAA的分泌量在（0.80±0.07）～（40.27±5.73）μg/mL之間，菌株Pantoea sp. MLS-35-3分泌IAA能力最強，分泌量為（40.27±5.73）μ g/mL（表2）。根據(jù)菌株產(chǎn)IAA能力強弱和分離部位及分離培養(yǎng)基的差異，選擇7株菌進行促生特性和馬鈴薯盆栽幼苗促生能力等研究，其中菌株Pantoea sp. MLS-34-25和菌株Pantoea sp.MLS-34-46由阿須貝培養(yǎng)基分離自馬鈴薯根際土壤，菌株Arthrobacter sp. MLS-34-71、Pantoea sp. MLS-34-77和Pantoea sp. MLS-34-79由R2A培養(yǎng)基分離自馬鈴薯根際土壤，菌株Pantoea sp. MLS-35-3和菌株Pantoea sp. MLS-35-18由阿須貝培養(yǎng)基分離自馬鈴薯葉片內(nèi)生菌。

表2 馬鈴薯78株細菌產(chǎn)IAA能力

2.3 產(chǎn)ACC脫氨酶能力研究

通過對馬鈴薯7株產(chǎn)IAA細菌的篩選，結(jié)果顯示有6株菌具有產(chǎn)ACC脫氨酶能力，其中菌株Pantoea sp. MLS-34-46的產(chǎn)量最高，達到了（2.648±0.057）μmol/（mg蛋白質(zhì)·h）（表 3）。

表3 產(chǎn)IAA菌的功能特性

2.4 菌株的溶磷能力研究

經(jīng)溶磷圈法檢測，在7株產(chǎn)IAA細菌中，有1株細菌具有溶解無機磷的能力，為菌株Pantoea sp.MLS-34-77；有2株細菌具有溶解有機磷的能力，為菌株Pantoea sp. MLS-34-77和菌株Pantoea sp. MLS-34-79。其中菌株Pantoea sp. MLS-34-77既可以溶解無機磷，也可以溶解有機磷（表3，圖2，圖3）。

圖2 產(chǎn)IAA菌株無機磷溶磷效果圖

圖3 產(chǎn)IAA菌株有機磷溶磷效果圖

2.5 產(chǎn)IAA菌株對馬鈴薯幼苗的促生效果研究

第一輪產(chǎn)IAA菌株對馬鈴薯溫室幼苗促生試驗：以7株高效分泌IAA的馬鈴薯細菌為供試菌株，采用溫室馬鈴薯盆栽實驗，研究菌株對馬鈴薯幼苗的促生能力。從表4可以看出，與對照組相比，6株菌可以促進馬鈴薯幼苗株高的生長，其中菌株Pantoea sp. MLS-34-79和菌株Pantoea sp.MLS-35-18長勢較好，與對照組相比達到了顯著性水平，增長率分別為40.87%和47.83%；從地上部鮮重觀察，7株菌處理以后的馬鈴薯植株都高于對照組，菌株Pantoea sp. MLS-35-3增產(chǎn)率最高，增加了65.37%，菌株Pantoea sp. MLS-34-25和菌株Arthrobacter sp. MLS-34-71增產(chǎn)率分別為49.15%和40.12%；7株菌處理以后的地上部干重均高于對照組，其中菌株Pantoea sp. MLS-35-3達到了顯著性差異，增產(chǎn)率為94.51%，菌株Pantoea sp. MLS-34-25和菌株Pantoea sp. MLS-34-77增產(chǎn)率均為49.45%（表4，圖4）。

從株高、地上部分鮮重和干重綜合分析，選取菌株Pantoea sp. MLS-34-25和菌株Pantoea sp.MLS-34-79進行第二輪馬鈴薯幼苗的促生實驗，以此來驗證第一輪的促生試驗結(jié)果，以期望獲得具有穩(wěn)定促進馬鈴薯植株生長的菌株。結(jié)果顯示，菌株Pantoea sp. MLS-34-25和菌株Pantoea sp. MLS-34-79均能夠顯著增加馬鈴薯植株的株高和地上部鮮重，菌株Pantoea sp. MLS-34-25表現(xiàn)出了較好的促生效果，株高增長率達到了71.50%，地上部鮮重增產(chǎn)率達到了86.38%，地上部干重增產(chǎn)率為41.89%。與對照相比，菌株Pantoea sp. MLS-34-25處理過后的植株長勢較好，葉片茂綠（表4，圖 5）。

