3種淡水微藻相互間化感作用的實(shí)驗(yàn)研究

尹思成，馬逸馳，王先云，尚光霞，王麗卿,3，張瑋,3,4,*

1. 上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部魚類營養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心，上海 201306 2. 上海城市水資源開發(fā)利用國家工程中心有限公司，上海 200082 3. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306 4. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306

種間競爭是決定物種進(jìn)化模式的重要因素，也是影響生物群落結(jié)構(gòu)重組的主要因素；通?？煞譃槔眯愿偁幒透蓴_性競爭兩大類[1]。利用性競爭為生物競爭利用有限的環(huán)境資源，而環(huán)境資源的下降會(huì)對(duì)所有生物的生存產(chǎn)生影響，比如：在水生態(tài)系統(tǒng)中，滿江紅等漂浮植物通過遮陰效果，影響沉水植物的生長，從而更容易占據(jù)優(yōu)勢地位[2]；大型海藻可以通過競爭營養(yǎng)鹽對(duì)浮游藻類產(chǎn)生營養(yǎng)脅迫，從而抑制藻類生長[3]。干擾性競爭是物種通過生物行為對(duì)其他物種產(chǎn)生影響，其形式機(jī)理多種多樣[1]。化感作用是一種常見的干擾性競爭，其形式是生物通過向周圍環(huán)境中釋放一些化學(xué)物質(zhì)，從而對(duì)自身和其他生物的生長代謝產(chǎn)生影響[4-6]，比如：大型沉水植物穗花狐尾藻植株中的酚酸類和脂肪酸類化合物，能夠顯著抑制銅綠微囊藻等藍(lán)藻的生長[7]；沉水植物金魚藻合成和釋放的一些生物堿則能夠?qū)π∏蛟搴汪~腥藻等浮游植物產(chǎn)生生長抑制[8]。

浮游植物在水體中廣泛存在，它們不但受水生和陸生高等植物產(chǎn)生的化感物質(zhì)的影響，同時(shí)不同藻類之間也普遍存在化感競爭[9]。各國研究人員使用濾液培養(yǎng)法對(duì)藻類種間的化感作用和化感物質(zhì)成分開展了不少研究[10]，例如：Carey和Karin[11]研究發(fā)現(xiàn)，群體性絲狀固氮藍(lán)藻膠刺藻的濾液能夠顯著抑制魚腥藻、微囊藻和束絲藻等的生長；Irfanullah和Moss[12]發(fā)現(xiàn)水綿培養(yǎng)濾液會(huì)影響柵藻和微芒藻等的生長速率；另有研究表明，浮游藍(lán)藻的化感作用能增加其在水環(huán)境中的競爭能力[13]，是藍(lán)藻水華產(chǎn)生和維持的主要因素之一[14]。此外，最近有研究表明，化感競爭作用可能在一些水華藍(lán)藻的全球性入侵和擴(kuò)張中起到了重要的作用[15]。

卵孢金孢藻(Chrysosporumovalisporum(Forti) Zapomelová et al.)原名卵孢束絲藻(AphanizomenonovalisporumForti)，是絲狀固氮藍(lán)藻，原分布于土耳其[16]、以色列[17]和澳大利亞[18]的水庫和湖泊中，并經(jīng)常導(dǎo)致水華暴發(fā)。該藻能夠產(chǎn)生擬柱孢藻毒素(cylindrospermopsin, CYN)，可對(duì)水生生物和水體生態(tài)產(chǎn)生較為嚴(yán)重的負(fù)面影響[17]。近年來，該藻呈現(xiàn)向多地區(qū)入侵的現(xiàn)象，在我國的上海地區(qū)也出現(xiàn)了卵孢金孢藻的水華[19]。由于我國水體中暴發(fā)的藍(lán)藻水華大多以微囊藻類群為主[20]，微囊藻水華幾乎一度成為我國藍(lán)藻水華的代名詞，而對(duì)卵孢金孢藻這類新型水華藍(lán)藻的研究，總體偏少。Bar-Yosef等[21]通過對(duì)歐洲水域分離的卵孢金孢藻藻株的研究發(fā)現(xiàn)，它們能夠通過產(chǎn)生的CYN刺激其他浮游植物產(chǎn)生胞外堿性磷酸酶(APA)以增加水體中可利用的磷酸鹽含量，從而自己“漁翁得利”。近期，Zhang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，高溫時(shí)節(jié)，卵孢金孢藻能抑制同一水體中片狀微囊藻的光合作用和生長，干擾后者的生理代謝，從而在競爭中取勝。目前，雖然對(duì)該藻生理生態(tài)學(xué)已經(jīng)開展了一些研究，但對(duì)于化感作用在其分布區(qū)域擴(kuò)張和種間競爭中所起的作用方面，相關(guān)研究仍鮮有報(bào)道。

