PGPR復合菌劑對辣椒生長及根際土壤微生物結構的影響

黃文茂，易 倫，彭思云，黃承森，程代松，韓麗珍*

（1．貴州大學生命科學學院/農業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護與種質創(chuàng)新教育部重點實驗室，山地生態(tài)與農業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心，貴州 貴陽 550025；2．貴州遵義市播州區(qū)蔬菜產業(yè)發(fā)展中心，貴州 遵義 563100；3．貴州遵義山那邊生態(tài)農業(yè)有限公司，貴州 遵義 563112）

辣椒（Chilli）是一種喜中偏酸性砂壤植物［1］，是世界上最重要的蔬菜作物之一，因其富含維生素C和辛辣調味功能，所以在食材來源上備受關注［2-3］。近年來市場對辣椒需求量的激增，大量施用化學肥料成為了最直接的增產措施，但這也導致了種植成本投入增加、環(huán)境污染、土壤板結等一系列問題，同時還降低了果實的品質［4］。隨著農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的社會意識不斷增強，傳統(tǒng)的農業(yè)栽培措施（如化肥、化學殺蟲劑等）惡化生態(tài)環(huán)境所帶來的負面影響開始引起人們的重視［5］。因此，尋求一種能夠有效減少化肥用量、環(huán)境友好且符合農業(yè)可持續(xù)發(fā)展要求的新型肥料已成為農業(yè)生產及環(huán)境科學領域的一個熱點。

植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，簡稱PGPR）是指可直接或間接地促進植株生長的微生物類群，廣泛分布于植物根圍土壤中［6］。PGPR的促生機制有多種，如改變土壤中礦物元素形態(tài)、分泌植物生長激素、修復污染土壤、生防效應等，近年來已被開發(fā)成不同制劑施加到各類作物上，并取得了預期的效果。PGPR制成的各種菌肥在替代化肥、農藥及其他補充劑等化學制劑上所表現(xiàn)出來的可行性，表明其在農業(yè)生產中具有巨大的開發(fā)潛力［7］。

目前國內外較多地報道了PGPR菌肥在實驗室或溫室條件下對辣椒的促生效果［8-9］。但在田間復雜環(huán)境下，鮮有關于PGPR菌肥對辣椒的促生作用及其對植株根際土壤微生物結構、數(shù)量變化影響的研究。因此，本文以實驗室前期從茶樹根際分離篩選到、且具有優(yōu)良促生能力的4株PGPR菌株制成液體復合菌劑，在田間條件下對辣椒進行促生研究，探究PGPR復合菌劑對辣椒的促生效果，并對根際土壤微生物的結構與數(shù)量進行了動態(tài)監(jiān)測，旨在為辣椒PGPR復合菌劑的進一步研發(fā)和推廣提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及試驗材料

供試PGPR菌株是由貴州大學微生物學實驗室分離篩選得到的4株茶樹根際促生菌菌株：HGD3（Pseudomonas putida）、HGD12（Bacillus flexus）、HP9（Bacillus velezensis）、HP10（Bacillus firmus）。試驗所用辣椒品種為艷椒425。

1.2 試驗大田概況

試驗地點位于貴州省遵義市播州區(qū)楓香鎮(zhèn)楓元村堰塘組（E106°34′23″，N27°35′29″），所處緯度較低，常年氣候溫涼濕潤，雨量充沛且光照充足。試驗大田土壤類型為水稻土，土壤理化指標如下：有機質含量36.57 g/kg，全氮2.16 g/kg，全磷1.28 g/kg，全鉀13.53 g/kg，堿解氮164 mg/kg，有效磷74 mg/kg，速效鉀150 mg/kg。前茬作物為豇豆和蠶豆。

