參茸五子丸的急性毒性試驗研究

焦玉 黃德紅 楊艷芳 胡思榮 張荔

【摘?要】目的：對參茸五子丸進行急性毒性試驗，評價參茸五子丸的安全性，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。方法：40只小鼠，每組20只，隨機分為2組，標記為參茸五子丸組和空白組，試驗前禁食不禁水12h，參茸五子丸組按40.0mL·kg-1灌服參茸五子丸溶液（1.15g·mL-1），每日2次，空白組小鼠等體積同方法純水灌服。給藥后，觀察兩周，對比小鼠是否有中毒反應(yīng)并記錄小鼠死亡數(shù)目。結(jié)果：觀察期間動物生長正常，未見任何中毒現(xiàn)象，未見死亡;14d后處死小鼠，各器官均正常。結(jié)論：小鼠的最大給藥量為92.0g生藥/kg。小鼠給予參茸五子丸灌胃的最大耐受劑量大于92.0g生藥/kg。

【關(guān)鍵詞】?參茸五子丸;急性毒性試驗;小鼠;半數(shù)致死量;最大給藥量

【中圖分類號】R285.5???【文獻標志碼】 A????【文章編號】1007-8517（2020）5-0009-04

Study on Acute Toxicity Test of Shenrong Wuzi Pill

JIAO Yu1?HUANG Dehong1?YANG Yanfang2?HU Sirong1?ZHANG Li1

1.Xiangyang Hospital of Traditional Chinese Medicine，Xiangyang 441000，China;

2. Pharmaceutical College，Hubei University of Traditional Chinese Medicine，Wuhan 430065，China

Abstract：

Objective Acute toxicity test was performed on Shenrong Wuzi Pills to evaluate the safety of Shenrong Wuzi Pills and to provide a basis for clinical application. Methods 40 mice，20 in each group，were randomly divided into two groups，marked as Shenrong Wuzi pill group and blank group. Before the test，the mice in Shenrong Wuzi pill group were fasted but not water for 12 hours. The mice in Shenrong Wuzi pill group were given 40.0mL kg-1 solution （1.15g mL-1） twice a day，and the mice in blank group were given the same volume of pure water. After administration，the mice were observed for two weeks to compare whether there was toxic reaction and record the number of mouse deaths. ?during the observation period，the animals grew normally without any poisoning or death. After 14 days，all organs were normal. Results During the observation period，the animals grew normally without any poisoning or death;after 14 days，all organs were normal. Conclusion The maximum dose for mice was 92.0 g crude drug / kg. The maximum tolerated dose of mice given Shenrong Wuzi Wan gavage is greater than 92.0g crude drug / kg.

Key?words：Shenrong Wuzi Pill; Acute toxicity test; Mice; Median lethal dose; Most tolerance dose

甲狀腺功能低下是老年患者的常見疾病之一，是甲狀腺激素合成及分泌減少或組織利用不佳導(dǎo)致的全身代謝性疾病，96%的甲狀腺低下患者于老年階段發(fā)病[1]。西醫(yī)治療該病以甲狀腺功能達標為主，但整體治療效果有待提高，所以研究領(lǐng)域迫切希望能發(fā)現(xiàn)新的中藥來完善治療[2]。參茸五子丸為湖北中醫(yī)名師胡思榮主任醫(yī)師多年臨床驗方，以古方 “五子衍宗丸” 加減而成。全方以紅參、鹿茸為君藥，能溫腎壯陽，用于腎陽和精血虧虛而致女子宮寒不孕及甲狀腺功能不足。為了初步評價參茸五子丸的安全性，根據(jù)《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[3]的技術(shù)要求，對參茸五子丸進行急性毒性試驗。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?試驗藥物?參茸五子丸，176g/瓶，由襄陽市中醫(yī)醫(yī)院提供（批號：20150216）。

1.1.2?試驗動物?種屬與品系：SPF級昆明小鼠。性別和數(shù)量：24只小鼠，雌雄各半，用于預(yù)實驗;40只小鼠，雌雄各半，用于正式試驗。動物體重：18～22g。

