MLCK 在慢性心力衰竭中作用機(jī)制的研究

楊 楠，李雪萍，宋 梅，李 亞，許鋼柱

（1.西安醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710021；2.陜西省西安市西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，陜西 西安 710000；3.陜西省西安市西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710000）

心力衰竭（heart failure）是心血管疾病發(fā)展的最終階段，其是一種涉及多種過(guò)程的臨床綜合征，由許多細(xì)胞變化引起的復(fù)雜性疾病，包括影響多種肌原纖維蛋白磷酸化的變化，5 年病死率高達(dá)50%，其日益增加的發(fā)病率也為人類造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)[1-3]。肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK）是調(diào)節(jié)肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈（RLC）的關(guān)鍵酶，肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈磷酸化在心肌中通過(guò)調(diào)節(jié)鈣/鈣調(diào)素增加Ca2+敏感性來(lái)調(diào)控心肌細(xì)胞的收縮，研究表明[4]，MLCK 是維持正常心臟功能所必需的一種激酶，其在調(diào)節(jié)心功能中起著重要的作用。既往研究發(fā)現(xiàn)[5，6]，心肌MLCK 是在心力衰竭細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，它可能不僅在心臟的生理表現(xiàn)中，而且在病理生理應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)中發(fā)揮作用。本文主要就MLCK 分子家族成員及分布、MLCK 在心肌收縮中的作用及MLCK 與慢性心力衰竭的關(guān)系作一綜述。

1 MLCK 分子家族成員及分布

MLCK 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋激酶家族中的一員[7]，參與重要的生命活動(dòng)，由MLCK1、2、3 和4 四種激酶組成，它們分別由MYLK1、MYLK2、MYLK3 和MYLK4 四種不同的基因編碼[6，8，9]。根據(jù)其對(duì)不同肌類型的表達(dá)特異性，MLCK1 被稱為平滑肌MLCK（smMLCK），主要存在于平滑肌細(xì)胞中；MLCK2 被稱為骨骼肌MLCK（skMLCK），主要存在于骨骼肌細(xì)胞中；MLCK3 被稱為心肌MLCK（cMLCK），存在于心肌細(xì)胞中；MLCK4是最新被發(fā)現(xiàn)的可能是另一種不同于MLCK3 的心肌MLCK，其僅在心肌細(xì)胞中選擇性表達(dá)，這些激酶在肌肉的收縮和舒張中起著至關(guān)重要的作用。

MLCK1 在平滑肌組織中的表達(dá)水平最高，但它不是一種平滑肌特異性蛋白，在心肌組織中也有表達(dá)[10]；MLCK2 不僅在骨骼肌中表達(dá)，在心肌中也有少量表達(dá)[11,12]；MLCK3 僅在心室和心房中特異表達(dá)[5]，cMLCK 是維持正常心臟生理功能基礎(chǔ)的一種激酶，其對(duì)維持正常的心肌收縮和舒張非常重要[4]。粗肌絲的結(jié)構(gòu)是決定心肌性能的重要因素，粗纖維主要由肌球蛋白（myosin）和肌球蛋白結(jié)合蛋白（MyBPC）組成，肌球蛋白是一種運(yùn)動(dòng)蛋白，由1 條重鏈（myosin heavy chain，MHC）和2 條輕鏈（myosin light chain，MLC）構(gòu)成，MLC 則包含1 對(duì)基本輕鏈（ELC）和1 對(duì)調(diào)節(jié)性輕鏈（RLC），MHC 可以與ELC 和RLC 兩條輕鏈結(jié)合，并與相鄰的MyBP-C 相互作用，從而調(diào)節(jié)心肌收縮[13]。cMLCK 是磷酸化RLC 的主要激酶，右心室和浦肯野纖維中cMLCK 和RLC磷酸化的表達(dá)高于左心室[14]。有研究表明[12]，在左室中心尖和心外膜MLCK 含量較心底和心內(nèi)膜含量高，RLC 磷酸化水平也呈梯度變化，表現(xiàn)為內(nèi)層低、外層高，這種梯度是心肌細(xì)胞外層磷酸酶活性降低形成的，可能是導(dǎo)致心肌細(xì)胞跨比不均勻收縮特性的關(guān)鍵[15,16]。在小鼠新生心肌細(xì)胞中，cMLCK 廣泛分布于胞漿中，RLC 的N-末端區(qū)域包含MLCK 特異性磷酸化位點(diǎn)，但在某些區(qū)域cMLCK 不與其基質(zhì)RLC 結(jié)合[5]，這一發(fā)現(xiàn)表明cMLCK 磷酸化RLC 可能僅僅是其功能的一部分。正常小鼠和人體心臟中，心肌細(xì)胞RLC 磷酸化水平保持恒定，占RLC 總量的30%～40%[17,18]，而在RNA 抑制導(dǎo)致cMLCK 表達(dá)缺失的心肌中，心肌RLC 的磷酸化水平僅降低50%，這表明其他激酶也發(fā)揮了重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn)MLCK4 在心肌中也有大量表達(dá)，但與其他MLCK 家族成員不同的是，MLCK4 有一個(gè)“假調(diào)節(jié)螺旋”（PRH）代替了一個(gè)完整的自我調(diào)節(jié)片段。從MLCK4 的晶體結(jié)構(gòu)和與其他MLCK 家族成員的序列比較，MLCK4 是一種無(wú)鈣/鈣調(diào)素依賴性的活性激酶[9]。心肌細(xì)胞中MLCK4 的表達(dá)是cMLCK 的20倍[19]，但MLCK4 的Vmax 值是cMLCK 的50 倍，提示MLCK4 可能是使心肌細(xì)胞RLC 磷酸化的又一個(gè)重要貢獻(xiàn)者[9]?？傊?，四種不同類型的MLCK 在心肌組織中均有表達(dá)，可通過(guò)磷酸化RLC 調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的收縮。

