海洋石油降解菌Pseudoalteromon SI-JHS發(fā)酵條件的優(yōu)化

張愛(ài)君，程鵬高，唐 娜*，曹軍瑞

(1.天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院，天津 300457；2.自然資源部天津海水淡化與綜合利用研究所，天津 300192；3.天津市鹵水化工與資源生態(tài)化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457)

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展，對(duì)能源特別是石油的需求量日益增長(zhǎng)，但石油在開(kāi)采、煉制、運(yùn)輸和儲(chǔ)存過(guò)程中發(fā)生的海上溢油事故時(shí)有發(fā)生，加劇著石油對(duì)海洋環(huán)境的威脅[1-2]。目前常用的治理海上溢油污染的方法主要有物理方法、化學(xué)方法和生物方法三種方法。與物理化學(xué)修復(fù)手段相比，生物修復(fù)具有成本低、無(wú)二次污染、處理效果好等優(yōu)點(diǎn)，在諸多含油海水處理方法中被認(rèn)為是最有應(yīng)用前景的處理技術(shù)[3]，并已有生物修復(fù)法治理石油污染的實(shí)例[4]。目前，已報(bào)道的石油降解菌有數(shù)百種，涉及數(shù)十個(gè)屬[5]，如芽孢桿菌(Bacillus)、假單胞菌(Pseudomonas)、脫硫菌(Desulfosarcina)、紅球菌(Rhodococcus)等[6-9]。由于海水較高的鹽度制約著石油降解菌的生長(zhǎng)及降解效率，傳統(tǒng)的非耐鹽菌株并不適合對(duì)高鹽環(huán)境進(jìn)行生物修復(fù)。因此，海洋來(lái)源的耐鹽石油降解菌在海上溢油處理中具有更好的應(yīng)用前景[10]。

本課題組在前期的研究中，從渤海入?？诘哪嗌持蟹蛛x獲得一株可降解石油的菌株SI-JHS，鑒定為假交替單胞菌(Pseudoalteromonsp.)，能夠以石油為唯一碳源。本研究以SI-JHS為出發(fā)株，采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)法和響應(yīng)面分析法[11]對(duì)石油降解菌SI-JHS降解石油的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，確定培養(yǎng)基主要影響因子及其最佳添加量，為海洋溢油的生物降解提供前期技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌種

海洋石油降解菌SI-JHS(Pseudoalteromon sp.)為本實(shí)驗(yàn)室保存，篩選自渤海入?？谔幍男薮瑥S灘涂。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g/L，酵母粉 5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 值7.0，固體培養(yǎng)基添加1.5%～2%瓊脂粉。該培養(yǎng)基用于菌株的保存和傳代培養(yǎng)。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：NaCl 35.0 g，K2HPO41.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NH4NO31.0 g，酵母提取物 0.01 g，蒸餾水補(bǔ)足1 L，pH值7.5。121 ℃，高壓滅菌20 min。石油含量1 g·L-1。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法

1.3.1 菌株的活化

將保存的海洋石油降解菌SI-JHS轉(zhuǎn)接于LB固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2 d。挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，30℃，160 r/min搖床培養(yǎng)過(guò)夜，按1%接種量將種子液轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行條件摸索試驗(yàn)。

1.3.2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)

采用Design expert 軟件，選擇石油降解菌SI-JHS培養(yǎng)基中的5個(gè)因子，進(jìn)行Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察石油降解率。實(shí)驗(yàn)各因素的水平設(shè)置見(jiàn)表1。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)因素編碼及水平

1.3.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出的顯著影響因子的正負(fù)效應(yīng)，設(shè)計(jì)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)路徑和步長(zhǎng)，使生物表面活性劑產(chǎn)量逼近最佳值反應(yīng)區(qū)域[12]。

1.3.4 響應(yīng)面分析

利用Design-Expert8.06軟件進(jìn)行2因子3水平Central Composite Design的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定顯著因子的最佳水平。

1.3.5 石油降解率測(cè)定

采用紫外分光光度法繪制石油含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]。試管中加入50 μL硫酸溶液進(jìn)行酸化，加1 mL正己烷萃取，萃取液轉(zhuǎn)移至25 mL離心管， 160 r/min震蕩 2 min，10000 r/min離心3 min，測(cè)定其上層液體于波長(zhǎng)227 nm處的吸光度(以A1表示)。同時(shí)以未加菌株的篩選培養(yǎng)基為空白對(duì)照，測(cè)定其上層液體于波長(zhǎng)227 nm處的吸光度(A0)，將吸光度帶入石油標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算石油含量(C0為空白對(duì)照石油油含量，C1為降解后殘余石油含量)。降解活性以降解率表示：

2 結(jié)果與討論

2.1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)

