核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3炎性小體抑制劑

兀娜，沈敏

炎性小體是一類模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)，可識(shí)別細(xì)胞內(nèi)病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)或損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)，是固有免疫的重要組成成分。NLRP3炎性小體是目前研究最廣泛、最明確的一種炎性小體，由核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding oligomerization domain，NOD)樣受體蛋白3(Nod-like receptor protein3, NLRP3)、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 1 (cysteine-requiring aspartate protease-1，caspase-1)組成(圖1)。NLRP3與PAMPs或DAMPs結(jié)合后招募下游分子ASC，將無活性的促caspase-1前體活化為有生物學(xué)功能的caspase-1，caspase-1能夠剪切焦亡蛋白 GasderminD觸發(fā)細(xì)胞焦亡，并且促進(jìn)了白介素 (interleukin，IL)-1β和IL-18等炎性細(xì)胞因子的成熟和分泌。IL-1β和IL-18作為強(qiáng)炎性因子能夠有效促進(jìn)免疫反應(yīng)，過表達(dá)時(shí)會(huì)造成急慢性炎性損傷，NLRP3炎性小體及其下游分子在一系列炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要的角色，如2型糖尿病、阿爾茲海默病、痛風(fēng)、NLRP3相關(guān)自身炎癥性疾病(NLRP3-associated autoinflammatory disease, NLRP3-AID)(以往稱為冷炎素相關(guān)周期性綜合征，cryopyrin-associated periodic syndrome，CAPS)、帕金森病等[1-5]。NLRP3炎性小體的激活有以下4種可能的機(jī)制(圖1)：(1)胞外三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)刺激細(xì)胞膜上的P2X7型嘌呤受體，引起鉀離子選擇性通道開放，胞內(nèi)鉀離子濃度降低是NLRP3炎性小體激活的一個(gè)重要因素[6]；(2)晶體物質(zhì)被細(xì)胞吞噬后破壞溶酶體膜穩(wěn)定性，溶酶體破裂釋放出組織蛋白酶B(cathepsinB，CB)，致使NLRP3炎性小體激活[7]；(3)有氧代謝的副產(chǎn)物活性氧(reactive oxygen species，ROS)從線粒體釋放，或線粒體損傷釋放的線粒體DNA均被證實(shí)能夠促進(jìn)NLRP3炎性小體的激活[8-9]；(4)NLRP3通過其保守的堿性區(qū)域與帶負(fù)電荷的磷脂酰肌醇-4-磷酸(phosphatidylinositol-4-phosphate，PtdIns4P)結(jié)合而被募集到分散高爾基體反面網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(dispersed trans-Golgi net-work，dTGN)，后者能夠提供結(jié)構(gòu)支點(diǎn)促使NLRP3招募ASC以完成小體的組配[10]。通過抑制NLRP3炎性小體的激活可以治療NLRP3炎性小體相關(guān)疾病，因此NLRP3炎性小體抑制劑成為近年來的研究熱點(diǎn)。本文按照不同作用靶點(diǎn)，對(duì)NLRP3炎性小體抑制劑的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 以NLRP3為作用靶點(diǎn)

1.1 阻斷NLRP3中心區(qū)域ATP酶活化

NLRP3主要由3部分構(gòu)成：碳端亮氨酸富集結(jié)構(gòu)域(LRRs)，可識(shí)別并結(jié)合PAMPs和DAMPs；中心區(qū)域存在ATP酶活化有關(guān)的核苷酸寡寡聚結(jié)合域，稱為NBD或NACHT；氮端為效應(yīng)結(jié)構(gòu)域即pyrin結(jié)構(gòu)域(PYD)，負(fù)責(zé)招募下游信號(hào)分子。其中NACHT區(qū)域ATP酶的活化是NLRP3寡聚化以及ASC招募的重要步驟[11]，阻斷NLRP中心區(qū)域ATP酶活化可抑制NLRP3炎性小體活化。

圖1NLRP3炎性小體激活機(jī)制
Fig1Activation mechanism of NLRP3 inflammasome
NLRP3：核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3；DAMPs：損傷相關(guān)分子模式；PAMPs：病原相關(guān)分子模式；lysosome：溶酶體；Cathepsin B release：組織蛋白酶B釋放；dTGN：分散高爾基體反面網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；PtdIns4P：磷脂酰肌醇-4-磷酸；mitochondrion：線粒體；ROS release：活性氧釋放；mtDNA release：線粒體DNA釋放；P2X7：胞外核苷酸P2X7型受體；ATP：三磷酸腺苷；K+：鉀離子；NLRP3 inflammasome assembly：NLRP3炎性小體組裝