本研究以卵孢金孢藻和2種常見浮游植物銅綠微囊藻、四尾柵藻為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過濾液培養(yǎng)方式，探究卵孢金孢藻和2種微藻間的化感作用。以期為進(jìn)一步了解卵孢金孢藻與不同浮游植物物種的化感競爭，闡明其擴(kuò)散與暴發(fā)機(jī)制，并為我國新型水華藍(lán)藻的防控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 藻種的培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用卵孢金孢藻(CFWA01007)和銅綠微囊藻(CFWA0100)為本實(shí)驗(yàn)室分別于上海滴水湖、太湖中分離獲得；四尾柵藻(FACHB-1471)購自中國科學(xué)院淡水藻種庫。根據(jù)Sarchizian和Ardelean[23]的方法，向BG11培養(yǎng)基中添加10 mg·L-1安美汀(Augmentin)和20 mg·L-1放線菌酮(actidione)，以消除異養(yǎng)細(xì)菌和真核微生物的影響；采用MGC-300H型恒溫光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：(25±1) ℃，光照強(qiáng)度3 000 lx，光暗比(L∶D) 12 h∶12 h。4 000 r·min-1離心8 min收集對(duì)數(shù)生長期的藻細(xì)胞，用于本實(shí)驗(yàn)接種。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將卵孢金孢藻、銅綠微囊藻和四尾柵藻在BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d后，通過離心(4 000 r·min-1、8 min)和抽濾(0.45 μm混合纖維素脂膜，玻璃砂芯過濾器)獲得不含藻細(xì)胞的濾液。利用過硫酸鉀氧化-紫外分光光度法和過硫酸鉀消解-鉬銻抗分光光度法[24]檢測各濾液中的總氮(TN)和總磷(TP)濃度，添加一定量NaNO3溶液和K2HPO4溶液使濾液中TN、TP濃度與BG11培養(yǎng)基中的水平一致。實(shí)驗(yàn)處理組設(shè)置：(1)Chr in Mic為卵孢金孢藻培養(yǎng)于銅綠微囊藻濾液；(2)Chr in Sce為卵孢金孢藻培養(yǎng)于四尾柵藻濾液；(3)Mic in Chr為銅綠微囊藻培養(yǎng)于卵孢金孢藻濾液；(4)Sce in Chr為四尾柵藻培養(yǎng)于卵孢金孢藻濾液。培養(yǎng)體積為200 mL，每組設(shè)3個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)條件同培養(yǎng)條件。在0、2、4、6、8和10 d時(shí)分別取樣測定微藻的生物量、比生長率、葉綠素a含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)等指標(biāo)，另以3種微藻培養(yǎng)于BG11培養(yǎng)基作為對(duì)照，分析卵孢金孢藻和2種微藻間的化感作用。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 生物量及比生長率測定

用BG11培養(yǎng)基將藻液稀釋成不同的濃度梯度，利用UV-2800型紫外分光光度計(jì)在680 nm波長下測量OD值，同時(shí)用Sedgwick-Rafter計(jì)數(shù)框，在Olympus BX53顯微鏡(400×)下進(jìn)行計(jì)數(shù)，獲得細(xì)胞密度，以O(shè)D680值為X軸、密度為Y軸作圖，得出細(xì)胞密度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)驗(yàn)中每2 d測定一次OD680值。

比生長率(μ)根據(jù)以下公式計(jì)算：

μ= (lnCt2-lnCt1)/(t2-t1)，

式中：Ct2和Ct1分別是卵孢金孢藻在時(shí)間t2和t1的細(xì)胞密度。根據(jù)體積法，以1 mm3生物體積相當(dāng)于1 mg細(xì)胞鮮重計(jì)算卵孢金孢藻的生物量。

