LC-MS/MS快速測(cè)定血液中13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝產(chǎn)物

石銀濤，王繪軍，王俊偉，鄭經(jīng)，吳玉紅

（1.重慶市公安局物證鑒定中心，重慶 400021；2.重慶警察學(xué)院，重慶 401331；3.重慶市毒物毒品分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401331）

安眠鎮(zhèn)靜類藥物具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥以及中樞性肌肉松弛等作用，并且該類藥物具有價(jià)格便宜、易得、催眠鎮(zhèn)靜作用起效快、安全范圍大等特點(diǎn)，在臨床上廣泛使用。而安眠鎮(zhèn)靜類藥物的臨床不合理用藥、誤服誤用、自殺他殺、麻醉?yè)尳俸吐樽韽?qiáng)奸等導(dǎo)致每年都發(fā)生大量的安眠鎮(zhèn)靜類藥物攝毒案（事）件，引發(fā)公共安全事件和刑事案件[1-3]。安眠鎮(zhèn)靜類藥物具有用量小、代謝快、半衰期短等特點(diǎn)[4-5]，在體內(nèi)組織和體液中濃度很低。因此，開展安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝產(chǎn)物的高靈敏度檢測(cè)方法的研究對(duì)法庭刑事案件偵破和臨床診斷治療具有十分重要的意義。

目前，安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝產(chǎn)物的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法（gas chromatography，GC）[6]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[7-8]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[9-11]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[12-19]。GC和LC樣品中的基質(zhì)干擾使檢測(cè)容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，GC-MS方法檢出限高，容易出現(xiàn)漏檢。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）因具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好、線性動(dòng)態(tài)范圍寬等特點(diǎn)[20]，在安眠鎮(zhèn)靜類藥物檢驗(yàn)中應(yīng)用廣泛。然而，現(xiàn)有LC-MS/MS檢驗(yàn)方法絕大多數(shù)針對(duì)安眠鎮(zhèn)靜類藥物中的一種或幾種藥物進(jìn)行研究[13，16-17]，而且對(duì)其代謝產(chǎn)物的研究相對(duì)較少。面對(duì)多種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝產(chǎn)物的同時(shí)檢測(cè)要求，建立一種靈敏度高、專屬性強(qiáng)，快速、準(zhǔn)確、能同時(shí)檢測(cè)多種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝產(chǎn)物分析方法顯得尤為迫切。本研究旨在建立液液萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)血液中多塞平、米氮平、阿米替林、氯氮平、卡馬西平、地西泮、艾司唑侖、阿普唑侖、三唑侖、氯氮藍(lán)卓、氟硝西泮、氯硝西泮和代謝產(chǎn)物7-氨基氯硝西泮共13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Triple Quad 5500 LC-MS/MS系統(tǒng)（美國(guó)SCIEX公司），ACQUITY Ultra Performance LCTM系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司），Allegra X-22R Centrifuge型冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司），Direct-Q3型純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司），ML104電子天平（萬(wàn)分之一，瑞士Mettler-Toledo公司）。

乙腈、甲醇、甲酸銨、甲酸（色譜純，美國(guó)TEDIA公司），其他試劑均為分析純。

多塞平、米氮平、阿米替林、氯氮平、卡馬西平、地西泮、艾司唑侖、阿普唑侖、三唑侖、氯氮藍(lán)卓、氯硝西泮、氟硝西泮、7-氨基氯硝西泮和地西泮-d5，純度≥98.0%，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)品和地西泮-d5分別用甲醇配制成10μg/mL的儲(chǔ)備液，于-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩Ｉ鲜鰞?chǔ)備液根據(jù)需要用甲醇稀釋成不同質(zhì)量濃度的13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液。地西泮-d5用甲醇稀釋成1μg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

1.2 樣品前處理

取血液1mL置于15mL具塞離心管中，加入50μL地西泮-d5內(nèi)標(biāo)工作液（1 μg/mL），加入7 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩10 min，以離心半徑10 cm，9 500 r/min，離心5min，取上清液，于40℃用氮?dú)獯蹈桑眉状级ㄈ葜?00 μL，渦旋，離心，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜后，供LC-MS/MS分析。