1.3 PGPR復合菌劑的制備

將甘油保存的PGPR菌種HGD3、HGD12、HP9、HP10按1%比例分別接種于LB（Luria-bertani）液體培養(yǎng)基中，180 r/min、30℃搖床培養(yǎng)12 h進行活化，活化菌液分別按5%比例轉接至LB液體培養(yǎng)基中擴培24 h，培養(yǎng)液于7 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用適量新鮮培養(yǎng)基將菌體重懸至細胞濃度為1010cfu/mL，等量混合4株PGPR菌液備用。使用時進行25倍稀釋。

1.4 試驗設計

共設計了3個試驗處理：100%化肥組為對照（CK）、100%化肥+PGPR復合菌劑（CF1-PGPR）、80%化肥+PGPR復合菌肥（CF2-PGPR）。其中，100%化肥施用標準為：化肥（總養(yǎng)分≥45.0%，N-P2O5-K2O：15-15-15）750 kg/hm2， 磷酸二銨（總養(yǎng)分≥64.0%，N-P2O5-K2O比例為18-46-0）300 kg/hm2。PGPR復合菌劑的處理分為3次，分別于移栽后7、30及60 d進行灌根，每株100 mL自來水稀釋的菌液（實際含PGPR菌液4 mL）。

3個試驗處理中，每處理為一個試驗大區(qū)，大區(qū)長24 m，寬2.8 m，面積為67.2 m2；每個大區(qū)等分為3個重復小區(qū)，小區(qū)長8 m，寬2.8 m，面積為22.4 m2，相鄰大區(qū)間隔70 cm，每大區(qū)分為兩壟，壟間距60 cm，壟寬50 cm，每壟種植兩行，采用錯位種植法進行種植，株間距50 cm。起壟時進行化肥施加，在起壟工作結束后用隔離帶分別將各大區(qū)、各重復小區(qū)進行隔離標識。育苗、移栽、種植均按常規(guī)措施進行。

1.5 測定方法

1.5.1 辣椒農藝性狀及生育指標的測定

在始花期（移栽后30 d）、坐果期（移栽后60 d）、盛果期（移栽后90 d）分別從各重復小區(qū)里隨機選取10株辣椒測定株高和莖粗；測定了單株辣椒的掛果數(shù)、產量，并對總產量進行了最終統(tǒng)計。

1.5.2 根際土壤采集及土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量的測定

辣椒根際土壤的采集參照Courchesne等方法［10］，前兩次土樣的采集時間為菌劑第一次灌根20 d后，第二次灌根30 d后進行，分別對應于始花期（移栽后30 d）和坐果期（移栽后60 d）；第三次土樣的采集時間為移栽后90 d，對應于盛果期。以稀釋平板計數(shù)法對根際土壤微生物數(shù)量進行測定。細菌數(shù)量的測定采用LB固體培養(yǎng)基［11］、放線菌為改良高氏一號固體培養(yǎng)基［12］、真菌為氯霉素-孟加拉紅固體培養(yǎng)基［13］；溶磷菌數(shù)量測定采用NBRIP固體培養(yǎng)基［14］、固氮菌為阿須貝氏固體培養(yǎng)基［15］、解鉀菌為解鉀硅酸鹽細菌固體培養(yǎng)基［16］。

1.6 數(shù)據(jù)分析及作圖

試驗結果采用SPSS 20.0進行one way-ANOVA統(tǒng)計處理，用Office 2019進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，輸出結果為各大區(qū)重復小區(qū)中所測得平均值。

2 結果與分析

2.1 PGPR復合菌劑對辣椒生長的影響

測定了辣椒始花期、坐果期和盛果期的株高（表1），結果表明，在始花期，100%化肥+PGPR菌劑和80%化肥+PGPR菌劑的兩個處理均顯著促進了辣椒植株的增高，與100%化肥組（CK）相比，分別增加了11.19%和7.34%；在坐果期，處理組的株高分別增加了7.06%、11.08%；在盛果期，處理組的株高分別增加了8.51%和12.63%，且80%化肥+PGPR菌劑處理較CK呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。

