長(zhǎng)期稻-稻-紫云英輪作對(duì)水稻種子內(nèi)生細(xì)菌的影響及促生功能評(píng)價(jià)

趙 霞，張子強(qiáng)，夏振遠(yuǎn)，Kyu Kyu Thin，郭鶴寶，何山文，高菊生，4*，張曉霞*

（1．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081；2．北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部，北京 100083；3．云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 昆明 650021；4．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院衡陽紅壤實(shí)驗(yàn)站，湖南 祁陽 426182）

種子的生理生態(tài)學(xué)和病理學(xué)相關(guān)研究表明，植物種子內(nèi)富含微生物種群［1-2］。利用可培養(yǎng)方法，在水稻、玉米、大麥、苜蓿等25種植物中，發(fā)現(xiàn)有4個(gè)門131個(gè)屬的種子內(nèi)生細(xì)菌，其中Proteobacteria為最主要的類群，其它依次為Actinobacteria，Bacteroidetes和 Firmicutes［3］。在屬水平，Bacillu，Pseudomonas，Paenibacillus，Micrococcus，Staphylococcus，Pantoea等類群最為常見。近年來高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用到種子微生物的研究中，使得種子中微生物多樣性得到進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。16S rRNA高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)種子中的主要類群與可培養(yǎng)法一致，為Proteobacteria，Actinobacteria，Bacteroidetes和Firmicutes，同時(shí)還有一些新類群如Acidobacteria，F(xiàn)usobacteria，Chlamydiae和 Gemmatimonadetes［4-7］。種子內(nèi)生菌也顯示出生物防治和植物促生的功能，如固氮、溶磷、分泌生長(zhǎng)素（IAA）和嗜鐵素以及ACC（1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸）脫氨酶活性等［8-10］。此外，種子內(nèi)生菌對(duì)其宿主植物具有抗致病菌、抗動(dòng)物攝食等作用［11］，可有效提高種子萌發(fā)率、幼苗存活率、幼苗根長(zhǎng)和苗高、生物量積累等［12］。當(dāng)植物種子落入土壤后，在萌發(fā)過程中，還會(huì)通過特定機(jī)制招募特定微生物在其表面聚集，以幫助種子萌發(fā)，防止退化或被捕食［13］。種子微生境目前研究較少，近年來因其作為有益微生物的儲(chǔ)庫(kù)和載體的潛力而備受關(guān)注［14］。

綠肥作為一種傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)技術(shù)，應(yīng)用歷史悠久。在化肥大規(guī)模應(yīng)用之前，是增加土壤養(yǎng)分供應(yīng)的主要來源之一。我國(guó)是世界上種植綠肥面積最廣的國(guó)家。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，19世紀(jì)中期，全國(guó)綠肥種植面積有173萬hm2，隨后逐步增加。到20世紀(jì)80年代初期，種植面積穩(wěn)定在1 000萬hm2左右，但到80年代中后期，由于化肥的推廣和使用，綠肥生產(chǎn)開始出現(xiàn)滑坡，到90年代初期種植面積劇減［15-16］。雖然化肥在一定程度上提高了作物的產(chǎn)量，但由于化學(xué)合成物質(zhì)在農(nóng)田的大量使用嚴(yán)重改變了土壤原有的微生物組成和生物地球化學(xué)循環(huán)［17-18］。給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境帶來了一系列的負(fù)面作用［19-21］，成為進(jìn)一步提高作物產(chǎn)量及質(zhì)量的重要障礙。而種植綠肥不僅能為土壤提供豐富的養(yǎng)分，控制植物病蟲害的發(fā)生［22-23］，還可以促進(jìn)土壤微生物的活動(dòng)［24-26］，具有顯著的土壤增肥功能［27］。實(shí)驗(yàn)室前期工作已證實(shí)長(zhǎng)期水稻-稻-綠肥輪作可以顯著改變水稻根際和根內(nèi)生微生物群落的組成結(jié)構(gòu)［28-29］。本研究進(jìn)一步探討了綠肥（紫云英）輪作對(duì)水稻種子內(nèi)生細(xì)菌微生物群的影響與功能。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