2 MLCK 在心肌收縮中的作用

近年來(lái)研究表明心肌RLC 的磷酸化可增強(qiáng)心臟的收縮速度和收縮力，而MYLK3 基因編碼的cMLCK 是磷酸化RLC 的主要激酶[20]。Hodatsu A 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，MLCK 激活RLC 磷酸化并誘導(dǎo)肌節(jié)組織收縮，心肌細(xì)胞中MLCK 介導(dǎo)肌節(jié)收縮存在多種機(jī)制，一種可能是通過(guò)RLC 磷酸化改變肌球蛋白的構(gòu)象，這促進(jìn)肌球蛋白絲的形成；另一種可能是促進(jìn)肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白的相互作用。此外，MLCK 可能作為一種適應(yīng)機(jī)制，在肥大刺激的影響下增加心肌細(xì)胞內(nèi)鈣水平，從而使心肌最大收縮力增強(qiáng)。

心肌收縮蛋白包括肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白和原肌凝蛋白3 種蛋白組成，心肌收縮和舒張是由肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白的相互作用驅(qū)動(dòng)的，并與ATP 的水解作用相結(jié)合[22]，鈣與肌鈣蛋白的結(jié)合觸發(fā)肌動(dòng)蛋白細(xì)肌絲的激活，這使鄰近的肌動(dòng)蛋白粗肌絲的頭部區(qū)域能夠強(qiáng)烈地附著在肌動(dòng)蛋白結(jié)合位點(diǎn)上，引起肌球蛋白頭部結(jié)構(gòu)域部分小構(gòu)象變化，導(dǎo)致肌肉收縮[23]。心臟RLC 在很大程度上是由MLCK 磷酸化的，在外源性MLCK 浸泡的心肌纖維中，它能誘導(dǎo)激活最大水平的鈣[18]。此外，在含有丙氨酸殘基取代N 末端絲氨酸的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)心臟RLC 水平降低且心肌收縮力明顯受損[24]。cMLCK 磷酸化RLC 可提高離體心肌纖維的鈣敏感性，并被認(rèn)為可以控制完整心臟的收縮力和肌力，增強(qiáng)心肌的收縮功能[25]。