1.3.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定

每2 d測量一次光合熒光參數(shù)。取混勻藻液3 mL于測量杯中，暗處理3 min后使用Phyto-PAM型浮游植物熒光儀(德國Walz公司)測定卵孢金孢藻、銅綠微囊藻和四尾柵藻光合系統(tǒng)Ⅱ(PS Ⅱ)潛在最大光合效率(Fv/Fm)、實(shí)際光合效率(Yield)和葉綠素a濃度(Chl-a)，實(shí)驗(yàn)第0天和第10天測量光合曲線初始斜率(α)、最大電子傳遞速率(ETRmax)和半飽和光強(qiáng)(Ik)。

1.3.3 可溶性無機(jī)磷酸鹽(dissolved inorganic phosphate, DIP)的測定

實(shí)驗(yàn)第0天和第10天測定培養(yǎng)基中DIP濃度，測定方法參照《水和廢水監(jiān)測分析方法(第四版)》[24]?；靹蛟逡航?jīng)0.45 μm混合纖維素脂膜過濾后，取2 mL濾液，定容至25 mL，加入0.5 mL抗壞血酸溶液(體積分?jǐn)?shù)為10%)和1 mL鉬酸鹽溶液，放置5 min后，利用UV-2800型紫外分光光度計(jì)在700 nm波長下測量OD值，比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出DIP濃度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用單因素方差分析(ANOVA)對(duì)生物量、葉綠素a含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)等進(jìn)行比較，分析前將數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)和正態(tài)性檢驗(yàn)，P<0.05被認(rèn)為具有顯著性差異。使用SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Origin 2017制作折線圖和柱形圖。

2 結(jié)果(Results)

2.1 濾液培養(yǎng)對(duì)藻類生物量的影響

如圖1(a)所示，銅綠微囊藻濾液中卵孢金孢藻在實(shí)驗(yàn)前4 d生長受到顯著抑制(P<0.01)，之后生長加速，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)生物量達(dá)到(152.85±15.83) mg·L-1，與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。如圖1(b)所示，卵孢金孢藻濾液則在實(shí)驗(yàn)前期對(duì)銅綠微囊藻有一定促進(jìn)作用，在第4天生物量達(dá)到對(duì)照組的1.41倍(P<0.01)，6 d后至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，生物量與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)；如圖2(b)所示，4 d后銅綠微囊藻的比生長率迅速下降，顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

圖1 濾液培養(yǎng)對(duì)卵孢金孢藻、銅綠微囊藻和四尾柵藻生物量的影響注：*、**表示與對(duì)照組相比，雙側(cè)水平上具有顯著性差異(P<0.05、P<0.01)；Chr in Mic為卵孢金孢藻培養(yǎng)于銅綠微囊藻濾液，Chr in Sce為卵孢金孢藻培養(yǎng)于四尾柵藻濾液，Mic in Chr為銅綠微囊藻培養(yǎng)于卵孢金孢藻濾液，Sce in Chr為四尾柵藻培養(yǎng)于卵孢金孢藻濾液；下同。Fig. 1 The biomass dynamics of C. ovalisporum, M. aeruginosa and S. quadricauda in the other algal filtrateNote: *, ** indicate significant differences on both sides (P<0.05, P<0.01), compared with the control; Chr in Mic mean C. ovalisporum cultured in M. aeruginosa filtrate; Chr in Sce mean C. ovalisporum cultured in S. quadricauda filtrate; Mic in Chr mean M. aeruginosa cultured in C. ovalisporum filtrate; Sce in Chr mean S. quadricauda cultured in C. ovalisporum filtrate; the same below.