表4 產(chǎn)IAA菌株對馬鈴薯盆栽幼苗促生試驗結(jié)果

圖4 產(chǎn)IAA菌株對馬鈴薯盆栽幼苗促生試驗效果圖（第一輪）

圖5 產(chǎn)IAA菌株對馬鈴薯盆栽幼苗促生試驗效果圖（第二輪）

3 討論與結(jié)論

絕大多數(shù)已被研究的高產(chǎn)IAA菌株主要屬于Pseudomonas、Bacillus、Azotobacter、Azospirrulam和Rhizobia菌屬［20］。隨著研究的深入，屬于不同菌屬的高產(chǎn)IAA菌株被報道。劉曉瑞［21］從水稻根際分離的95株細菌中，通過Salkowski試劑檢測IAA活性、水稻種子萌發(fā)和幼苗促生試驗等相關研究，篩選獲得6株產(chǎn)IAA菌，分別屬于Bacillus、Agrobacterium、Pseudomonas和Aeromonas。本研究從馬鈴薯根際土和葉片中共篩選出58株產(chǎn)IAA細菌，優(yōu)勢菌屬是Pantoea；其中從馬鈴薯根際土篩選出Pantoea、Bacillus、Pseudomonas等13個菌屬；從馬鈴薯葉片篩選出Pantoea、Bacillus 2個菌屬。在已知報道的產(chǎn)IAA菌株當中，不同菌株的IAA分泌水平有很大差異。例如，劉琳等［22］從春蘭獲得57株分泌IAA內(nèi)生細菌，其IAA分泌量為0.5～129.68 μg/mL。胡澤瑞等［23］從三葉鬼針草分離的7株產(chǎn)IAA菌中，其分泌量為57.48～312.22 μg/mL。本研究分離到的產(chǎn)IAA菌株分泌量為0.80～40.27 μ g/mL之間，低于其他文獻報道菌株。微生物促進植物生長的機制有多種，一種促生微生物可以兼具多種促生機制［24-25］。研究發(fā)現(xiàn)，ACC脫氨酶能夠降低植物對逆境的敏感性，提高植物抗逆能力［24］，而且可以促進有機物污染和重金屬污染土壤的植物修復［26］。Sarkar等［7］分離出一株耐鹽的ACC脫氨酶菌株P50，該菌株在鹽脅迫下促進了水稻幼苗的生長。本研究中的7株高產(chǎn)IAA馬鈴薯細菌中有6株具有產(chǎn)ACC脫氨酶能力，其中Pantoea sp. MLS-34-46的產(chǎn)量最高，達到了（2.648±0.057）μ mol/（mg蛋白質(zhì)·h）。磷是植物生長發(fā)育所需的重要元素之一，解磷微生物可以將難溶性磷源轉(zhuǎn)化成植物可吸收利用的磷［27］。本研究篩選到1株菌具有溶解無機磷的能力，2株菌具有溶解有機磷的能力。植物根際產(chǎn)IAA菌能夠分泌IAA促進生長，提高作物產(chǎn)量。例如，張東艷等［28］將產(chǎn)IAA菌株接種花生30 d以后，花生植株鮮重、干重及株高較對照處理分別增加76.2%、23.0%和23.0%。孟麗媛等［29］研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)IAA菌株對水稻幼苗初生根數(shù)、次生根數(shù)和莖干重的增長有明顯的促進效果。本研究通過兩輪溫室盆栽實驗，研究高產(chǎn)IAA菌株對馬鈴薯幼苗的促生效果，結(jié)果顯示，菌株Pantoea sp. MLS-34-25對馬鈴薯幼苗的株高、地上部鮮重和干重均具有明顯的促生效果，且兼具有較高的ACC脫氨酶活性（1.265±0.029）μ mol/（mg蛋白質(zhì)·h）。菌株Pantoea sp. MLS-34-25對馬鈴薯幼苗具有明顯的促生作用，是生產(chǎn)微生物肥料的潛在菌種。