預(yù)試驗動物來源：湖北省實驗動物研究中心。試驗動物質(zhì)量合格證：No.4200600007058，許可證編號：SCXK（鄂）2015-0018。

正式試驗動物來源：武漢生物制品研究所。試驗動物質(zhì)量合格證：No.4200400002876，許可證編號：SCXK（鄂）2012-0003。

動物試驗單位：湖北中醫(yī)藥大學(xué)動物中心SPF級實驗室，使用許可證號：SCXK（鄂）2012-0068。

動物的標記與識別：動物到達后，每籠5只，予以標注，標注課題和小鼠體重等內(nèi)容，并按照試驗的要求對小鼠進行編號。

檢疫時間：動物到達后檢疫3d。

飼養(yǎng)管理條件：小鼠飼養(yǎng)在塑料飼養(yǎng)盒中，喂標準顆粒飼料（飼料由湖北中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供），無干涉自由進食及飲水。溫度控制在20～25℃，相對濕度控制在45%～60%，每周更換墊料2次，消毒給水瓶1次。

1.1.3?試驗器材?5號篩、電子天平、打粉機、純水儀、1mL灌胃器、100mL量筒、常用手術(shù)用具。

1.2?試驗方法

1.2.1?受試藥物的制備方法?將參茸五子丸用打粉機打粉，過5號篩，用純水配制成低、中、高3個濃度混懸液， 濃度分別為0.291 、0.590、1.15g·mL-1。

1.2.2?預(yù)實驗?取實驗小鼠24只，每組8只，雌雄分開，分成低劑量參茸五子丸組、中劑量參茸五子丸組和高劑量參茸五子丸組共3個組，試驗前12h禁食不禁水。灌胃最大容積為按小鼠體重40.0mL·kg-1，3個組灌胃濃度分別為0.291、0.590和1.15g·mL-1，每日灌胃2次，每次間隔5h。

灌胃后，正常飼養(yǎng)。連續(xù)5d觀察小鼠，分別比較體重、活動情況、呼吸、皮毛顏色、大小便、喂食等情況和死亡數(shù)目。結(jié)果全部觀察項目（見表1）均正常并且實驗小鼠均存活，未測得半數(shù)致死數(shù)LD50。因此，以1.15g·mL-1的為最高濃度測定最大給藥量，進行正式試驗。

1.2.3?正式試驗[4-5]??取40只試驗小鼠，每組20只，分為2組標記為對照組和參茸五子丸組，雌雄分開，試驗前12h禁食不禁水。小鼠按體重40mL·kg-1，參茸五子丸組以1.15g·ml-1藥液濃度濃度，每5h灌胃1次，每日2次;對照組按相同方式純水灌胃。給藥后，正常飼養(yǎng)。觀察14d，比較各組小鼠的活動狀態(tài)、重量、毒性反應(yīng)和死亡數(shù)目。在將兩組中雌雄取均值進行比較。

1.2.4?小鼠急性毒性試驗觀察?各組灌胃給藥后，按照常規(guī)飼養(yǎng)。 灌胃給藥后2h之內(nèi)，每15min觀察1次;2～4h內(nèi)，每0.5h觀察1次; 4～6h內(nèi)，每1h觀察1次;每天同時段觀察小鼠的重量、四肢活動、飲水和進食、皮毛顏色、大小便、死亡等情況。

若小鼠死亡，解剖觀察各臟器改變情況。然后將存活的小鼠頸椎脫臼處死，同時解剖和觀察小鼠主要臟器的變化。

1.2.5?統(tǒng)計學(xué)方法?應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，各組體重用均數(shù)加減標準差（x±s）表示，采用t檢驗分析各組數(shù)據(jù)間差異性，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?預(yù)實驗?小鼠一般狀態(tài)變化和死亡情況見表2、3。

2.2?正式實驗

2.2.1?小鼠一般狀態(tài)變化?參茸五子丸組：給藥后0.5 ～1.5h，小量小鼠活動和進食飲水變少，但未出現(xiàn)抽搐、麻痹等現(xiàn)象; 也沒有呼吸困難對照組：小鼠在1～14d的觀察時間之內(nèi)，小鼠各觀察指標均正常。

對照組：小鼠在1～14d的觀察時間之內(nèi)，小鼠自發(fā)活動、反應(yīng)情況、呼吸、皮毛光澤、飲水、進食、二便均正常，沒有出現(xiàn)任何不正常的狀態(tài)。結(jié)果見表4。