肌動(dòng)蛋白是一種二聚蛋白質(zhì)，哺乳動(dòng)物有4 個(gè)肌動(dòng)蛋白基因，分別為ACTN1、ACTN2、ACTN3 和ACTN4，α-肌動(dòng)蛋白2 由ACTN2 基因編碼，它是心肌中的主要Z 盤蛋白，由3 個(gè)肌動(dòng)蛋白結(jié)合位點(diǎn)和兩對(duì)EF-手型基序組成。ACTN2 通過(guò)促進(jìn)肌動(dòng)蛋白的作用在肌節(jié)組織中起關(guān)鍵作用，ACTN2 與缺血性和非缺血性心力衰竭顯著相關(guān)，并且在左室舒張不良和射血分?jǐn)?shù)降低的心力衰竭中起作用，提示其在各種初始損傷導(dǎo)致左心室不良重構(gòu)的機(jī)制中可能起作用[26]，它的基因突變還可導(dǎo)致肥厚性心肌病[27]。有研究表明[28]，cMLCK 主要在Z 盤表達(dá)，在肌節(jié)中也有部分表達(dá)，與具有高親和力的α-肌動(dòng)蛋白2 相互作用調(diào)節(jié)心肌收縮功能。因此，MLCK 家族中cMLCK 是引起心肌組織收縮的主要激酶，其主要通過(guò)作用于肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白，從而調(diào)節(jié)心肌的收縮與舒張。

3 MLCK 與慢性心力衰竭的關(guān)系

心肌肌球蛋白輕鏈激酶（cMLCK）的表達(dá)和RLC 磷酸化降低與慢性心力衰竭有關(guān)，cMLCK 是負(fù)責(zé)RLC 磷酸化的主要激酶，cMLCK 的表達(dá)減少可以降低心肌RLC 磷酸化水平，從而導(dǎo)致心力衰竭[9]。在動(dòng)物模型中，無(wú)論是cMLCK 的消融還是RLC 磷酸化本身都會(huì)導(dǎo)致心肌功能障礙和病理性肥大[4，17]。相反，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型中增加RLC 磷酸化具有心臟保護(hù)功能[29]。有研究發(fā)現(xiàn)[30]，smMLCK 也可使RLC的磷酸化，smMLCK 在平滑肌和心臟RLC 磷酸化方面同樣有效，且體內(nèi)心臟磷酸化可能依賴于130 kDa smMLCK 的活性，故smMLCK 可能是心臟衰老或疾病導(dǎo)致相關(guān)cMLCK 表達(dá)下降的后備激酶。絲氨酸15（S15）是心肌RLC 最重要的磷酸化位點(diǎn)[6]，人心室肌球蛋白輕鏈激酶可使心肌肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈S15磷酸化，從而改變心肌RLC 的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并調(diào)節(jié)心肌組織對(duì)Ca2+的敏感性，進(jìn)而調(diào)節(jié)心肌收縮力。目前有研究表明[31]，smMLCK 能特異性地磷酸化豬心室肌球蛋白和雞胃平滑肌肌球蛋白中的肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈S15（平滑肌中的S20）。在橫紋肌組織中表達(dá)130 kDa 的smMLCK，除了調(diào)節(jié)心肌肌球蛋白的活性外，還可能調(diào)節(jié)在這些組織中表達(dá)的非肌肌球蛋白Ⅱ的運(yùn)動(dòng)活性。也有研究表明[10]，smMLCK 在心肌細(xì)胞搏動(dòng)中有表達(dá)。因此在心臟發(fā)育過(guò)程中，smMLCK 可能參與調(diào)節(jié)肌球蛋白運(yùn)動(dòng)，并在維持心肌搏動(dòng)中發(fā)揮作用。