如圖1(a)和圖2(a)所示，四尾柵藻濾液中卵孢金孢藻生物量在2 d后保持穩(wěn)定，比生長率降低到-0.11～0.06，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中后期顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)其生物量僅占對(duì)照組的18.95%。如圖1(c)和圖2(c)所示，卵孢金孢藻濾液對(duì)四尾柵藻的生物量和比生長率影響不顯著(P>0.05)。

圖2 濾液培養(yǎng)對(duì)卵孢金孢藻、銅綠微囊藻和四尾柵藻比生長率的影響Fig. 2 The specific growth rate variations of C. ovalisporum, M. aeruginosa and S. quadricauda in the other algal filtrate

2.2 濾液培養(yǎng)對(duì)藻類葉綠素a含量的影響

銅綠微囊藻濾液中卵孢金孢藻的葉綠素a含量在0～6 d升高速率低于對(duì)照組；6 d后葉綠素a含量上升速率加快，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)葉綠素a含量與對(duì)照組無明顯差異(P>0.05)。如圖3(b)所示，卵孢金孢藻濾液在實(shí)驗(yàn)初期對(duì)銅綠微囊藻的葉綠素a含量有一定的促進(jìn)作用，第4天時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；在4～8 d快速下降后趨于穩(wěn)定，至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)葉綠素a含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

如圖3(a)所示，四尾柵藻濾液中卵孢金孢藻葉綠素a含量在2 d后呈不斷下降趨勢，至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，葉綠素a含量為(16.1±3.78) μg·L-1，顯著低于對(duì)照組卵孢金孢藻葉綠素a含量(P<0.01)。如圖3(c)所示，卵孢金孢藻濾液中四尾柵藻葉綠素a含量在前8 d升高后降低，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中與對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)。

圖3 濾液培養(yǎng)對(duì)卵孢金孢藻、銅綠微囊藻、四尾柵藻葉綠素a(Chl-a)含量的影響Fig. 3 Effects of filtrate culture on chlorophyll-a (Chl-a) of C. ovalisporum, M. aeruginosa and S. quadricauda

2.3 濾液培養(yǎng)對(duì)藻類光合熒光參數(shù)的影響

如圖4(a)所示，實(shí)驗(yàn)前中期，2種微藻濾液對(duì)卵孢金孢藻PS Ⅱ的Fv/Fm均有一定抑制作用，在2～8 d均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)Fv/Fm上升，分別達(dá)到0.25±0.06和0.24±0.06，與對(duì)照組0.23±0.04無顯著差異(P>0.05)。如圖4(b)所示，卵孢金孢藻濾液培養(yǎng)的銅綠微囊藻Fv/Fm在實(shí)驗(yàn)前期升高，第4天達(dá)到0.46±0.01，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；隨后下降，至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)與對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)。如圖4(c)所示，卵孢金孢藻濾液培養(yǎng)的四尾柵藻Fv/Fm在前4 d下降后趨于穩(wěn)定，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，與對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)。

圖4 濾液培養(yǎng)對(duì)卵孢金孢藻、銅綠微囊藻和四尾柵藻潛在最大光合效率(Fv/Fm)的影響Fig. 4 Effects of filtrate culture on the maximum photosynthetic efficiency (Fv/Fm) of C. ovalisporum, M. aeruginosa and S. quadricauda

如圖5(a)所示，卵孢金孢藻在2種浮游植物濾液中，Yield均表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢。銅綠微囊藻濾液培養(yǎng)中的卵孢金孢藻Yield在第6天下降至最低，達(dá)到(0.10±0.01) μmol photons·m-2·s-1；后上升至(0.19±0.02) μmol photons·m-2·s-1，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。四尾柵藻濾液培養(yǎng)卵孢金孢藻Yield在第4天下降至最低，而后上升；在0～8 d均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)上升至(0.34±0.04) μmol photons·m-2·s-1，與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。如圖5(b)所示，卵孢金孢藻濾液中銅綠微囊藻Yield在前4 d穩(wěn)定，之后下降，第6天為(0.22±0.02) μmol photons·m-2·s-1，顯著低于對(duì)照組(0.29±0.01) μmol photons·m-2·s-1(P<0.01)；8 d后Yield回升，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)達(dá)到(0.32±0.03) μmol photons·m-2·s-1，顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。如圖5(c)所示，實(shí)驗(yàn)初始時(shí)卵孢金孢藻濾液和對(duì)照組中四尾柵藻Yield保持穩(wěn)定；4 d后卵孢金孢藻濾液中四尾柵藻Yield不斷降低，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中與對(duì)照組無明顯差異(P>0.05)。

