星點設(shè)計法優(yōu)化瑪咖中總黃酮的提取工藝

郭雅麗，王 易，張 邈，程玉蕾，張德娥，李佳藝，肖 莉

(湖州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 湖州 313000)

瑪咖有“秘魯人參”之稱，是一種傳統(tǒng)的藥食兩用型植物，目前在我國云南地區(qū)廣泛種植[1]。臨床藥理研究結(jié)果顯示，瑪咖富含生物堿、瑪咖酰胺、瑪咖烯、黃酮、多糖等次生代謝產(chǎn)物，具有改善性功能、抗疲勞、抗氧化等功效，藥用價值較高，受到人們的廣泛關(guān)注[2-4]。目前對瑪咖中活性成分的研究主要集中于瑪咖酰胺、瑪咖烯及多糖等，對瑪咖中黃酮成分的研究則較少。本研究以瑪咖總黃酮為指標(biāo)，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，利用星點設(shè)計-響應(yīng)面優(yōu)化法對超聲波輔助提取瑪咖總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為瑪咖總黃酮源的綜合利用提供參考[5-6]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

電子分析天平，Mettler Tlledo；756CRT紫外可見分光光度計，上海佑科；高速多功能粉碎機(jī)，上海舍巖；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮；抽濾真空泵，鄭州長城；超聲波清洗器，上海閣凌。

1.2 試藥

瑪咖原粉，產(chǎn)自云南，曬干后加工為瑪咖粉；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所，批號：F20171108；無水乙醇、95%乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等，均為國產(chǎn)分析純。

2 實驗方法

2.1 瑪咖總黃酮的測定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

精密稱取一定量的蘆丁對照品置于50 mL容量瓶中，加入適量95%乙醇超聲處理使溶解后，續(xù)加95%乙醇稀釋定容至刻度，搖勻，得到0.200 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液備用。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL置于10 mL容量瓶中，依據(jù)顯色條件依次加入亞硝酸鈉溶液、硝酸鋁溶液、氫氧化鈉溶液，并在510 nm波長處依次測定吸光度，得到線性回歸方程為：A=5.0378C-0.011，R2= 0.9968，表明在0.04～0.14 mg/mL范圍內(nèi)，吸光度與濃度線性關(guān)系良好。

2.1.3 總黃酮含量的測定

精密吸取一定量的瑪咖提取液，按2.1.3項方法測定吸光度，代入回歸方程，計算得到瑪咖總黃酮含量，根據(jù)下述公式，計算得瑪咖總黃酮提取率。

C為提取液中瑪咖總黃酮濃度(mg/mL)，V為提取液體積(mL)，M為瑪咖藥材粉末投料量(g)。

2.2 單因素考察

2.2.1 乙醇濃度

精密稱取瑪咖粉末10.00 g，固定料液比為1∶7，超聲時間為30 min，考察在40%、50%、60%、70%、80%乙醇濃度條件下總黃酮的提取率。

2.2.2 料液比

密稱取瑪咖粉10.00 g，固定乙醇濃度為60%，超聲時間30 min，分別考察在料液比(g/mL) 為1∶5、1∶7、1∶9、1∶11、1∶13的條件下總黃酮的提取率。

2.2.3 提取次數(shù)

密稱取瑪咖粉末10.00 g，固定乙醇濃度為60%，料液比為1∶7，超聲時間為30 min，考察提取次數(shù)為1次、2次、3次時總黃酮的提取率。

2.2.4 提取時間

精密稱取瑪咖粉末10.00 g，固定乙醇濃度為60%，料液比為1∶7，考察分別在超聲時間10、20、30、40、50 min 條件下總黃酮的提取率。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝

單因素試驗的結(jié)果，只能得到單因素對提取率的影響，無法獲得單因素之間的交互作用結(jié)果。本實驗在單因素實驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)星點設(shè)計原理，選擇乙醇濃度(A)、料液比(B)及提取時間(C)3個影響因素為自變量，以瑪咖總黃酮提取率為響應(yīng)值，設(shè)計3因素5水平響應(yīng)面分析方法優(yōu)化提取工藝，采用Design-Expert v8.0進(jìn)行試驗結(jié)果分析。因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平表