長(zhǎng)期綠肥與水稻輪作試驗(yàn)田位于湖南省祁陽縣農(nóng)業(yè)部紅壤生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)田間監(jiān)測(cè)試驗(yàn)站（26°45′42″N，111°52′32″E）。1982～ 2012年，進(jìn)行稻-稻-冬閑（RR-WF）和稻-稻-紫云英（RR-MV）輪作。每個(gè)處理重復(fù)3次，隨機(jī)區(qū)組排列，小區(qū)面積37.5 m2（2.5 m×15.0 m），各小區(qū)之間由60 cm水泥埂隔開。每季早稻和晚稻的使用總肥料（基肥+追肥）包括N（153.0 kg/hm2），P2O5（84.0 kg/hm2）和K2O（129.0 kg/hm2）。復(fù)合肥［N（84.0 kg/hm2），P2O5（84.0 kg/hm2） 和K2O（84.0 kg/hm2）］用作基肥，N（69.0 kg/hm2）和K2O（45.0 kg/hm2）用作追肥。移栽水稻前施用基肥，水稻移栽6～10 d后追肥。在晚稻收獲前10～15 d，播種綠肥紫云英種子（播種量為7.5 kg/hm2）。種植綠肥的小區(qū)在次年早稻移栽前15 d將鮮草全部翻入各自小區(qū)內(nèi)。每季除稻茬外，其他秸稈全部移走。冬種綠肥不再施肥。2013年10月，每塊地隨機(jī)選取3個(gè)點(diǎn)采集水稻種子樣品，風(fēng)干后，4℃冷藏保存。

1.2 水稻種子表面殺菌和細(xì)菌分離培養(yǎng)

根據(jù)Sun等［30］的方法對(duì)水稻種子進(jìn)行表面殺菌：兩個(gè)處理各選取1 g種子，先用無菌水沖洗一次，然后分別浸入70%酒精和新鮮NaClO溶液（2.5%可用Cl-）中各3和5 min，再浸入70%酒精30 s，最后用無菌水清洗5次。將種子輕輕在TSA平板上按壓翻滾以檢查表面殺菌效果。將表面殺菌后的樣品在裝有少量無菌石英砂的研缽中研磨至粉末，然后用無菌水稀釋成10-1、10-2和10-3的懸浮液。3個(gè)梯度各吸取100 μL分別在TSA［31］（Difico），1/4 R2A［32］（Difico） 和 Ashby［33］無 氮培養(yǎng)基（蔗糖20 g，K2HPO40.1 g，KH2PO40.4 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.01 g，F(xiàn)eCl30.01 g，Na2MoO4·2H2O 0.002 g，1 L水）上進(jìn)行涂布，每種平板3個(gè)重復(fù)。所有平板28℃下培養(yǎng)3 d。挑取每個(gè)處理的1/4 R2A平板上的所有菌落，并從其他平板上挑取大小和顏色不同的菌落進(jìn)行劃線純化。所有純化后的菌株通過冷凍干燥法在4℃儲(chǔ)存。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

使用DNA提取試劑盒（Transgen，China）提取細(xì)菌DNA（具體步驟參照試劑盒說明）。根據(jù)Lane［34］， 使 用 通 用 引 物 27F 和 1492R 進(jìn) 行 16S rRNA基因的擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送生物公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用EzTaxon進(jìn)行序列比對(duì)［35］；系統(tǒng)發(fā)育樹由 MEGA 6.0 軟件構(gòu)建［36］。

1.4 檢測(cè)分離菌株的植物促生功能

在Pikovskaya培養(yǎng)基上進(jìn)行菌株溶磷活性的檢測(cè)［37］；在含有100 μg/mL L-色氨酸的TSB培養(yǎng)基接種細(xì)菌并培養(yǎng)48 h，參照Glickmann等［38］的方法檢測(cè)懸浮液中IAA含量；參照Machuca等［39］的方法檢測(cè)菌株是否產(chǎn)鐵載體。

2 結(jié)果與分析

2.1 可培養(yǎng)種子內(nèi)生菌的數(shù)量

本研究使用3種不同的培養(yǎng)基估測(cè)水稻種子內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量。平板計(jì)數(shù)結(jié)果如圖1所示：3種不同培養(yǎng)基的計(jì)數(shù)結(jié)果均表明長(zhǎng)期綠肥輪作顯著增加水稻種子內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量；同時(shí)綠肥輪作系統(tǒng)收獲的水稻種子內(nèi)生菌對(duì)培養(yǎng)基有不同的偏好：長(zhǎng)期綠肥輪作R-R-MV在TSA上觀察到的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量最高，達(dá)2.87×106CFU/g，而冬閑R-R-WF在1/4 R2A上檢測(cè)的細(xì)菌數(shù)量最高，為2.33×106CFU/g，說明R-R-MV和R-R-WF的種子內(nèi)生細(xì)菌間存在不同的代謝類型。

圖1 梯度稀釋涂布并計(jì)數(shù)的方法檢測(cè)水稻種子內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量