1.1.1 OLT1177

活性β-磺酰腈化合物OLT1177是氯化劑和甲硫氨酸合成反應(yīng)產(chǎn)物的活性成分，能負(fù)性調(diào)控NACHT結(jié)構(gòu)域ATP酶結(jié)合位點(diǎn)，抑制NLRP3炎性小體活化。免疫沉淀反應(yīng)以及熒光能量共振轉(zhuǎn)移分析技術(shù)表明OLT1177還能夠阻斷NLRP3與ASC和caspase-1的相互作用。OLT1177對(duì)NLRC4和黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma2，AIM2)炎性小體無作用，也不影響鉀離子外流或IL-1β前體的合成，因此該藥物是一種特異性NLRP3炎性小體抑制劑。Marchetti等[12]研究發(fā)現(xiàn)，體外實(shí)驗(yàn)中OLT1177可以抑制小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β、減少人外周血中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β、抑制caspase-1活化；小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OLT1177能夠減輕脂多糖(LPS)誘發(fā)的全身炎癥。對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎及酵母聚糖誘發(fā)的急性反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎小鼠模型應(yīng)用OLT1177可改善關(guān)節(jié)腔積液中炎細(xì)胞浸潤(rùn)情況。該藥用于治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的I期臨床試驗(yàn)已取得成功，未發(fā)現(xiàn)OLT1177相關(guān)的顯著不良事件，現(xiàn)已進(jìn)入臨床II期試驗(yàn)[13]。

1.1.2 CY-09

Jiang等[14]發(fā)現(xiàn)小分子化合物CY-09(分子式：C19H12F3NO3S2)可以與ATP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合NACHT結(jié)構(gòu)域上的與ATP酶活化有關(guān)的的Walker A基序，減少ATP酶的活化進(jìn)而阻斷NLRP3炎性小體激活。CY-09不影響NLRP3蛋白的泛素化、鉀離子外流等，并且僅作用于NLRP3炎性小體，對(duì)NLRC4、NLRP1等炎性小體沒有作用，是NLRP3炎性小體特異性抑制劑。CY-09治療NLRP3-AID和2型糖尿病小鼠模型均有顯著效果，且具有較好的安全性、穩(wěn)定性及口服生物活性[14]，但目前尚未進(jìn)行人體試驗(yàn)。

1.2 抑制NLRP3去泛素化

NLRP3的轉(zhuǎn)錄后修飾是調(diào)控其活化的關(guān)鍵步驟之一[15]。去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，DUB)BRCC3可使NLRP3的LRR結(jié)構(gòu)域去泛素化，該環(huán)節(jié)在NLRP3炎性小體活化過程中起到了關(guān)鍵作用[16]。

1.2.1 G5

G5(分子式：C19H14N2O7S)是一種小分子DUB抑制劑，也稱異肽酶抑制劑。2006年有研究首次發(fā)現(xiàn)1 μmol G5即可抑制LPS-ATP誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞分泌IL-1β，但具體機(jī)制不詳[17]。Py等[18]進(jìn)一步證實(shí)G5通過負(fù)性調(diào)控NLRP3去泛素化而抑制NLRP3炎性小體激活，阻斷caspase-1活化，并不作用于NLRC4及AIM2 炎性小體，因此是另一種特異性NLRP3炎性小體抑制劑。然而，也有學(xué)者認(rèn)為DUB抑制劑是通過破壞NLRP3炎性小體中ASC的寡聚化和ASC斑點(diǎn)形成而抑制NLRP3炎性小體活化[19]。