收縮期心肌收縮的激活是通過(guò)鈣與肌鈣蛋白C（TnC）的結(jié)合進(jìn)行的，這會(huì)引起肌鈣蛋白Ⅰ（TnⅠ）、肌鈣蛋白T（TnT）和肌鈣蛋白（Tm）之間的構(gòu)象變化和相互作用的改變[13]。Sevrieva IR 等[32]研究發(fā)現(xiàn)，cMLCK 并不是一個(gè)專門的肌球蛋白激酶，它還可以以鈣/鈣調(diào)素依賴的方式磷酸化人心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cTnⅠ），它還是肌絲鈣敏感性和松弛動(dòng)力學(xué)的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子。cMLCK 的離體蛋白制劑在肌肉纖維的環(huán)境中能在絲氨酸23（S23）上特異性地磷酸化人cTnⅠ，這對(duì)心肌的收縮功能具有重要的意義。心力衰竭發(fā)展過(guò)程中β 腎上腺素能使受體脫敏導(dǎo)致cTnⅠ脫磷，通過(guò)受損的長(zhǎng)度依賴性激活（心臟FrankStarling 定律）導(dǎo)致心肌功能障礙，因此，通過(guò)調(diào)節(jié)cMLCK 活性來(lái)增加心力衰竭心臟cTnⅠ磷酸化是開(kāi)發(fā)新的心力衰竭干預(yù)措施的潛在新靶點(diǎn)。Warren SA 等[33]敲除cMLCK 基因的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，左心室明顯增大且左室收縮功能減退，并出現(xiàn)了嚴(yán)重的收縮和舒張功能障礙，而cMLCK 基因過(guò)表達(dá)的小鼠心室大小和心肌收縮力沒(méi)有明顯變化，其原因可能為cMLCK 表達(dá)的減少導(dǎo)致RLC 磷酸化的減少，在介導(dǎo)心臟從代償性肥大向失代償性肥大的轉(zhuǎn)變中起著關(guān)鍵作用，在慢性心力衰竭的發(fā)展中，泛素-蛋白酶體依賴性蛋白降解可能加速了cMLCK蛋白降解，使得RLC 磷酸化水平降低導(dǎo)致心臟由代償性肥厚向失代償性心力衰竭轉(zhuǎn)變。而cMLCK 的大量表達(dá)可減輕壓力超負(fù)荷下心力衰竭的發(fā)展，對(duì)正常心功能則無(wú)明顯不良影響。Hodatsu A 等[21]在一項(xiàng)納入日本149 例（男性109 例，女性40 例）無(wú)血緣關(guān)系的擴(kuò)張性心肌?。―CM）患者的研究中發(fā)現(xiàn)了外顯子9 的剪接受體位點(diǎn)的一個(gè)單突變（p.Pro639Valfs*15），mRNA 衍生的反轉(zhuǎn)錄PCR 產(chǎn)物的序列分析表明，p.Pro639Valfs*15 引起外顯子突變，并產(chǎn)生一個(gè)早熟的末端密碼子，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)截短，而在200 名正常人中則未檢測(cè)到該堿基突變；且該研究還發(fā)現(xiàn)，心肌即使在高濃度的突變cMLCK 中也完全缺乏磷酸化，但野生型cMLCK 的激酶磷酸化則呈正常，此外該突變僅在DCM 患者中觀察到。因此，cMLCK 中基因的截?cái)嗤蛔儯╬.Pro639Valfs*15）與DCM 相關(guān)的心功能障礙的發(fā)生密切相關(guān)。Fazal F 等[34]用ML-7 特異性抑制心肌細(xì)胞中MLCK 后，RLC 磷酸化水平降低，激活誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的Caspase 通路，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，心肌收縮功能降低，最終導(dǎo)致心力衰竭。由此可見(jiàn)，smMLCK 與cMLCK共同參與慢性心力衰竭的發(fā)展過(guò)程，其主要通過(guò)降低RLC 磷酸化水平，使心肌收縮力減弱，進(jìn)而由心肌病代償性肥厚誘發(fā)心臟失代償即慢性心力衰竭。此外，cMLCK 基因突變與心功能障礙密切相關(guān)，可盡早開(kāi)展該靶點(diǎn)的治療，預(yù)防心臟疾病的發(fā)生。

4 總結(jié)

近年來(lái)MLCK 對(duì)RLC 的磷酸化一直是臨床研究的熱點(diǎn)，因RLC 磷酸化水平的降低在心臟病和心力衰竭中起關(guān)鍵作用，4 種不同類型的MLCK 在心肌組織中均有表達(dá)，其中smMLCK 與cMLCK 參與慢性心力衰竭的發(fā)展過(guò)程，可通過(guò)調(diào)節(jié)肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白和肌鈣蛋白來(lái)調(diào)節(jié)心肌收縮。cMLCK 是負(fù)責(zé)心肌RLC 磷酸化的最主要激酶，其心功能減退密切相關(guān)，可能是緩解心臟疾病的一個(gè)治療靶點(diǎn)，也可能為慢性心力衰竭的治療提供新的方向。