3 實驗結(jié)果與討論

3.1 單因素實驗結(jié)果

圖1 乙醇濃度、料液比、提取時間及提取次數(shù)對瑪咖總黃酮提取率的影響

Fig.1 Effect of ethanol,material-liquid ratio,extraction time,frequency on extraction rate of flavonoids from Maca

單因素實驗結(jié)果如圖1所示。由圖可知，當(dāng)乙醇濃度為60%時測得瑪咖總黃酮提取率最高，這可能是由于瑪咖黃酮中主要成分為中等極性的黃酮苷類物質(zhì)，隨著提取溶劑中乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，體系的極性下降，從而降低了黃酮苷類物質(zhì)的溶出。隨著超聲時間的延長，瑪咖總黃酮的提取率出現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)超聲時間為30 min時，瑪咖總黃酮提取率達(dá)到最高值0.58%。這是由于隨著超聲時間的延長，瑪咖總黃酮逐漸達(dá)到溶出平衡，超過30 min時，瑪咖中雜質(zhì)成分的溶出也隨之增加，從而干擾瑪咖總黃酮的測定。當(dāng)料液比達(dá)到1∶7時，瑪咖總黃酮提取率達(dá)到最高值。究其原因，可能是由于此時瑪咖中的黃酮成分已基本溶出完全，進(jìn)一步提高料液比也無法提高提取率，從而造成溶劑的浪費。瑪咖總黃酮提取率雖然隨提取次數(shù)的增加有所升高，但升高并不明顯，從實驗效果與成本等多方面考慮，因此確定最佳提取次數(shù)為1次。根據(jù)單因素實驗結(jié)果，確定后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化的各自變量范圍為：乙醇濃度50%～70%，超聲時間20～40 min，料液比1∶5～1∶9。

3.2 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝結(jié)果

采用星點設(shè)計原理設(shè)計瑪咖總黃酮提取實驗安排及實驗結(jié)果見表2。

表2 星點實驗設(shè)計及結(jié)果

以瑪咖總黃酮提取率為指標(biāo)(R1)，采用Design-expert8.0.6軟件對響應(yīng)值與各因素進(jìn)行回歸擬合，得到的回歸方程為：

R1=0.98-0.13A-0.056B+0.028C+0.051AB-0.026AC+0.011BC-0.19A2-0.082B2-0.19C2

表3 回歸模型方差分析

注: *P<0.05;＊＊P<0.01;＊＊＊P<0.001

3.3 交互作用對瑪咖總黃酮提取率的影響

相對于三個單因素其中兩個因素，通過Design-expert軟件繪制三維響應(yīng)面圖，進(jìn)一步分析各因素交互作用對瑪咖總黃酮提取率的影響。響應(yīng)面的平緩程度，直觀地反映了各自變量發(fā)生變化時瑪咖總黃酮提取率的響應(yīng)靈敏程度。

圖2 兩因素交互作用對瑪咖總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖

圖2中的三維效應(yīng)面圖可以反映出乙醇濃度(A)、提取時間(B)和溶劑倍數(shù)(C)的交互作用對瑪咖總黃酮提取率的影響。AB、AC、BC的曲面坡度均較為平緩，故其對瑪咖總黃酮提取率的影響不顯著，與方差分析的結(jié)果一致。

3.4 最優(yōu)方案的驗證

設(shè)置瑪咖總黃酮提取率目標(biāo)值為最大值，通過Design-Expert 軟件分析出最佳提取工藝為：乙醇濃度57.58%，提取時間27.35 min，料液比1∶7.10，60℃下提取1次，瑪咖總黃酮理論提取率為1.01%。按此工藝平行實驗三次，得到的瑪卡總黃酮平均提取率為0.99%，實測值與預(yù)測值差別不大，說明該工藝穩(wěn)定可靠。

4 結(jié)論

本研究采用星點設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化法，可以直觀反映出各個因素對瑪咖總黃酮提取率的影響。二項式擬合結(jié)果顯示相關(guān)系數(shù)R為0.9763，說明本次建立的擬合模型較為成功，預(yù)測性良好。獲得最佳提取條件為：乙醇濃度57.58%，提取時間27.35 min，料液比1∶7.10，60℃下提取1次，在此條件下瑪咖總黃酮提取率為0.99%，為瑪卡總黃酮的提取應(yīng)用提供一定的參考。