2.2 可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析

據(jù)梯度稀釋平板細(xì)菌生長(zhǎng)情況，選擇1/4 R2A平板上所有菌落，和其他兩種培養(yǎng)基上不同菌落形態(tài)不同顏色的細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)。結(jié)果R-R-WF種子分離到42株內(nèi)生細(xì)菌，R-R-MV種子分離到66株內(nèi)生細(xì)菌，通過16S rRNA基因序列擴(kuò)增并測(cè)序，約700 bp序列上傳至Eztaxon（http：//www.ezbiocloud.net/eztaxon）比對(duì)分析；序列提交GenBank并獲得登錄號(hào)，圖2、3括號(hào)中的數(shù)字即為相應(yīng)菌株的GenBank登錄號(hào)；使用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2、3）。結(jié)果表明，42株R-R-WF內(nèi)生菌分別屬于9屬12種，66株R-R-MV內(nèi)生菌屬于15屬21種。

R-R-WF和R-R-MV內(nèi)生菌的優(yōu)勢(shì)門均為γ-Proteobacteria，分別占60%和50%。α-Proteobacteria（24%）是R-R-WF的次要優(yōu)勢(shì)群，其次是Actinobacteria和Firmicutes。而Firmicutes（22%）是R-R-MV的次要優(yōu)勢(shì)門，其次是Actinobacteria（15%）和α-Proteobacteria（9%）。而β- Proteobacteria（5%）僅在R-R-MV中檢測(cè)到。

圖2 R-R-WF水稻種子分離到的內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

在屬水平上，Pseudomonas（28.57%）和Xanthomonas（26.19%）是R-R-WF中的優(yōu)勢(shì)屬，其次是Sphingomonas（16.67%）。 此外，在R-R-WF中還發(fā)現(xiàn)Bacillus，Rhizobium，Micrococcus，Methylobacterium，Pantoea和 Microbacterium。與R-R-WF相比，Pantoea（27.94%）是R-R-MV中的優(yōu)勢(shì)屬，其次是Pseudomonas（14.71%），Paenibacillus（13.24%）。Paenibacillus，Curtobacterium，Acidovorax，Rothia，Acidovorax，Kocuria 和 Staphylococcus是R-R-MV中的特有類群（表1）。

圖3 R-R-MV水稻種子分離到的內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

表1 水稻種子內(nèi)生細(xì)菌在屬水平的相對(duì)豐度（R-R-WF：稻-稻-冬閑，R-R-MV：稻-稻-紫云英）（%）

2.3 種子內(nèi)生菌植物促生特性檢測(cè)

基于內(nèi)生細(xì)菌的來源與分類地位，本研究選擇31株菌檢測(cè)植物促生特性（表2）。其中，14株（ 屬 于Bacillus，Curtobacterium，Kocuria，Microbacterium，Paenibacillus，Pantoea，Pseudomonas，Rhizobium，Rothia和Sphingomonas）可以分泌生長(zhǎng)素IAA；10株（屬于Bacillus，Curtobacterium，Microbacterium，Pseudomonas，Sphingomonas和 Xanthomonas）在CAS平板上的菌落周圍產(chǎn)生橙色暈圈，表明這些菌株具有產(chǎn)鐵載體的活性；9株可以溶解有機(jī)和無機(jī)磷酸鹽（菌落周圍可以觀察到透明圈），測(cè)量菌落直徑（n）和暈圈直徑（z），計(jì)算z/n值，發(fā)現(xiàn)在無機(jī)磷酸鹽培養(yǎng)基上，菌株 RZ27、TZ26和RZ4的z/n大于2.0，表明這些菌株具有強(qiáng)溶解無機(jī)磷的能力［40］。此外，8株菌可溶解有機(jī)磷酸鹽，但不能溶解無機(jī)磷酸鹽。TZ22、TD10和AD1具有本研究中所檢測(cè)的植物促生的所有特征，但也有9株沒有檢測(cè)到任何促生作用。

表2 水稻種子細(xì)菌的溶磷酸鹽、IAA和產(chǎn)鐵載體促生能力的檢測(cè)