1.3 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：ACQUITY Ultra Performance LC?BEH C18（100mm×2.1mm，1.7μm）；流動(dòng)相為甲醇（A）和含20mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸水溶液（B）。梯度洗脫程序：0～1.0 min，90%B；1.0～2.0 min，90%～10%B；2.0～4.0 min，10%B；4.0～4.1 min，10%～90%B；4.1～7.0min，90%B；總采樣時(shí)間為7min；流速0.3mL/min；柱溫35℃；進(jìn)樣量2μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧正離子-多反應(yīng)監(jiān)測(cè)檢測(cè)；氣簾氣為20 psi，離子源霧化氣為60 psi，離子源加熱輔助氣為55 psi，碰撞氣為8，噴霧電壓為5 500 V，加熱器溫度為550℃。

1.4 方法學(xué)驗(yàn)證

1.4.1 選擇性

6個(gè)不同來(lái)源的空白血液樣品按“1.2節(jié)”方法處理后進(jìn)行LC-MS/MS分析，觀察血液中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物的檢測(cè)是否有干擾。

1.4.2 提取樣品pH值的選擇

取空白血液1mL于15mL具塞離心管中，添加的13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液制成50μg/L的樣品，用稀鹽酸調(diào)節(jié)樣品pH值為3和5，用飽和Na2CO3溶液調(diào)節(jié)pH值為9和11，空白血液的pH值為7，按“1.2節(jié)”方法處理、分析，比較樣品pH值分別為3、5、7、9和11時(shí)的提取回收率。

1.4.3 線性關(guān)系與檢出限

取空白血液1 mL于15 mL具塞離心管中，加入13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成質(zhì)量濃度為0.1～200 μg/L系列血樣樣品，按“1.2節(jié)”方法處理、分析。以血液中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以血液中目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積之比（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。

1.4.4 準(zhǔn)確度和精密度

取空白血液1mL于15mL具塞離心管中，添加不同量的13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別配制成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（10、50、200 μg/L）的血液樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn)6份樣品，按“1.2節(jié)”方法處理、分析，連續(xù)測(cè)定3 d。準(zhǔn)確度用偏倚（%）表示，日內(nèi)精密度（relative standard deviations，RSD）和日間精密度（RSD）計(jì)算公式如下：

式中，X為平均濃度，μ為標(biāo)準(zhǔn)添加濃度，Sw和Sb分別為日內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差和日間標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.4.5 回收率

取空白血液1mL于15mL具塞離心管中，將13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別配制成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的血液樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn)6份樣品，按“1.2節(jié)”方法處理，按1.3節(jié)分析后的色譜峰面積（S3）與空白樣品基質(zhì)提取液添加相應(yīng)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后的色譜峰面積（S2）的比值計(jì)算回收率（RE）。

1.4.6 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指基質(zhì)中的共提取干擾物影響目標(biāo)物的離子化，從而使目標(biāo)物在儀器上的響應(yīng)發(fā)生增強(qiáng)或抑制。因此，需要對(duì)目標(biāo)物在不同基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，并根據(jù)評(píng)價(jià)結(jié)果選擇適合的方法對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行抵消[21]。分別測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰面積（S1）和空白樣品基質(zhì)提取液添加標(biāo)準(zhǔn)溶液后的色譜峰面積（S2），以比值S2/S1（%）評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜及質(zhì)譜條件的選擇

2.1.1 色譜條件的選擇

本實(shí)驗(yàn)選取C18色譜柱作為分析用色譜柱。實(shí)驗(yàn)比較了甲醇和乙腈、0.1%甲酸水溶液和含20 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸水溶液、等度洗脫和梯度洗脫對(duì)分析結(jié)果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：梯度洗脫優(yōu)于等度洗脫，選擇甲醇梯度洗脫分析時(shí)，各化合物的分離效果好，響應(yīng)值高，基質(zhì)干擾弱。含20mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸水溶液優(yōu)于0.1%甲酸水溶液，加少量的鹽后，各化合物的保留時(shí)間穩(wěn)定。因此，選用20mmol/L甲酸銨（含0.1%甲酸）水溶液-甲醇為流動(dòng)相。

2.1.2 質(zhì)譜條件的選擇

本研究中13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物結(jié)構(gòu)中有易于和H+結(jié)合的帶有孤對(duì)電子的N原子，因此選擇電噴霧正離子（ESI+）作為電離模式。采用針泵直接進(jìn)樣，確定目標(biāo)物的母離子，采用子離子掃描方式進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，按照響應(yīng)強(qiáng)度從高到低的原則選取兩個(gè)以上的碎片作為子離子，并優(yōu)化各子離子的電壓參數(shù)。13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物、內(nèi)標(biāo)的具體質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物、內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 Mass spectrum parameters of 13 hypnotic and sedative drugs，their metabolites and internal standards

