加味凈屑飲對咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠的治療作用及IL-17產(chǎn)生的影響

楊登科 郭奕妤 秦建平 徐杰 黃蘭蘭 陸毓 吳潔

【摘?要】?目的：研究加味凈屑飲對咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型的治療作用及IL-17產(chǎn)生的影響。方法：通過咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病樣的小鼠模型，隨機(jī)分為模型組、陽性藥物及加味凈屑飲低劑量組（3g/kg）、加味凈屑飲中劑量組（6g/kg）、加味凈屑飲高劑量組（12g/kg）組，另設(shè)空白對照組;游標(biāo)卡尺檢測左耳厚度;HE染色檢測銀屑病樣皮損炎癥狀況。ELISA法測定模型小鼠血清Th17細(xì)胞細(xì)胞因子（IL-17）的表達(dá)水平。結(jié)果：加味凈屑飲高劑量藥物干預(yù)顯著降低咪喹莫特誘導(dǎo)的模型小鼠左耳厚度（P<0.01），減少左耳炎癥細(xì)胞的浸潤，降低咪喹莫特誘導(dǎo)的模型小鼠血清IL-17的表達(dá)水平（P<0.05）。結(jié)論：加味凈屑飲對咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型有較好的治療作用，其機(jī)制可能與抑制IL-17的產(chǎn)生有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】?銀屑病;加味凈屑飲;Th17細(xì)胞;IL-17

【中圖分類號】R285.6???【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A????【文章編號】1007-8517（2020）5-0006-03

銀屑病是一種遺傳與環(huán)境共同作用誘發(fā)、免疫介導(dǎo)的慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性、系統(tǒng)性疾病[1]。臨床上常反復(fù)難愈，影響患者生活質(zhì)量。從病理學(xué)上看，角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和分化的異常，角質(zhì)層中性粒細(xì)胞聚集所形成的Munro微膿瘍以及真皮淺層血管周圍以淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤是銀屑病的3個最主要的特點[3]。研究表明，在銀屑病的炎癥反應(yīng)中，Th17細(xì)胞及其分泌的IL-17等對炎癥免疫有著至關(guān)重要的作用[3]。本病屬中醫(yī)“白疕”的范疇。筆者應(yīng)用加味凈屑飲治療血熱證尋常型銀屑病，取得良好臨床療效[4]，為進(jìn)一步為臨床使用提供客觀的實驗依據(jù)，筆者進(jìn)一步研究加味凈屑飲對咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型的治療作用及IL-17產(chǎn)生的影響，現(xiàn)報告如下。

1?實驗材料

1.1?實驗動物?來源，種系，品系：BALB/c小鼠，7～8周齡，體重20～22g，雌性，成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，合格證號：SCXK（川）2008-24。上述動物飼養(yǎng)于動物實驗屏障系統(tǒng)，飼養(yǎng)一周后使用。溫度（22±1）℃，濕度（55±5）%，12 h光暗循環(huán)。飼料和水均在消毒后由動物自由攝取。

1.2?藥物與試劑?加味凈屑飲組成（60kg成人劑量）：水牛角粉30g，生地15g，紫草15g，白鮮皮15g，漏蘆根15g，雞血藤15g，白花蛇舌草20g，茜草根10g，威靈仙10g，蒼術(shù)10g，板藍(lán)根15g，苦參15g，玄參15g，昆明山海棠15g等，藥物來自于昆明市中醫(yī)醫(yī)院中藥房。加入10倍的水，浸泡30min，然后煎煮3次，合并煎煮液，紗布過濾、離心后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行蒸發(fā)，最后濃縮成浸膏， 稱取質(zhì)量，折合原藥材1g浸膏相當(dāng)于2.57g生藥。根據(jù)人與動物間藥物劑量換算比例換算成小鼠劑量，制定出給藥濃度。咪喹莫特乳膏購自湖北科益藥業(yè)股份有限公司（生產(chǎn)批號190801），地塞米松片購自國藥集團(tuán)容生制藥有限公司（生產(chǎn)批號1509202），IL-17 ELISA檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司（生產(chǎn)批號210754003），其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3?主要儀器設(shè)備?離心機(jī)來自德國Thermo Scientific Heraeus;石蠟切片機(jī)、組織包埋機(jī)、烘片機(jī)、DM2500正置顯微鏡、全自動組織脫水機(jī)均購置德國萊卡儀器有限公司，酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek公司。

1.4?實驗方法

1.4.1?實驗分組及干預(yù)?48只BALB/c雌性小鼠，平均體重18～20g，將其隨機(jī)分為6組：空白對照組、模型組、加味凈血飲低、中、高劑量組（分別為相當(dāng)于生藥3g/kg、6g/kg和12g/kg）及地塞米松陽性對照組（2mg/kg），每組8只。將小鼠耳部的被毛小心剃去，將5%的咪喹莫特乳膏均勻涂抹于耳部，用藥量為10mg，1次/d，連續(xù)用藥5d?？瞻讓φ战M涂抹相同體積的蒸餾水。給藥組灌胃給予相應(yīng)加味凈血飲，灌胃體積為0.4mL/只，空白對照組、模型組灌胃相同體積的生理鹽水。

1.4.2?左耳厚度檢測?使用游標(biāo)卡尺測量各組小鼠背左耳皮膚厚度，測量3次，取平均值，于給藥第1天、第3天、和第5天下午3點測量左耳厚度。

1.4.3?HE染色法觀察皮膚的病理損傷程度?取材之后標(biāo)本放入4%的多聚甲醛溶液中固定，通過包埋，切片，烘干，脫蠟，水化，HE染色等步驟制成透明的組織切片，在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠皮膚的組織結(jié)構(gòu)及炎癥細(xì)胞浸潤情況，并用數(shù)碼相機(jī)采集圖像。