圖5 濾液培養(yǎng)對(duì)卵孢金孢藻、銅綠微囊藻和四尾柵藻實(shí)際光合效率(Yield)的影響Fig. 5 Effects of filtrate culture on the PS Ⅱ actual photosynthetic efficiency (Yield) of C. ovalisporum, M. aeruginosa and S. quadricauda

如圖6(a)所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，2種微藻濾液培養(yǎng)中卵孢金孢藻的α均有所上升，但與對(duì)照組無明顯差異(P>0.05)。卵孢金孢藻濾液中銅綠微囊藻的α在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)為0.16±0.01，高于對(duì)照組0.12±0.02，但差異并不顯著(P>0.05)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)卵孢金孢藻濾液和對(duì)照組中四尾柵藻的α與實(shí)驗(yàn)初始相比均有所下降，但二者無顯著差異(P>0.05)。

如圖6(b)所示，實(shí)驗(yàn)初始，2種微藻濾液中卵孢金孢藻的ETRmax均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，分別升高至(538.90±72.27) μmol photons·m-2·s-1和(282.1±64.46) μmol photons·m-2·s-1，與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，卵孢金孢藻濾液中銅綠微囊藻的ETRmax相比實(shí)驗(yàn)初始時(shí)有所上升，與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。卵孢金孢藻濾液中四尾柵藻的ETRmax實(shí)驗(yàn)初期顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)下降至與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。

如圖6(c)所示，實(shí)驗(yàn)初始時(shí)，2種微藻濾液中卵孢金孢藻的Ik均低于對(duì)照組，其中，四尾柵藻濾液中卵孢金孢藻的Ik顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，2種微藻濾液中卵孢金孢藻的Ik均有所升高，與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，卵孢金孢藻濾液中銅綠微囊藻的Ik相比實(shí)驗(yàn)初始有所升高，與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)初期，卵孢金孢藻濾液中四尾柵藻的Ik值顯著高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，降低至與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。

2.4 實(shí)驗(yàn)首末濾液中DIP的變化

實(shí)驗(yàn)初始和結(jié)束時(shí)DIP濃度的變化情況如表1所示，各培養(yǎng)基中DIP濃度的下降量可以視為藻細(xì)胞對(duì)DIP的凈攝取量。實(shí)驗(yàn)初始時(shí)各濾液中DIP濃度均低于BG11培養(yǎng)基中DIP濃度。銅綠微囊藻濾液中卵孢金孢藻在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)DIP的吸收利用量為2.11 mg·L-1，低于BG11培養(yǎng)基中2.32 mg·L-1。卵孢金孢藻在四尾柵藻濾液中，其DIP濃度上升了1.14 mg·L-1，說明卵孢金孢藻向?yàn)V液中釋放了一定量的DIP。銅綠微囊藻在卵孢金孢藻濾液中培養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，DIP的吸收利用量為0.85 mg·L-1，低于BG11培養(yǎng)基中1.68 mg·L-1。四尾柵藻在卵孢金孢藻濾液中培養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，DIP的吸收利用凈攝取量為2.42 mg·L-1，高于BG11培養(yǎng)基中1.98 mg·L-1。

圖6 濾液培養(yǎng)初始和結(jié)束時(shí)卵孢金孢藻、銅綠微囊藻和四尾柵藻的光曲線初始斜率(α)、最大電子傳遞速率(ETRmax)和半飽和光強(qiáng)(Ik)Fig. 6 The initial slope (α), the maximum electron transport rate (ETRmax) and the half saturated light intensity (Ik) of light curve of C. ovalisporum, M. aeruginosa and S. quadricauda at the beginning and the end of the filtrate incubation

3 討論(Discussion)