對辣椒的莖粗測定結果顯示，100%和80%化肥配施PGPR復合菌劑處理的辣椒莖粗均明顯增加（表1），且達到顯著性差異水平（P＜0.05）。相對于CK，經100%化肥+PGPR菌劑和80%化肥+PGPR菌劑處理后，辣椒莖粗在始花期分別增加了11.19%和11.13%，坐果期和盛果期莖粗增長明顯，分別較對照（CK）增加了20.7%、22.01%和21.14%、22.14%。但從坐果期到盛果期的測定結果表明，這個時期主要是辣椒的生殖生長階段，株高和莖粗基本未發(fā)生變化。

表1 PGPR復合菌劑對辣椒植株生長的影響 （cm）

2.2 PGPR菌劑對辣椒果實質量、坐果及產量的影響

比較了不同處理組的單株掛果數(shù)（表2），結果顯示添加復合菌劑的兩種處理均可以顯著促進辣椒掛果（P＜0.05）。相比于100%化肥組（CK），添加了PGPR菌劑處理的辣椒掛果數(shù)增長了32.17%，而80%化肥+PGPR菌劑處理對辣椒掛果具有更強的促進作用，較CK增加了52.55%。果實指數(shù)分析結果表明，各處理間的辣椒果實果長、果徑及果形指數(shù)沒有顯著性差異（P＜0.05），表明PGPR在促進辣椒掛果的同時，并不會對果實的品質產生不利影響。

單株產量的測定結果顯示，PGPR復合菌劑的灌根處理有顯著的促生效果（P＜0.05）。與對照CK相比，經100%化肥+PGPR菌劑及80%化肥+PGPR菌劑處理后，辣椒的單株產量分別增加了34.14%和38.76%。施加100%化肥組（CK）收獲的鮮椒為26 804.26 kg/hm2，而添加PGPR菌劑的100%化肥組的鮮椒產量為35 956.16 kg/hm2，添加復合菌劑的80%化肥組的鮮椒產量達37 193.28 kg/hm2，分別較CK增產約9 150和10 390 kg/hm2。

表2 PGPR復合菌劑對辣椒果實質量、坐果及產量的影響

2.3 PGPR復合菌劑對根際土壤微生物的影響

2.3.1 根際土壤中微生物數(shù)量的動態(tài)變化

對辣椒3個時期根際土壤中微生物數(shù)量變化進行了動態(tài)監(jiān)測（圖1），結果表明PGPR復合菌劑對辣椒根際微生物總量（細菌、真菌、放線菌數(shù)量之和）影響顯著（P＜0.05）。在始花期，CF1-PGPR和CF2-PGPR兩種處理根際土壤中的微生物總量比CK分別增加了71.48%和47.03%，坐果期總量分別增長了4倍和1倍，在盛果期微生物總量出現(xiàn)下降趨勢，但復合菌劑處理組仍與CK呈顯著差異。

圖1 不同處理組辣椒根際土壤微生物總量的動態(tài)變化

2.3.2 根際土壤三大菌群數(shù)量變化

不同施肥處理對土壤中微生物的結構和數(shù)量影響顯著。經100%化肥+PGPR、80%化肥+PGPR的處理組中，無論是始花期、坐果期和盛果期，細菌數(shù)量均顯著增加（P＜0.05），其中后兩個處理生長時期的細菌總數(shù)較對照增加了1倍以上，尤以100%化肥+PGPR處理更為顯著；而根際土壤中的真菌數(shù)量均低于100%化肥（CK）處理組，坐果期和盛果期的根際土壤真菌數(shù)比CK分別降低了12.14%、37.28%和83.90%、82.02%；復合菌劑對前兩個生長時期的放線菌數(shù)量并沒有顯著影響，但導致了盛果期的放線菌數(shù)量顯著提高，尤以100%化肥+PGPR復合菌劑的處理更為顯著。

