利用多重PCR鑒定西瓜雜交種純度

楊會(huì)會(huì) 李賀威 趙永威 袁升凱 楊路明 胡建斌 孫守如 馬長(zhǎng)生 朱華玉

摘 要： 為快速、高效鑒定西瓜雜交種純度，建立一套完善的SSR分子標(biāo)記鑒定體系，利用覆蓋西瓜全基因組的192對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)小果型西瓜品種‘錦霞八號(hào)親本進(jìn)行多態(tài)性篩選，共獲得36個(gè)條帶清晰、多態(tài)性好的SSR標(biāo)記，多態(tài)性率為18.8%，這些標(biāo)記分別位于西瓜第1、2、3、4、5、6、8、10、11號(hào)染色體。根據(jù)這些多態(tài)性標(biāo)記的擴(kuò)增片段大小，從中選出4對(duì)進(jìn)行雙重PCR和三重PCR分組擴(kuò)增，成功建立了‘錦霞八號(hào)雜交種的雙重和三重PCR純度鑒定體系。3組標(biāo)記鑒定結(jié)果基本吻合，‘錦霞八號(hào)雜交種的純度為100%。將標(biāo)記鑒定結(jié)果與田間形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果對(duì)比，2種方法鑒定的結(jié)果高度一致。將三重PCR技術(shù)用于鑒定西瓜雜交種純度，為西瓜雜交種純度快速高效鑒定奠定了研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 西瓜; 分子標(biāo)記; 多重PCR; 純度鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)：S651? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ?文章編號(hào)：1673-2871（2020）02-017-05

Identification of purity of watermelon hybrids by multiplex PCR

YANG Huihui1， LI Hewei1， ZHAO Yongwei2， YUAN Shengkai1，2， YANG Luming1， HU Jianbin1， SUN Shouru1， MA Changsheng1，2， ZHU Huayu1

（1. College of Horticulture， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China; 2. Henan Yuyi Seed Industry Technology Development Co.， Ltd.， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： In order to quickly and efficiently identify the purity of watermelon hybrids， a complete SSR molecular marker identification system was established. In this study， 192 pairs of SSR markers covering the whole genome of watermelon were used to screen polymorphisms of the small fruit watermelon variety ‘Jinxia No. 8， and 36 bands with clear and polymorphic SSR markers were obtained，the polymorphism rate was 18.8%， and these markers were located on chromosomes 1， 2， 3， 4， 5， 6， 8， 10， and 11， respectively. Based on the amplified fragment size of these polymorphic markers， 4 pairs were selected for double PCR and triple PCR group amplification， and the double and triple PCR purity identification systems of ‘Jinxia No. 8 hybrids were successfully established.The results of the three pairs of markers were basically consistent， and the purity of the ‘Jinxia No.8 hybrid was 100%. The results of marker identification were highly consistent with those of field morphological identification.For the first time， the triple PCR technique was used to identify the purity of watermelon hybrids， which laid a solid foundation for the efficient and rapid identification of watermelon hybrids.

Key words： Watermelon; Moleculer marker; Multiplex PCR; Purity identification

西瓜（Citrullus lanatus）為葫蘆科西瓜屬一年蔓生草本植物，是世界上重要的園藝作物之一。中國(guó)是西瓜最大的生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)，西瓜栽培歷史悠久。在育種過(guò)程中，因品種鑒定所需周期較長(zhǎng)，費(fèi)用較高，且鑒定的結(jié)果具有不確定性，所以種子的純度鑒定是一項(xiàng)難題，而種子的質(zhì)量直接影響農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)及農(nóng)民的收益，因此，對(duì)雜交種進(jìn)行純度鑒定以保證種子質(zhì)量及生產(chǎn)效益是極其必要的[1]。常用的種子純度鑒定方法有形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定易受環(huán)境、氣候和人為因素的影響，且存在費(fèi)時(shí)費(fèi)地費(fèi)力等缺點(diǎn)[2]。利用分子標(biāo)記技術(shù)能夠從DNA水平上檢測(cè)雜交種和親本之間的差異，克服了空間的限制，極大縮短了檢驗(yàn)所需時(shí)間[3]。目前常見(jiàn)的分子標(biāo)記有RAPD標(biāo)記、SRAP標(biāo)記、EST-SSR標(biāo)記等，但是利用這些標(biāo)記進(jìn)行純度鑒定具有局限性，而SSR標(biāo)記具有數(shù)量豐富、共顯性遺傳、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，適于進(jìn)行雜交種純度的鑒定[4-5]，如孫波等[6]利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)西瓜品種‘雪龍三號(hào)進(jìn)行種子純度鑒定，鑒定結(jié)果驗(yàn)證了西瓜品種的真實(shí)性。但是研究者多數(shù)是利用單一PCR擴(kuò)增鑒定品種真實(shí)性，此做法雖然可以區(qū)分出親本自交株，但是對(duì)于品種間的機(jī)械混雜則難以區(qū)分。