3.1 卵孢金孢藻與銅綠微囊藻間的化感作用

光合作用是藻類最基本的物質(zhì)和能量代謝途徑，其活性強(qiáng)弱與藻類的生長密切相關(guān)。楊王庭等[25]發(fā)現(xiàn)，銅綠微囊藻可通過改變代謝產(chǎn)物的種類和數(shù)量，影響萊茵衣藻的葉綠素含量和光合活性。在本研究中，實(shí)驗(yàn)前期銅綠微囊藻濾液中，卵孢金孢藻的生物量和葉綠素含量均顯著低于對(duì)照組(表2)，表明銅綠微囊藻代謝產(chǎn)物在初期對(duì)卵孢金孢藻產(chǎn)生了脅迫抑制[26]。實(shí)驗(yàn)后期，卵孢金孢藻恢復(fù)生長，可能是卵孢金孢藻對(duì)銅綠微囊藻濾液的中化感物質(zhì)產(chǎn)生了適應(yīng)性，或可能由于銅綠微囊藻相關(guān)代謝產(chǎn)物在卵孢金孢藻培養(yǎng)體系中發(fā)生了降解[27]。銅綠微囊藻濾液中卵孢金孢藻的Fv/Fm和Yield先降后升，此外實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，卵孢金孢藻的α、ETRmax和Ik相比實(shí)驗(yàn)開始時(shí)均有所升高，表明卵孢金孢藻通過提高了PSⅡ中的電子傳遞效率等恢復(fù)了一定的光合活性[28]。有研究發(fā)現(xiàn)，銅綠微囊藻分泌的微囊藻毒素(microcystin, MC)能夠刺激其他藻類改變其光合色素組成[29-30]。杜彩麗等[31]的研究表明，卵孢金孢藻的藻膽蛋白具有比葉綠素a更高的脅迫耐受能力。因此，本文推測在實(shí)驗(yàn)后期，卵孢金孢藻有可能通過提高藻膽蛋白等其他光合色素的含量，從而在葉綠素a含量受抑制的情況下維持光合活性。

在本研究中，卵孢金孢藻濾液對(duì)銅綠微囊藻的生長和葉綠素含量表現(xiàn)出明顯的“先促后抑”的趨勢。銅綠微囊藻在濾液培養(yǎng)初期的促進(jìn)作用，可視為一種“毒性興奮效應(yīng)”；在實(shí)驗(yàn)后期，銅綠微囊藻葉綠素a含量顯著減少，表明銅綠微囊藻的葉綠素a是卵孢金孢藻代謝產(chǎn)物主要靶目標(biāo)。葉綠素a是藻細(xì)胞捕光系統(tǒng)中起主要作用的光合色素，對(duì)于化感物質(zhì)比較敏感，也可能是許多化感物質(zhì)的作用靶點(diǎn)[9]。研究表明，N-苯基-2-萘胺[32]、阿魏酸[33]和蘆薈大黃素[34]等多種物質(zhì)都會(huì)引起銅綠微囊藻細(xì)胞中葉綠素a含量降低。此外，藻細(xì)胞受到化感物質(zhì)脅迫時(shí)，會(huì)產(chǎn)生較多的活性氧，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷[4]，過量的活性氧也會(huì)促進(jìn)葉綠素a的降解[35]。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，銅綠微囊藻的α、ETRmax和Ik均與對(duì)照組無顯著差異，而在Zhang等[22]的實(shí)驗(yàn)中，卵孢金孢藻濾液不僅對(duì)片狀微囊藻的生長產(chǎn)生顯著抑制，對(duì)其PSⅡ也產(chǎn)生了顯著抑制。卵孢金孢藻對(duì)2種微囊藻光合系統(tǒng)的影響并不一致，可能是由于不同微囊藻的生物特性不同，對(duì)前者代謝產(chǎn)物耐受力也有差異[36]。另外，Rzymski等[37]的研究表明，CYN能強(qiáng)烈影響同一水體中其他浮游植物堿性磷酸酶的釋放量，并且對(duì)于其他非產(chǎn)CYN的藍(lán)藻(如銅綠微囊藻)的刺激作用更為明顯；Zhang等[22]的研究表明，化感作用有助于水體優(yōu)勢種由片狀微囊藻轉(zhuǎn)變?yōu)槁焰呓疰咴濉＝Y(jié)合本文研究結(jié)果，這可能說明產(chǎn)CYN的藍(lán)藻的主要化感抑制的靶目標(biāo)可能是同一水體中的其他藍(lán)藻。

表1 實(shí)驗(yàn)首末濾液中可溶性無機(jī)磷酸鹽(DIP)的濃度變化Table 1 The changes of dissolved inorganic phosphate (DIP) concentration at the beginning and the end of the filtrate incubation