1.2.2 多巴胺

多巴胺(dopamine，DA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，近年來有學(xué)者研究揭示了DA也參與了免疫反應(yīng)過程。多數(shù)DA受體表達(dá)于免疫細(xì)胞表面，包括巨噬細(xì)胞和樹突樣細(xì)胞，DA與細(xì)胞表面的受體結(jié)合發(fā)揮效應(yīng)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的DA受體有5個(gè)亞型：DRD1，DRD2，DRD3，DRD4及DRD5。2014年Yan等[20]發(fā)現(xiàn)DA是一種內(nèi)源性NLRP3小體抑制劑，對(duì)單鈉尿酸鹽(mono-sodium urate，MSU)、明礬、尼日利亞菌素以及ATP誘導(dǎo)的NLRP3活化均表現(xiàn)出抑制作用；由DA激活的DRD1信號(hào)通路不僅可以緩解小鼠體內(nèi)神經(jīng)毒素MPTP誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥，還能改善 LPS誘導(dǎo)的外周炎癥以及MSU誘導(dǎo)的腹腔感染。在DA發(fā)揮抑制NLRP3小體作用過程中，DRD1起到了主要作用，DRD5作用次之，而DRD2、DRD3和DRD4則未發(fā)揮作用。在DRD1基因敲除(Drd1-/-)小鼠的巨噬細(xì)胞內(nèi)，DA則未能發(fā)揮抑制NLRP3炎性小體的作用，因此進(jìn)一步證實(shí)了DRD1的作用。

DA通過DRD1信號(hào)通路改變了腺苷酸環(huán)化酶(cAMP)構(gòu)型，使其活性增強(qiáng)，cAMP的生成增多，小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)cAMP活化E3泛素連接酶MARCH7，催化NLRP3的泛素化使其經(jīng)細(xì)胞自噬過程被降解。這與cAMP激活劑Forskolin能夠負(fù)性調(diào)控NLRP3炎性小體的活化所示的機(jī)制類似[21]。上述研究結(jié)果提示DA可能是治療NLRP3炎性小體相關(guān)性疾病的一種有效藥物。

1.3 抑制NLRP3與NLRP3的連接

抗過敏藥物曲尼司特(Tranilast，TR)能夠抑制IgE介導(dǎo)肥大細(xì)胞釋放組胺的過程，臨床應(yīng)用于治療和預(yù)防過敏性哮喘及過敏性皮炎已有近40年的歷史，安全性良好。Huang等[22]發(fā)現(xiàn)TR能夠直接與NLRP3結(jié)合進(jìn)而抑制NLRP3炎性小體的活化，與OLT1177、CY-09不同的是，TR對(duì)NLRP3炎性小體的抑制作用與NACHT結(jié)構(gòu)域的ATP酶活性無關(guān)，而是直接影響NLRP3與NLRP3的相互連接，進(jìn)而阻斷了NLRP3炎性小體的組裝。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎及NLRP3-AID小鼠模型應(yīng)用TR后，體內(nèi)IL-1β、IL-18濃度低于空白對(duì)照組，關(guān)節(jié)腔積液量減少，死亡率也明顯減低；痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)滑液細(xì)胞加入TR共培養(yǎng)后，caspase-1活化和IL-1β生成減少，且與TR的劑量存在相關(guān)性。后文即將提及的MCC950是公認(rèn)的NLRP3炎性小體強(qiáng)效特異性抑制劑，TR與MCC950的對(duì)照試驗(yàn)表明TR在體外的藥物效能約是MCC950的1/400，但在體內(nèi)其藥物效能約為MCC950的1/10～1/5，且TR不影響NLRC4或AIM2炎性小體，對(duì)鉀離子外流及線粒體損傷無作用，特異性較強(qiáng)。TR的相關(guān)研究為探索老藥的新作用提供了重要思路。

2 以ASC為作用靶點(diǎn)

NLRP3依賴性的ASC寡聚化被認(rèn)為是NLRP3炎性小體激活的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，ASC寡聚化后形成caspase-1活化的平臺(tái)即ASC斑點(diǎn)[23-24]。因此，抑制ASC寡聚化可抑制NLRP3炎性小體活化。

2.1 MCC950

2001年P(guān)erregaux等[25]首次發(fā)現(xiàn)二芳基磺酰脲復(fù)合物有抑制IL-1β分泌的功能，其中，MCC950被研究得最為深入，是一種公認(rèn)的強(qiáng)效特異性小分子NLRP3炎性小體抑制劑。MCC950通過抑制ASC的寡聚化和ASC斑點(diǎn)形成特異性地抑制NLRP3炎性小體的活化，低濃度的MCC950即能抑制尼日利亞菌素誘導(dǎo)的小鼠體內(nèi)骨髓來源巨噬細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞釋放IL-1β，該藥不影響鉀離子外流，也不作用于NLRC4、AIM2炎性小體。MCC950在NLRP3-AID小鼠模型體內(nèi)及從NLRP3-AID患者體內(nèi)提取的外周血單核細(xì)胞中均能有效抑制NLRP3炎性小體，體內(nèi)/外藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明其口服有效生物利用率高達(dá)68%[26]。