多重PCR（multiplex PCR，M-PCR）又稱復(fù)合PCR，是指在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入2對(duì)或多對(duì)引物，能同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段，其反應(yīng)原理、反應(yīng)試劑和操作過(guò)程與單一PCR相同。與單一PCR相比，多重PCR利用選取位于不同染色體的標(biāo)記進(jìn)行組合，不僅可以檢測(cè)出親本自交種，同樣可以鑒定出摻雜其中的其他品種。另外，多重PCR也可以節(jié)約一定的時(shí)間和試劑用量。劉子記等[1]利用兩重PCR對(duì)西瓜品種進(jìn)行純度鑒定，證明了雙重PCR可以有效提高檢測(cè)效率的可行性;吳明生等[7]利用三重引物進(jìn)行擴(kuò)增，促進(jìn)了SSR技術(shù)在玉米種子純度中的應(yīng)用;陳浩東等[8]最多利用4重PCR對(duì)雜交棉進(jìn)行純度鑒定，奠定了棉花雜交種快速鑒定的基礎(chǔ);胡倩梅等[9]利用多重PCR鑒定甜瓜種子，建議添加2對(duì)或3對(duì)標(biāo)記進(jìn)行多重PCR。目前，多重PCR應(yīng)用在西瓜品種純度鑒定的研究報(bào)道較少。

筆者以小果型西瓜品種‘錦霞八號(hào)為研究對(duì)象，選取部分多態(tài)性引物，建立不同的引物組合，將三重PCR技術(shù)應(yīng)用于西瓜雜交種的純度檢測(cè)，以期實(shí)現(xiàn)對(duì)西瓜品種快速而準(zhǔn)確的純度鑒定。

1 材料和方法

1.1 材料

供試西瓜品種‘錦霞八號(hào)及其父母本由河南豫藝種業(yè)科技發(fā)展有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 將‘錦霞八號(hào)種子200粒，親本各5粒，采用溫湯浸種，將種子用55～60 ℃熱水浸泡10～15 min后，用KMnO4 5 000倍液常溫浸泡6～8 h。浸種后于恒溫培養(yǎng)箱中32 ℃左右催芽。分別放置育苗盤(pán)育苗。待幼苗子葉展平后進(jìn)行采樣。

為保證DNA的質(zhì)量以及擴(kuò)增產(chǎn)物條帶的清晰度，利用改良CTAB法提取親本和雜交種的DNA。用微量核酸蛋白分析儀檢測(cè)DNA濃度及質(zhì)量。

1.2.2 SSR引物多態(tài)性分析 在Zhu等[10]從西瓜全基因組開(kāi)發(fā)的SSR引物中選出覆蓋西瓜全基因組的192對(duì)引物進(jìn)行引物篩選和多態(tài)性分析。以‘錦霞八號(hào)親本為材料進(jìn)行引物篩選，篩選出引物產(chǎn)物片段大小不同的標(biāo)記，便于進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè) 單一PCR反應(yīng)體系及程序：PCR反應(yīng)體系共10 ?L：模板1 ?L，引物1 ?L，Master Mix 5 ?L，ddH2O 3 ?L。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性94 ℃ 45 s，退火58～68 ℃ 1 min，8個(gè)循環(huán)，72 ℃ 1 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，20個(gè)循環(huán)，72 ℃ 1 min，72 ℃ 7 min，4 ℃保存。