3.2 卵孢金孢藻與四尾柵藻間的化感作用

本實(shí)驗(yàn)中，四尾柵藻濾液培養(yǎng)下的卵孢金孢藻的生長和葉綠素a含量在2 d后明顯下降，受到明顯的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)培養(yǎng)基中DIP濃度有所上升，可能由于大量藻細(xì)胞死亡裂解將其內(nèi)含物釋放所導(dǎo)致。Qiu等[38]研究發(fā)現(xiàn)，四尾柵藻的培養(yǎng)濾液能夠抑制水華微囊藻分泌胞外聚合物，并證實(shí)其代謝產(chǎn)物4-叔丁基鄰苯二酚(TBC)能夠通過干擾蛋白質(zhì)和多糖的合成和分泌，抑制葉綠素合成，從而抑制了水華微囊藻的生長。濾液培養(yǎng)下卵孢金孢藻的Fv/Fm和Yield表現(xiàn)出先降后升的趨勢，推測其在實(shí)驗(yàn)后期也有與銅綠微囊藻濾液培養(yǎng)下類似的適應(yīng)性變化。

在本研究中，卵孢金孢藻濾液對(duì)四尾柵藻的影響并不明顯，僅在實(shí)驗(yàn)后期能夠提高其生物量，除此之外葉綠素a含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)等與對(duì)照組均無顯著差異。Kovács等[39]的實(shí)驗(yàn)表明，拉氏擬柱孢藻、顫藻等絲狀固氮藍(lán)藻培養(yǎng)濾液會(huì)對(duì)四尾柵藻的光合活性起顯著的抑制作用，但在本實(shí)驗(yàn)中，卵孢金孢藻濾液未表現(xiàn)出對(duì)四尾柵藻光合活性的抑制作用。郭沛涌等[40]研究發(fā)現(xiàn)，不同質(zhì)量濃度的合果芋葉浸提液對(duì)四尾柵藻的抑制作用有所差異，抑制作用隨質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng)，表明化感抑制作用強(qiáng)度與化感物質(zhì)的濃度密切相關(guān)。由于本實(shí)驗(yàn)未對(duì)培養(yǎng)濾液中的化感成分/濃度進(jìn)行測定，卵孢金孢藻濾液未對(duì)四尾柵藻表現(xiàn)出明顯的化感作用，可能是濾液中有效化感物質(zhì)濃度過低的原因。因此，有關(guān)卵孢金孢藻產(chǎn)生化感物質(zhì)的分離測定有待進(jìn)一步研究。

在本研究中，四尾柵藻對(duì)卵孢金孢藻表現(xiàn)出明顯的化感抑制作用，而卵孢金孢藻未對(duì)四尾柵藻表現(xiàn)出抑制作用(表2)，這可能表明，在室內(nèi)培養(yǎng)條件下，化感作用能夠使四尾柵藻更易獲得競爭優(yōu)勢。但在自然生境中，四尾柵藻的優(yōu)勢度往往不及其他藍(lán)藻，與室內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有所不同。因?yàn)樗{(lán)藻和綠藻對(duì)營養(yǎng)鹽的偏好有所不同，綠藻在營養(yǎng)鹽質(zhì)量高的水體(超富營養(yǎng)水體)中更易占優(yōu)勢[41]。本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基為BG11培養(yǎng)基，營養(yǎng)鹽充足，而自然水體中藻類往往受到不同程度的營養(yǎng)鹽脅迫。因此，在自然水體中，卵孢金孢藻與綠藻間的化感作用可能會(huì)受到營養(yǎng)鹽水平的影響。Granéli等[42]的研究表明，若化感物質(zhì)的產(chǎn)生者和目標(biāo)藻類具有不同的營養(yǎng)偏好，在水環(huán)境中處于不同的營養(yǎng)限制狀態(tài)時(shí)，可能會(huì)由于產(chǎn)生的化感物質(zhì)較少導(dǎo)致化感作用不太明顯。此外，這可能也在某種程度上，解釋了在一些重度富營養(yǎng)化水體中，綠藻能對(duì)藍(lán)藻產(chǎn)生明顯化感抑制作用的現(xiàn)象[43]。

表2 濾液培養(yǎng)對(duì)微藻的抑制情況Table 2 The inhibition of filtrate culture on microalgae