3 討論

3.1 長(zhǎng)期綠肥輪作下，水稻種子內(nèi)生細(xì)菌變化情況及其與根內(nèi)生細(xì)菌的關(guān)系

本試驗(yàn)前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期紫云英綠肥輪作（R-R-MV）會(huì)顯著改變水稻根內(nèi)細(xì)菌的多樣性和組成［28］。本研究通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法證明長(zhǎng)期紫云英綠肥輪作對(duì)水稻種子內(nèi)生細(xì)菌的影響。結(jié)果表明內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量顯著增加，多樣性也明顯增加，主要類群發(fā)生變化。可見長(zhǎng)期的稻-稻-綠肥輪作不僅會(huì)改變水稻根內(nèi)生細(xì)菌［28］，也改變了種子內(nèi)生菌的數(shù)量與多樣性。與Zhang等［28］描述的根內(nèi)生細(xì)菌相比，Pantoea，Pseudomonas，Xanthomonas和Sphingomonas是種子內(nèi)生菌的主要類群，但在水稻根內(nèi)豐度較低。Herbaspirillum和Cedecea是根內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)屬，但種子中并沒有分離到。一些豐度較低的屬（Methylobacterium，Curtobacterium，Rothia和Kocuria）僅在種子中分離到。Mano 等［41］根據(jù)大量關(guān)于水稻根和種子內(nèi)生細(xì)菌的報(bào)道也得出類似的結(jié)論，水稻種子內(nèi)的固有細(xì)菌較少，不同植物組織其菌群結(jié)構(gòu)也不同。因此，本研究推測(cè)種子內(nèi)生細(xì)菌受根內(nèi)生菌和其他環(huán)境因素的影響。

3.2 水稻種子內(nèi)生細(xì)菌的組成及其功能

Pseudomonas，Xanthomonas，Sphingomonas和Pantoea是本研究檢測(cè)到的種子內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬。此外，水稻種子中也存在非優(yōu)勢(shì)屬，例如Paenibacillus，Curtobacterium，Acidovorax，Kocuria，Staphylococcus和 Rothi。Mano等［41］報(bào)道了水稻種子內(nèi)生細(xì)菌主要包含Pantoea，Herbaspirillum，Metylobacterium，Klebsiella，Acidovorax，Bacillus，Curtobacterium，Micrococcus，Paenibacillus，Sphingomonas，Xanthomonas，Ochorbacterium，Pseudomonas等。過去基于16S rRNA Illumina測(cè)序發(fā)現(xiàn)Pantoea，Acinetobacter，Xanthomonas，Bacillus，F(xiàn)lavobacterium，Stenotrophomonas，Neorhizobium和 Pseudomonas是水稻種子中的共有優(yōu)勢(shì)屬［7］。因此，本研究分離的細(xì)菌大多數(shù)是典型的種子內(nèi)生細(xì)菌。

Pantoea是水稻種子內(nèi)生細(xì)菌的主要種類之一，表明Pantoea和水稻之間有很強(qiáng)的親和力。研究報(bào)道玉米種子內(nèi)生細(xì)菌最豐富的也是Pantoea［42］，Pantoea具有固氮、分泌植物激素的功能［43］，本研究發(fā)現(xiàn)Pantoea具有產(chǎn)IAA、溶解無機(jī)和有機(jī)磷酸鹽的能力。

Pseudomonas也是種子內(nèi)生細(xì)菌的主要組成之一。本研究選擇兩株P(guān)seudomonas來檢測(cè)植物促生功能，發(fā)現(xiàn)AD1能夠產(chǎn)IAA、鐵載體，并可以溶解無機(jī)和有機(jī)磷酸鹽（表2）。此外，Pseudomonas也是研究細(xì)菌與植物互作的模式菌［44］，如Pseudomonas fluorescens可以通過分泌抗生素和競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)，使植物免受致病菌的侵害［45］，并增加作物產(chǎn)量［46］。

本研究發(fā)現(xiàn)一些低豐度細(xì)菌對(duì)植物具有潛在的有益功能，如表2所示的Bacillus，Paenibacillus，Methylobacterium和Sphingomonas。這些菌株在不同的環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)與植物有密切的關(guān)系。Methylobacterium具有很強(qiáng)的抗逆性，能夠合成植物激素并刺激種子萌發(fā)［47］。Curtobacterium是一類典型的種子共生細(xì)菌，能夠保護(hù)植物免受Erwinia的攻擊［48-49］。Bacillus可溶解無機(jī)或有機(jī)磷酸鹽，分泌IAA并產(chǎn)生抗真菌代謝物以抑制致病菌［50-51］。

4 結(jié)論

本研究的主要結(jié)論如下：（1）長(zhǎng)期綠肥輪作改變了水稻種子內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量；（2）種子選擇并積累了一些特定的細(xì)菌，如Pseudomonas，Xanthomonas，Sphingomonas和 Pantoea；（3） 大 多數(shù)分離菌株具有植物促生功能，表明它們與植物有密切關(guān)系。