2.2.2?小鼠的死亡情況?14d觀察時間內(nèi)，實驗小鼠全部存活。結(jié)果見表5。

2.2.3?小鼠體重變化?參茸五子丸組：小鼠的體重增長正常，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。對照組：小鼠體重增長正常。將兩組中雌雄兩組分別計算均值，再進行比較，結(jié)果見表6、圖6。

2.2.4?小鼠尸檢情況?觀察期到后，將所有小鼠頸椎脫臼處死，并尸檢各器官。 結(jié)果：肝、心、脾、肺、腎、胃各臟器的顏色、體積、質(zhì)地等均無異常現(xiàn)象。

2.2.5?小鼠的最大給藥量?小鼠的最大給藥量為1.15g·mL-1×40.00mL·kg-1×2=92.00g·kg-1。

按以下公式計算出最大給藥量倍數(shù)：

小鼠最大給藥量倍數(shù)=每只小鼠的最大給藥量/小鼠平均體重（20g）1×成人平均體重（50kg）/成人每日用量

每只小鼠的最大給藥量為：1.15g·mL-1×0.8mL×2次=1.84g

成人臨床日用量為：2.933×10g/次×3次=87.99g

小鼠最大給藥量倍數(shù)為：1.84g/20g×50000/87.99g=52.3倍

在參茸五子丸的急性毒性試驗過程中，沒有出現(xiàn)小鼠死亡的情況，無法測出半數(shù)致死量LD50。因此，以1.15g·mL-1為最大給藥濃度，40.0mL·kg-1為最大給藥容量灌胃給藥2次，進行最大給藥量試驗。在14d的觀察時間內(nèi)，小鼠沒有出現(xiàn)任何毒性反應(yīng)，且體重正常增加，說明本品在該劑量下使用對小鼠是安全的。

3?結(jié)論

“五子衍宗丸”全方組成為：枸杞子、菟絲子（炒）、覆盆子、五味子（蒸）、車前子（鹽炒），為補益劑，具有補腎益精之功效，用于脾腎陽虛所致的甲狀腺功能低下等。“參茸五子丸”為“五子衍宗丸”加減而成，全方以紅參、鹿茸溫腎助陽為君藥;鹽菟絲子、覆盆子、醋五味子、枸杞子、鹽車前子補血填精，補中有瀉，補而不膩為臣藥;淫羊藿補腎壯陽加強五子衍宗丸的溫陽作用;丹參既能活血又能養(yǎng)血，“能去瘀生新而不傷正”;黃柏苦寒入腎，清虛熱燥濕，以制以上諸藥補益溫陽作用太過，三者同為佐藥;使以陳皮、茯苓、焦山楂、炙甘草以健脾和胃，久服不傷及脾胃。諸藥配伍，溫而不燥，補而不膩。全方重在溫腎陽，益精血，輔以健脾胃，清虛熱，使腎陽得溫，精血充盈。

參茸五子丸（批號：20150216）對昆明小鼠灌胃給藥進行急性毒性試驗表明，小鼠沒有出現(xiàn)任何毒性反應(yīng)，且體重正常增長，無法測出LD50;最大給藥量為92.00g生藥/kg，相當于成人臨床日用量1.76g/kg的52.3倍，說明小鼠對本品的最大耐受劑量大于92.00g生藥/kg。該制劑在服用劑量范圍內(nèi)安全性良好。

參考文獻

[1]中華醫(yī)學(xué)會內(nèi)分泌學(xué)分會《中國甲狀腺疾病診治指南》編寫組.甲狀腺疾病診治指南：甲狀腺功能減退癥[J]. 中華內(nèi)科雜志，2007，46（11）：967-971.

[2]張美珍.甲狀腺功能減退癥中醫(yī)診療規(guī)律及PRO量表研制[D].北京：中國中醫(yī)科學(xué)院，2016.

[3]《中藥、天然藥物急性毒性試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》課題研究組.中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則[S].北京：中國食品、藥品監(jiān)督管理局，2005.

[4]中華人民共和國衛(wèi)生部藥政管理局.中藥新藥研究指南（藥學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué)）[M].北京：中華人民共和國衛(wèi)生部藥政管理局，1994：203.

[5]陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：107-110.

（收稿日期：2019-12-13?編輯：陶希睿）