多重PCR反應(yīng)體系及程序：在單一PCR 10 ?L反應(yīng)體系中加入2對(duì)或3對(duì)標(biāo)記，調(diào)整ddH2O體積，其余成分與單一PCR擴(kuò)增體系相同。反應(yīng)程序與單一PCR相同。

PCR產(chǎn)物用6%（w）聚丙烯酰胺凝膠電泳90 min，使用銀染法染色[11]，觀察分析電泳結(jié)果。

1.2.4 比較SSR分子標(biāo)記的純度鑒定結(jié)果與大田純度鑒定結(jié)果 根據(jù)PCR產(chǎn)物的電泳帶型，統(tǒng)計(jì)雜交種和非雜交種帶型的數(shù)量，計(jì)算雜交種純度。SSR鑒定品種純度/%=[（雜交種帶型的數(shù)量/總檢測(cè)數(shù)）]×100[12]。

田間純度鑒定結(jié)果由科研人員通過(guò)觀察株型、葉片、果形、果皮顏色等形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行鑒定。最后將SSR純度鑒定結(jié)果與田間種植的鑒定結(jié)果進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物篩選結(jié)果

將覆蓋西瓜全基因組的192對(duì)引物在‘錦霞八號(hào)親本間進(jìn)行多態(tài)性篩選，其中有36對(duì)引物在‘錦霞八號(hào)親本及F1之間具有多態(tài)性，多態(tài)性比率為18.8%（表1），分別位于西瓜第1、2、3、4、5、6、8、10、11號(hào)染色體。

2.2 SSR標(biāo)記分組及多重PCR建立

根據(jù)表1中引物擴(kuò)增片段的大小和多態(tài)性差異，選取位于不同染色體上的4對(duì)引物ClSSR03386（232 bp）、ClSSR04334（245 bp）、ClSSR0309843（132 bp）、ClSSR16601（197 bp）進(jìn)行多重PCR分組及擴(kuò)增。進(jìn)行多重PCR組合時(shí)，以擴(kuò)增片段相差至少大于35 bp進(jìn)行分組，兩重PCR組：ClSSR03386和ClSSR09843，ClSSR04334和ClSSR09843;三重PCR組合：ClSSR03386、ClSSR09843、ClSSR16601。

2.3 ‘錦霞八號(hào)純度的鑒定

利用兩重PCR和三重PCR組合對(duì)200份‘錦霞八號(hào)雜交種進(jìn)行純度鑒定。首先對(duì)兩重PCR組合進(jìn)行擴(kuò)增（圖1～2），電泳條帶明顯分布在2個(gè)區(qū)域，第一區(qū)域?yàn)橐顲lSSR03386多態(tài)性片段分布區(qū)域，第二區(qū)域?yàn)橐顲lSSR09843多態(tài)性片段分布區(qū)域。由圖1可知，引物ClSSR03386和引物ClSSR09843在200個(gè)單株中均能擴(kuò)增出清晰條帶，且為父母本雜合帶型。

由圖3可知，同時(shí)對(duì)三重PCR組合進(jìn)行擴(kuò)增，電泳條帶明顯分布在3個(gè)區(qū)域，第1區(qū)域?yàn)橐顲lSSR03386多態(tài)性片段分布區(qū)域，第2區(qū)域?yàn)橐顲lSSR16601多態(tài)性片段分布區(qū)域，第3區(qū)域?yàn)橐顲lSSR09843多態(tài)性片段分布區(qū)域。引物ClSSR03386、ClSSR16601和ClSSR09843均能擴(kuò)增出條帶，且為父母本雜合帶型。

將兩重PCR結(jié)果與三重PCR結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果表明，利用兩重PCR和三重PCR對(duì)‘錦霞八號(hào)雜交種進(jìn)行純度鑒定的結(jié)果完全一致，由此得出‘錦霞八號(hào)西瓜品種的純度為100%。