1.4.4?ELISA法模型小鼠血清中的IL-17產(chǎn)生水平?收集血清樣本，采用ELISA法測定各組小鼠血清中的IL-17細(xì)胞因子的水平，各步驟按照試劑盒操作說明書進(jìn)行。

1.4.5?統(tǒng)計學(xué)處理?采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）進(jìn)行描述，兩組間均值的比較采用t檢驗，方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3?結(jié)果

3.1?加味凈屑飲對咪喹莫特誘導(dǎo)的模型小鼠左耳厚度的影響?實驗結(jié)果顯示，隨著造模時間推移，與空白對照組比較，模型組小鼠左耳厚度顯著增加，在第3天和第5天差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示造模成功;與模型組比較，地塞米松陽性對照組和加味凈屑飲高劑量組藥物干預(yù)于第3天和第5天顯著降低咪喹莫特誘導(dǎo)的模型小鼠左耳厚度，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果見表1。

3.2?加味凈屑飲對咪喹莫特誘導(dǎo)的模型小鼠左耳病理損傷的影響?HE 染色顯示，空白對照組小鼠耳部皮膚表皮層菲薄，細(xì)胞形態(tài)正常。與空白對照組比較，模型組耳朵皮膚明顯增厚，炎癥細(xì)胞浸潤明顯;與模型組比較，地塞米松陽性對照組和加味凈屑飲不同劑量組藥物干預(yù)，顯著降低皮膚厚度，炎癥細(xì)胞浸潤減少，陽性對照組和高劑量組效果更好。如圖1所示。

3.3?加味凈屑飲對咪喹莫特誘導(dǎo)的模型小鼠IL-17產(chǎn)生水平的影響?ELISA檢測結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠血清IL-17顯著升高;與模型組比較，加味凈屑飲高劑量組藥物干預(yù)下調(diào)咪喹莫特誘導(dǎo)的模型小鼠血清Th17細(xì)胞細(xì)胞因子（IL-17）的表達(dá)水平，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。如圖2所示。

4?討論

銀屑病是一種遺傳與環(huán)境共同作用誘發(fā)、免疫介導(dǎo)的慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性、系統(tǒng)性疾病。屬于中醫(yī)學(xué)“白疕”的范疇。清《醫(yī)宗金鑒》指出白疕“固由風(fēng)邪客皮膚，亦由血燥難榮外”。歷代醫(yī)家多從血論治銀屑病，蜀中中醫(yī)外科名家吳軍教授認(rèn)為本病病機(jī)為素體陽熱偏盛，外受風(fēng)濕熱邪侵襲，內(nèi)外邪氣搏結(jié)于血分，至血熱風(fēng)燥，肌膚失養(yǎng)而成白疕。治療以清熱涼血、除濕解毒、祛風(fēng)潤燥為主。

加味凈屑飲是在吳軍老師凈屑飲基礎(chǔ)上加減化裁而成，方中水牛角粉清熱解毒，涼血散瘀;玄參清熱涼血，滋陰解毒共為君藥;生地清熱涼血，滋陰解毒;紫草涼血活血，解毒生肌;漏蘆根清熱解毒散結(jié)，共為臣藥。白鮮皮清熱燥濕，祛風(fēng)解毒;昆明山海棠祛風(fēng)除濕，活血止血;茜草根涼血止血，疏風(fēng)通絡(luò);苦參清熱燥濕，涼血解毒;威靈仙祛風(fēng)濕;蒼術(shù)祛風(fēng)解表，健脾燥濕;板藍(lán)根清熱解毒，涼血利咽，上藥共為佐藥;雞血藤行血補血，舒筋活絡(luò)，能“治風(fēng)毒通血脈”，為使藥。全方共奏清熱涼血、除濕解毒、祛風(fēng)潤燥之功。

銀屑病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前研究認(rèn)為免疫紊亂是銀屑病發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)，也是當(dāng)前研究的熱點。最新的研究表明IL-23/Th17免疫調(diào)節(jié)通路在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。Th17細(xì)胞及下游細(xì)胞因子IL-17A、IL-17F、IL-22等導(dǎo)致銀屑病的炎癥反應(yīng)而至發(fā)病。咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病樣小鼠模型皮損特點、病理學(xué)特征及細(xì)胞因子改變都與銀屑病相似，與銀屑病進(jìn)行期病理變化基本一致，基本符合中醫(yī)銀屑病血熱證表現(xiàn)[6]。故本研究選用了咪喹莫特誘導(dǎo)BALB /c雌性小鼠作為銀屑病模型。前期研究發(fā)現(xiàn)加味凈屑飲顯著降低銀屑病患者PASI評分和DLQI評分，顯示出較好的臨床療效。本次研究通過構(gòu)建咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病模型小鼠，進(jìn)一步觀察加味凈屑飲干預(yù)銀屑病小鼠模型的組織病理改變和對Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的影響，結(jié)果顯示，加味凈屑飲高劑量藥物干預(yù)顯著降低咪喹莫特誘導(dǎo)的模型小鼠左耳厚度，減少左耳炎癥細(xì)胞的浸潤，下調(diào)咪喹莫特誘導(dǎo)的模型小鼠血清Th17細(xì)胞細(xì)胞因子（IL-17）的表達(dá)水平。初步結(jié)果顯示，加味凈屑飲可能通過抑制IL-17產(chǎn)生水平介導(dǎo)治療銀屑病，然而具體作用機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)

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（收稿日期：2019-12-26?編輯：陶希睿）