MCC950在除NLRP3-AID之外的其他疾病也可能發(fā)揮作用。帕金森病是一種常見的神經(jīng)退行性病變，α-突觸核蛋白是與該病相關(guān)的基因突變編碼蛋白，可以激活NLRP3炎性小體[5]。MCC950能夠通過血腦屏障，且口服有效，該藥可阻斷臨床前期帕金森病小鼠模型α-突觸核蛋白原纖維誘導(dǎo)的ASC寡聚化，下調(diào)NLRP3炎性小體的表達(dá)，最終減緩小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)黒質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元損害[27]。

Hout等[28]應(yīng)用MCC950治療心肌梗死豬模型(3～6 mg/kg，共7 d)，MCC950組與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清IL-1β濃度降低，左室射血分?jǐn)?shù)保留度高，通過伊文氏藍(lán)/TTC染色確定風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域(area at risk，AR)及梗死面積(infarct size，IS)發(fā)現(xiàn)前者的AR/IS值低于后者，提示MCC950具有改善心肌梗死預(yù)后的潛能。此外，對(duì)頸動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型應(yīng)用MCC950(10 mg/kg，3次/周，共4周)后觀察到小鼠頸部血管粥樣斑塊體積減小，血清IL-1β及血管細(xì)胞黏附分子(VCAM-1)濃度減低[29]。

2.2 β-羥丁酸

內(nèi)源性化合物β-羥丁酸(β-hydroxybutyrate，BHB)可阻斷ATP介導(dǎo)的ASC寡聚化及ASC斑點(diǎn)形成，部分抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)鉀離子的外流，從而負(fù)性調(diào)控炎性小體的裝配。由于BHB在人體內(nèi)的清除率較高，故常常將BHB和納米脂質(zhì)體聚合凝膠(nanolipogel, nLGs)同時(shí)使用以提高其在血液中的濃度以及生物活性。對(duì)注射MSU的小鼠應(yīng)用nLGs-BHB后，小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1β較對(duì)照組明顯減少。對(duì)NLRP3-AID小鼠模型以及MSU誘導(dǎo)腹膜炎小鼠模型應(yīng)用nLGs-BHB后均發(fā)現(xiàn)caspase-1活化降低，IL-1β產(chǎn)生減少[30]。

3 caspase-1抑制劑

VX-765是一類口服有效的caspase-1抑制劑，在小鼠體內(nèi)經(jīng)肝酶作用轉(zhuǎn)化為具有生物代謝活性的VRT-043198。Wannamaker等[31]發(fā)現(xiàn)VX-765可顯著降低健康小鼠血漿中LPS誘導(dǎo)釋放的IL-1β濃度，在劑量為100 mg/kg時(shí)效果最為顯著；對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型小鼠應(yīng)用VX-765(100 mg/kg，2次/d)后，關(guān)節(jié)的炎癥評(píng)分降低，與潑尼松龍(5 mg/kg)療效相當(dāng)。

目前普遍認(rèn)為神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)β-淀粉樣蛋白(amyloid-β，Aβ)聚集沉積形成斑塊是阿爾茲海默病的特征性病理學(xué)表現(xiàn)，而NLRP3炎性小體被證實(shí)參與到Aβ的聚集過程中[2]，對(duì)阿爾茲海默病小鼠模型應(yīng)用VX-765(3次/周，1～3周)后，小鼠顱內(nèi)Aβ沉積減少，瞬時(shí)和長(zhǎng)期記憶損傷的癥狀有所改善。淀粉樣前體蛋白(Aβ的前體物質(zhì))轉(zhuǎn)染的人類神經(jīng)元細(xì)胞加入VX-765共培養(yǎng)可減少神經(jīng)細(xì)胞軸突的串珠狀改變[32]。以上發(fā)現(xiàn)提示VX-765具有治療NLRP3炎性小體相關(guān)性疾病的潛在可能。