2.4 SSR標(biāo)記與田間純度鑒定的比較

田間種植中，在果實(shí)發(fā)育期通過(guò)觀察株型、葉片、果形、果皮顏色等形態(tài)指標(biāo)，對(duì)‘錦霞八號(hào)進(jìn)行鑒定，其田間純度為98.8%。多重PCR鑒定結(jié)果與田間種植鑒定結(jié)果純度偏差為100%-98.8%=1.2%，符合純度鑒定中允許的誤差范圍（2%）。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，利用SSR標(biāo)記可用于鑒定西瓜雜交種純度，而多重PCR可以快速而準(zhǔn)確地鑒定西瓜雜交種純度，保證品種的真實(shí)性。

3 討論與結(jié)論

目前市場(chǎng)上銷(xiāo)售的西瓜種子均為雜交一代，種子純度是其質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[13]。按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，西瓜雜交品種的純度必須高于95%[14]。在人工生產(chǎn)種子的過(guò)程中，母本去雄不徹底、機(jī)械混雜和生物學(xué)混雜等原因都會(huì)降低種子純度。綜合前人對(duì)西瓜品種純度鑒定的研究，多數(shù)研究者利用單一的PCR擴(kuò)增確定品種的真實(shí)性，雖然可以區(qū)分出親本自交種，但對(duì)品種間的機(jī)械混雜鑒定存在局限性。前人證實(shí)了SSR分子標(biāo)記技術(shù)的可行性[15]。孫波等[6]利用23對(duì)SSR核心引物對(duì)西瓜品種進(jìn)行純度鑒定，其結(jié)果充分說(shuō)明了SSR分子標(biāo)記鑒定品種純度的可靠性。張佩倫等[16]利用SSR標(biāo)記對(duì)4個(gè)西瓜品種進(jìn)行純度鑒定，其結(jié)果與田間形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果高度一致。利用單一引物進(jìn)行雜交種純度鑒定時(shí)，多數(shù)研究者大多采取熱堿法、SDS法等快速提取植物基因組DNA的方法;但是利用多重PCR進(jìn)行鑒定時(shí)多數(shù)研究者則是采取CTAB法提取DNA[17-18];常宏等[19]在對(duì)玉米種子真實(shí)性的鑒定中得出，相比較CTAB法和熱減法提取的DNA，CTAB法提取的DNA質(zhì)量較高，且電泳結(jié)果主帶較清晰;而熱減法提取的DNA質(zhì)量較差，主帶出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾。胡倩梅等[9]利用堿裂法提取甜瓜葉片DNA，構(gòu)建多重PCR體系，發(fā)現(xiàn)利用4對(duì)引物同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)會(huì)影響判斷條帶的準(zhǔn)確性，添加2對(duì)和3對(duì)引物可以準(zhǔn)確判斷引物擴(kuò)增出的條帶。所以，對(duì)于粗提DNA的方法是否可以應(yīng)用到多重PCR鑒定西瓜純度，有待于進(jìn)一步研究。

筆者通過(guò)對(duì)覆蓋西瓜全基因組的192對(duì)引物進(jìn)行篩選，36對(duì)引物在‘錦霞八號(hào)及其親本之間具有多態(tài)性，多態(tài)性比率為18.8%，從中選擇4對(duì)位于西瓜不同染色體上的SSR標(biāo)記檢測(cè)‘錦霞八號(hào)純度。通過(guò)構(gòu)建雙重和三重PCR體系，對(duì)‘錦霞八號(hào)雜交種進(jìn)行純度鑒定，雙重PCR結(jié)果和三重PCR結(jié)果基本吻合。分子鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果高度一致，與前人研究結(jié)論一致。利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)西瓜雜交種進(jìn)行純度鑒定，將結(jié)果與田間形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果對(duì)比，兩者純度偏差為1.2%，符合允許的誤差范圍（2%）。

筆者利用多對(duì)特異性引物建立多重PCR體系進(jìn)行純度鑒定，同時(shí)驗(yàn)證品種的真實(shí)性和種子純度，過(guò)程快速方便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，本研究結(jié)果也對(duì)西瓜雜交種利用多重PCR進(jìn)行純度鑒定的相關(guān)研究提供一定的參考。

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