采用初始發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)海洋石油降解菌SI-JHS時(shí)，石油降解率可達(dá)到70%。在此基礎(chǔ)上優(yōu)化培養(yǎng)基組分。以發(fā)酵培養(yǎng)基5種成分作為5各因素，選用實(shí)驗(yàn)次數(shù)為N=12的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，X1、X3、X5、X7、X9分別代表磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硝酸銨、酵母提取物，設(shè)計(jì)X2、X4、X6、X8、X10空白作為誤差分析項(xiàng)。每個(gè)因素分別選取了高水平(+1)和低水平(-1)，以石油降解率作為響應(yīng)值。PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)值見(jiàn)表2，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)兩個(gè)平行樣，結(jié)果取平均值。

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)值

利用Design-expert8.06軟件對(duì)PB試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，由石油降解率影響因素主效應(yīng)分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 石油降解率影響因素主效應(yīng)分析結(jié)果

由表3可以看到，回歸模型的P值為0.0053(P<0.05)，說(shuō)明該模型顯著，在整個(gè)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)區(qū)間內(nèi)擬合較好。各變量對(duì)響應(yīng)值影響顯著性油F值檢驗(yàn)來(lái)判定，P值越小，響應(yīng)變量的顯著程度越高。培養(yǎng)基中各因素對(duì)石油降解率影響效應(yīng)大小順序依次為：硝酸銨>硫酸鎂>磷酸氫二鉀>磷酸二氫鉀>酵母提取物，其中硝酸銨(P=0.0005)、硫酸鎂(P=0.0201)是主要的影響因子(P<0.05)，其他因素對(duì)發(fā)酵液表面張力變化影響不顯著。因此，選擇硝酸銨和硫酸鎂這兩個(gè)因素進(jìn)行更深入的研究。

2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

表4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

分析Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定硝酸銨和硫酸鎂為主要的影響因素，硫酸鎂對(duì)石油降解率起負(fù)效應(yīng)，即硫酸鎂濃度越高，石油降解率越小。硝酸銨對(duì)石油降解率影響為正效應(yīng)，提高硝酸銨的含量，可以提高石油降解率。根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定兩個(gè)影響因子的實(shí)驗(yàn)范圍和爬坡步長(zhǎng)，設(shè)計(jì)最陡爬坡路徑(表4)。

通過(guò)表4實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，石油降解率變化趨勢(shì)為先升高再下降，在第8組實(shí)驗(yàn)中石油降解率最大，因此選擇第8組實(shí)驗(yàn)的各因素作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)，即硫酸鎂0.75 g/L，硝酸銨2.0 g/L。

2.3 響應(yīng)面分析

根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)和最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)2個(gè)影響顯著的因子硫酸鎂和硝酸銨進(jìn)行中心組和設(shè)計(jì)結(jié)合響應(yīng)面分析，以確定他們的最佳值，獲得最佳石油降解效果。實(shí)驗(yàn)因子水平及編碼見(jiàn)表5，共計(jì)13組實(shí)驗(yàn)，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀、酵母提取物濃度分別為1 g/L，1 g/L，0.01 g/L。

表5 中心組和設(shè)計(jì)及結(jié)果

以石油降解率為響應(yīng)值，Design of experiments8.06軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果如表6所示。

表6 方差分析

對(duì)中心組和設(shè)計(jì)確定的各參數(shù)取值范圍進(jìn)行響應(yīng)面分析，結(jié)果如圖1所示。

圖中顯示硫酸鎂和硝酸銨對(duì)石油降解率的交互影響的三圍曲面圖和相應(yīng)等高線圖，回歸模型的最佳值存在響應(yīng)面最低點(diǎn)，等高圖的圓心。通過(guò)Design of experiments8.06軟件計(jì)算，得出發(fā)酵液表面張力最低時(shí)培養(yǎng)基成分為：氯化鈉35 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂0.89 g/L，硝酸銨2.11 g/L，酵母提取物0.01 g/L，在此優(yōu)化條件下，發(fā)酵液的對(duì)石油降解率達(dá)到80.5%。

圖1 硫酸鎂和硝酸銨交互影響的三維曲面圖和相應(yīng)等高線圖

2.4 搖瓶發(fā)酵優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

為了驗(yàn)證理論值與實(shí)驗(yàn)值的符合性，按照優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基配方對(duì)菌株SI-JHS發(fā)酵液對(duì)降解效果進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)測(cè)得平均降解率為80.8%，與預(yù)測(cè)值基本符合，證實(shí)了模型的有效性。

3 結(jié)論

海洋來(lái)源的石油降解菌在海上溢油的生態(tài)修復(fù)技術(shù)方面具有良好的應(yīng)用前景。本研究利用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)對(duì)菌株SI-JHS降解石油的培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，硝酸銨和硫酸鎂為顯著影響因子，通過(guò)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和中心組和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，建立硝酸銨和硫酸鎂的二次回歸方程，經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明了該模型可靠性，最終獲得海洋石油降解菌SI-JHS降解石油的最佳培養(yǎng)基配方為：氯化鈉35 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂0.89 g/L，硝酸銨2.11 g/L，酵母提取物0.01 g/L。使用優(yōu)化條件培養(yǎng)海洋石油降解菌SI-JHS，石油降解率為80.8%，與預(yù)測(cè)值接近，比優(yōu)化前提高了14.2%。