2.3.3 根際土壤功能微生物的變化

表3顯示了始花期、坐果期和盛果期各處理間辣椒根際土壤中溶磷菌、解鉀菌和固氮菌功能菌群的數(shù)量，不同施肥處理對根際土壤中功能微生物結構組成影響顯著（P＜0.05）。在始花期，復合菌劑處理的辣椒根際土壤溶磷菌、解鉀菌和固氮菌數(shù)量較對照分別提高了7、18和5倍以上，其中CF2-PGPR的解鉀菌數(shù)比CF1-PGPR高出約1倍（P＜0.05），而溶磷菌和固氮菌在兩個處理組間沒有顯著性差異。在坐果期，處理組的3大類功能微生物數(shù)量顯著增加，解鉀菌和固氮菌數(shù)較同期對照分別提高了近3和22倍以上，且解鉀菌數(shù)在配施100%化肥組表現(xiàn)更為顯著，達到8倍以上。在盛果期，功能微生物數(shù)仍與對照差異顯著，100%化肥配施組的解鉀菌數(shù)較對照提高近5倍，溶磷菌、解鉀菌和固氮菌數(shù)均在PGPR復合菌劑配施100%化肥組中更高（P＜0.05）。

表3 PGPR復合菌劑處理對辣椒根際土壤功能微生物的影響 （cfu/g土壤）

3 討論

辣椒是一年生茄科辣椒屬植物，是全球廣泛種植的蔬菜經濟作物之一，2017年我國辣椒種植面積已超過133.3萬hm2［17］。辣椒產業(yè)的蓬勃發(fā)展使很多學者主要致力于高產品種選育和肥料控釋技術的優(yōu)化，忽視了從根本上通過改善土壤條件及質量達到提高土壤生產力的目的。隨著社會對發(fā)展生態(tài)農業(yè)的重視及可持續(xù)發(fā)展意識的增強，使得以PGPR制成的新型生物肥料部分或逐步取代化肥成為一種可能性。例如，李娟等［18］用解磷微生物菌劑進行油菜盆栽試驗，氮肥和氮磷復合肥配施菌劑后油菜生物產量相比未施菌肥分別增加了17.91%，12.0%。Menaviolante等［19］在溫室條件對分別以粗砂土和砂壤土為基質種植的番茄接種Bacillus subtilis BEB-13bs，番茄產量提高了21%和25%。本研究中，利用前期分離篩選到的PGPR菌株制備的復合菌劑對辣椒進行灌根，促進了辣椒株高和莖粗的增長，單株掛果數(shù)、單株產量及總產量相較于單施化肥均顯著增加，其中化肥減量20%后配施PGPR復合菌劑的處理促生效果最為顯著。也有相關研究報道適當減少化肥用量可以有效提高作物的產量［20］，這是因為化肥量適當減少，提高了土壤中有效養(yǎng)分含量。

植物的苗期營養(yǎng)生長力的強弱決定了生殖生長的強弱［21-22］。本研究發(fā)現(xiàn)，在PGPR菌劑第一次灌根處理后20 d進行辣椒生長指標測定時，辣椒的株高和莖粗均較對照明顯增加，這為辣椒掛果數(shù)的增加和產量的提升奠定了基礎。而在辣椒的坐果期和盛果期，PGPR菌劑處理后的株高與對照并無顯著差異，莖粗則顯著高于對照，表明株高并不是辣椒產量提高的主要影響因素，這與劉學靜［23］研究酵素有機肥對田間辣椒產量的結果一致，類似的研究在番茄［24］和豇豆［25］上均得到了相同結論。因此研究以果實為最終收獲物的類似問題時，提示株高并非評價PGPR促生效果的一個必要指標。本研究對辣椒的果長、果徑和果形指數(shù)等果實指標進行測定，發(fā)現(xiàn)3個指標在處理組和對照組之間均無顯著性差異，表明PGPR促進辣椒掛果及產量提高的同時，并不會造成果實品質的下降。