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 選擇性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，6個(gè)不同來(lái)源的空白血液樣品的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物的測(cè)定，該方法的專屬性良好。圖1為添加標(biāo)準(zhǔn)品（100μg/L）和添加內(nèi)標(biāo)的血液樣品的總離子圖。

2.2.2 提取樣品pH值選擇

隨著pH值的增加，目標(biāo)物的提取回收率也逐漸提高，但當(dāng)pH=9、pH=11時(shí)，目標(biāo)物的回收率依次降低，在pH=7時(shí)回收率最高。故樣品pH值最終選擇為7。

圖1 血液樣品的總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of blood sample

2.2.3 線性關(guān)系及檢出限

血液中13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表2。在5～200μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，血液中13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物均呈良好的線性關(guān)系。

表2 目標(biāo)物的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Tab.2 Linear equation，correlation coefficient and detection limit of targets

2.2.4 準(zhǔn)確度和精密度

配制含13種目標(biāo)物10、50、200μg/L 3種質(zhì)量濃度的血液樣品各6份，按“1.2節(jié)”方法處理、按“1.3節(jié)”分析，連續(xù)測(cè)定3 d。計(jì)算各濃度血樣測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度。用上述3種質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)血液樣品，1d內(nèi)分析6次，得日內(nèi)RSD；連續(xù)測(cè)定3 d，每天1次，得日間RSD。日內(nèi)和日間RSD不大于8.6%，準(zhǔn)確度（偏倚）在±9.8%范圍內(nèi)（表3）。

2.2.5 回收率

血液中13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物在3個(gè)添加質(zhì)量濃度（10、50、200 μg/L）的回收率見表 3。13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物的平均回收率在71.2%～93.4%，滿足日常檢案的要求。

表3 目標(biāo)物的準(zhǔn)確度、回收率、基質(zhì)效應(yīng)和精密度Tab.3 Accuracy，recovery，matrix effect and precision of targets （%）

續(xù)表3Continued Tab.3

2.2.6 基質(zhì)效應(yīng)

目標(biāo)物在10、50和200 μg/L質(zhì)量濃度時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)值說(shuō)明血液中基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的測(cè)定具有較強(qiáng)的抑制作用（表3）。由于基質(zhì)效應(yīng)明顯，本研究最終采用內(nèi)標(biāo)法以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.3 實(shí)際案例分析

重慶居民譚某于某年12月4日18：00左右在江北區(qū)一家火鍋店和朋友一起吃飯，吃完飯后和幾個(gè)朋友打牌，在打牌過(guò)程中譚某感覺(jué)意識(shí)不清、昏昏欲睡，并被詐騙21萬(wàn)元。次日10：00左右提取譚某血液。使用本研究建立的方法對(duì)受害人譚某的血液進(jìn)行13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝物的定性定量檢測(cè)，從血液中檢出氯硝西泮和7-氨基氯硝西泮，質(zhì)量濃度分別為 22.3 μg/L 和 196.9 μg/L（圖 2）。據(jù)犯罪嫌疑人交代，在譚某喝的啤酒中投入了安眠鎮(zhèn)靜類藥物。

CHèZE等[22]報(bào)道的麻醉?yè)尳侔福芎θ孙嬘?瓶含有2.1mg氯硝西泮的啤酒很快入睡，尿液中檢出氯硝西泮和7-氨基氯硝西泮的質(zhì)量濃度分別為17.8μg/L和561.7μg/L，尿液中7-氨基氯硝西泮的質(zhì)量濃度遠(yuǎn)大于氯硝西泮的質(zhì)量濃度。本研究中血液中7-氨基氯硝西泮的質(zhì)量濃度遠(yuǎn)大于氯硝西泮的質(zhì)量濃度，可能與采樣時(shí)間距離案發(fā)時(shí)間較長(zhǎng)有關(guān)。

圖2 實(shí)際樣品的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig.2 Multi reaction monitoring chromatogram of actual sample

3 結(jié) 論

本研究結(jié)合液液提取與LC-MS/MS技術(shù)，建立了同時(shí)測(cè)定血液中13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝產(chǎn)物的分析方法。該方法簡(jiǎn)便快速、專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好，最低檢出限為0.1～1.0 μg/L。實(shí)際案例分析結(jié)果表明，該法適于分析血液中13種安眠鎮(zhèn)靜類藥物及其代謝產(chǎn)物，在法庭與臨床毒物分析中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。