4 其他藥物

4.1 銅離子螯合劑四硫鉬酸鹽

細(xì)胞內(nèi)活性銅離子參與了人和小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎性小體活化過程[33]。適量的銅離子螯合劑能夠減輕LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)[34]。銅離子螯合劑四硫鉬酸鹽(tetrathiomolybdate，TTM)作為一類有效的銅離子螯合劑，目前在臨床上用于治療Wilison病及乳腺癌，安全性良好。超氧化物岐化酶(super-oxide dismutase 1，SOD1)是一種含銅生物酶，銅是酶分子的活性中心結(jié)構(gòu)并在催化反應(yīng)中傳遞電子，參與細(xì)胞內(nèi)抗氧化過程繼而降低胞內(nèi)ROS濃度，而線粒體來源的ROS被認(rèn)為是調(diào)控 NLRP3 炎性體活化的關(guān)鍵信號(hào)之一[9]。應(yīng)用TTM后進(jìn)行流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞ASC含量降低，成熟caspase-1的表達(dá)量減少，小鼠的內(nèi)毒素中毒癥狀也有所緩解。TTM不作用于AIM2、NLRC4及NLRP1炎性小體，不抑制NF-κB及MAPK通路，具有較強(qiáng)的選擇性。同時(shí)，還有研究證實(shí)TTM能夠抑制由銅-Aβ復(fù)合體導(dǎo)致氧化應(yīng)激而產(chǎn)生的ROS，因而可能具有治療阿爾茨海默病的作用，進(jìn)一步藥理實(shí)驗(yàn)還在進(jìn)行中[35]。

4.2 ω-3多不飽和脂肪酸

有研究發(fā)現(xiàn)ω-3多不飽和脂肪酸 ( ω-3 polyunsaturated fatty acid，ω-3PUFA) 能夠抑制包括IL-1β在內(nèi)的炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，但具體機(jī)制尚不明確[36]。另一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明血漿中ω-3 PUFA 含量增高可以顯著降低2型糖尿病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[37]。在此基礎(chǔ)上，Yan等[38]研究證實(shí)ω-3 PUFA抑制了NLRP3依賴性caspase-1的激活和IL-1β的分泌。G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor，GPR)120和GPR40與ω-3 PUFA的抗炎作用有關(guān)[39]，β-arrestin-2 (ARRB2) 是GRP120的下游支架蛋白[40]，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ω-3 PUFA可以促進(jìn)ARRB2和NLRP3蛋白結(jié)合，間接激活GPR120和GPR40獨(dú)立信號(hào)通路，下調(diào)NLRP3炎性小體的表達(dá)。2型糖尿病大鼠模型應(yīng)用ω-3 PUFA后其胰島素抵抗明顯改善，血糖控制趨于穩(wěn)定。

5 總結(jié)與展望

NLRP3炎性小體在多種炎癥性、代謝性疾病中發(fā)揮了重要作用，以NLRP3炎性小體為靶點(diǎn)治療NLRP3炎性小體相關(guān)性疾病具有廣闊的臨床前景(圖2)。本文所述NLRP3炎性小體抑制劑大多尚未開展臨床實(shí)驗(yàn)或正式應(yīng)用于臨床。目前仍有許多亟待解決的問題，如NLRP3炎性小體抑制劑的安全性如何評(píng)估，能否尋找到不同刺激劑激活NLRP3炎性小體的共同通路并加以抑制，能否聯(lián)合應(yīng)用不同類型的NLRP3炎性小體抑制劑等。深入探究NLRP3活化和調(diào)控機(jī)理并以此為基礎(chǔ)研發(fā)特異性NLRP3炎性小體抑制劑，為治療NLRP3炎性小體相關(guān)性疾病帶來了新的希望。

圖2NLRP3炎性小體結(jié)構(gòu)示意圖及不同抑制劑作用部位
Fig2Structure of NLRP3 inflammasome and targets of different inhibitors
注：NLRP3：核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3；ASC：凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白；LRRs：亮氨酸富集結(jié)構(gòu)域；NACHT：ATP酶活化有關(guān)的核苷酸寡聚結(jié)合域；CARD：caspase募集結(jié)構(gòu)域；PYD：pyrin結(jié)構(gòu)域；Pro-caspase-1：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1前體；caspase-1：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1；DA：多巴胺；Tranilast：曲尼司特；BHB：β-羥丁酸；pro-IL-18：白介素18前體；pro-IL-1β：白介素1β前體；IL-18：白介素18；IL-1β：白介素1β