根際是土壤中一個特別的區(qū)域，根際土壤微生物與植物之間的相互作用，使其與主體土壤在理化性質和生物學特性方面有所不同［26］。研究PGPR對根際土壤微生物群落結構特征的影響具有重要意義。本研究在辣椒始花期、坐果期和盛果期對辣椒根際土壤微生物進行了動態(tài)監(jiān)測，結果顯示，PGPR復合菌劑處理后，不同時期辣椒根際土壤細菌總量和微生物總量顯著提高，真菌數(shù)量明顯降低，而放線菌數(shù)量在盛果期也顯著增加；溶磷菌、固氮菌、解鉀菌等功能微生物數(shù)量在辣椒各生育期也顯著提高。從細菌數(shù)量上來看，100%化肥配施PGPR復合菌劑相對優(yōu)于80%化肥配施PGPR復合菌劑，這可能是100%化肥添加量所引起的土壤化學成分變化不同，刺激了土壤微生物活性提高，從而引起微生物數(shù)量增加［27-28］。本研究中PGPR復合菌劑的添加顯著減少了真菌數(shù)量，這與劉方春等［29］、王其傳等［30］的研究結果一致，真菌數(shù)量雖然相對于細菌占比較少，但由于其生物量大，易引發(fā)植物病變，因此對真菌在土壤中的作用不可忽視［31-32］。放線菌作為一類重要的微生物資源，在控制植物病原菌傳播上起著重要的作用［33］。辣椒的盛果期是降雨量增多的7～9月，相關研究表明，許多植物病原菌數(shù)量（如炭疽?。┡c降雨量呈正相關性［34-35］，本研究中坐果期和盛果期根際土壤放線菌數(shù)量較對照有不同程度的增高，真菌數(shù)量明顯降低，表明PGPR復合菌劑的處理對辣椒病害防治可能具有積極作用，這與本研究發(fā)現(xiàn)整個種植期間施加復合菌劑的試驗田病害更少的結果相符。

近年來已有大量研究報道了PGPR在田間條件下對作物的促生效果，其中許多報道指出外源PGPR可以改變根際土壤中微生物結構和種群數(shù)量［29-30，32，36］，且總體變化表現(xiàn)為細菌數(shù)量增加，真菌數(shù)量減少，放線菌數(shù)量變化不一致，與本研究結論相同。但PGPR在田間復雜環(huán)境下的促生機制至今仍是個謎，Probanza等［37］曾提出“PGPR改變土壤微生物群落結構是其另一種促生機制”的假說。劉方春等［29］研究發(fā)現(xiàn)，施加PGPR生物肥使冬棗根際土壤的微生物總量和細菌數(shù)量得到顯著提高。邱勤等［38］在研究PGPR對苜蓿生長度土壤微生物的影響時發(fā)現(xiàn)，接種PGPR顯著促進了土壤微生物生物量碳、氮含量的提高。由此可以推斷，本研究采用的PGPR復合菌劑對辣椒根際微生物數(shù)量及群落結構的影響，可能是促進辣椒生長和產量提升的重要原因。

4 結論

通過辣椒田間促生試驗，表明PGPR復合菌劑在田間條件下能夠顯著促進辣椒生長，且增產效果明顯。

對辣椒根際土壤微生物的動態(tài)監(jiān)測結果表明：PGPR復合菌劑的灌根可以顯著提高根際土壤細菌及放線菌數(shù)量，降低真菌數(shù)量，活化土壤功能菌群，對辣椒根際土壤微生物群落結構具有較大的影響。更深入的作用機制還可通過宏基因組測序分析微生物多樣性進行進一步解析。

致謝：感謝遵義山那邊生態(tài)農業(yè)有限公司提供試驗用地，感謝貴州大學生命科學學院2016級微生物學專業(yè)研究生王歡，生物技術專業(yè)2015級本科生楊志芬、吳榮菊、林佳靜及石煙祝參與研究工作。