丹參注射液通過Nrf2/ARE通路對大隱靜脈曲張的影響

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院血管外科,重慶 400038)

大隱靜脈是位于下肢內(nèi)側(cè)的淺表靜脈，自足部至大腿根部，再到下肢深靜脈[1]。大隱靜脈曲張發(fā)生的原因是長時(shí)間處于站立、靜坐的狀態(tài)，活動(dòng)次數(shù)少，導(dǎo)致下肢靜脈血液流動(dòng)出現(xiàn)障礙，引發(fā)靜脈迂曲擴(kuò)張[2]。大隱靜脈曲張是血管外科最常見的疾病之一，在我國的發(fā)病率約為10%[3]，其在體力勞動(dòng)的群體中發(fā)病率相對較高，初期病情不明顯，不易引起重視，但隨著病情的發(fā)展，會逐漸發(fā)展為下肢水腫、小腿皮膚變黑、淤積性皮炎，晚期會發(fā)展為慢性潰瘍，不易痊愈，患者活動(dòng)受限制，對患者的生活及工作造成不可逆轉(zhuǎn)的影響[4-6]。丹參具有擴(kuò)血管、活血化瘀等功效[7]。藥理研究表明，丹參可通過抑制磷酸二酯酶提高細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度,對抗血小板聚積,促進(jìn)纖維蛋白降解,降低血液高黏滯性等，從而產(chǎn)生抗氧化、抗凝血、抗炎、抗菌等免疫調(diào)節(jié)作用，以丹參為主的多種復(fù)方制劑已被廣泛用于臨床[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2/ARE是一種有關(guān)機(jī)體防御性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的通路，能使身體抵御內(nèi)、外界氧化等各種刺激性的傷害，目前已成為最熱點(diǎn)的抗氧化應(yīng)激通路[10-11]。Nrf2由NFE2L2基因編碼，是該信號通路重要的調(diào)控因子之一，也是活力最強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄因子，其轉(zhuǎn)錄活性主要受Keapl調(diào)控[12-13]。本研究通過觀察各組患者并發(fā)癥、CIVIQ評分、Nrf2/ARE蛋白和mRNA表達(dá)量的差異與丹參使用的相關(guān)性，了解丹參注射液對大隱靜脈曲張患者的作用，并探討其機(jī)制，以期為臨床大隱靜脈曲張的治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2016年1月至2017年12月于我科診治的大隱靜脈曲張患者810例，其中男456例，女354例，年齡35～78歲，平均(52.01±2.60)歲，病程(19.65±3.80)年。通過與患者溝通的治療方案將所有患者分成對照組(未治療)、手術(shù)組(手術(shù)治療)和丹參組(手術(shù)治療聯(lián)合丹參注射液注射治療)，每組270例。所有患者均對本研究知情并簽署同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前行靜脈造影，確診為單純大隱靜脈曲張，直徑增大，深靜脈無血栓形成，血流通暢；表面可見下肢淺表靜脈怒張、色素沉著等；久站、久坐、長時(shí)間不運(yùn)動(dòng)后會出現(xiàn)下肢酸脹沉重、抽搐、皮膚瘙癢等癥狀。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前造影存在深靜脈血栓、KT綜合征、髂靜脈壓迫綜合征、下腔靜脈病變綜合征等；經(jīng)外科及靜脈腔內(nèi)手術(shù)(包括丹參注射液注射治療)治療后復(fù)發(fā)；已知對丹參注射液或含有丹參成分的藥物過敏。

1.2 方法

1.2.1 大隱靜脈主干高位結(jié)扎術(shù) 手術(shù)組患者取平臥位，局部麻醉后，自大腿大隱靜脈主干徑下段距患者側(cè)面膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)下方3～5 cm處做1個(gè)約0.5 cm的縱向切口，在切口處挑起長度約為1 cm的大隱靜脈，用4#絲線在上端和下端結(jié)扎，用0#絲線縫合切口。雙下肢大隱靜脈曲張者，結(jié)扎一側(cè)大隱靜脈后再結(jié)扎另一側(cè)。

1.2.2 丹參注射液注射治療 大隱靜脈主干結(jié)扎術(shù)后，丹參組患者取站立位，用75%酒精消毒患肢，在大腿中、下1/3交界處扎止血帶，從遠(yuǎn)心端向近心端逐個(gè)找取曲張靜脈處，注射之前先選取注射點(diǎn)進(jìn)行曲張淺靜脈穿刺測試，觀察到回抽有血后才能注射丹參注射液。每個(gè)注射點(diǎn)注射1～2 mL，如果遇到粗大的曲張靜脈可增加劑量，但不能超過10 mL。如下肢曲張靜脈較多,管腔較粗大，可以采用上下分段注射法。注射完畢后立即用棉球壓迫止血，不出血后立即穿上合適的醫(yī)用康復(fù)彈力套，行走30 min以防止深靜脈血栓形成。

1.2.3 術(shù)后處理 術(shù)后6 h患者下床活動(dòng)，每天適當(dāng)行走，以促進(jìn)靜脈回流，預(yù)防下肢深靜脈血栓形成；注意切口換藥，術(shù)后10～12 d拆線；彈力繃帶加壓包扎3 d后改用醫(yī)用彈力套；術(shù)后1周可在夜間取下彈力套，堅(jiān)持穿戴6個(gè)月。

1.2.4 Western blot法檢測血液內(nèi)Nrf2/ARE的蛋白含量 常規(guī)方法取3組患者血液，用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉洗膜后分別加入一抗，4 ℃過夜，分別加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗，37 ℃孵育，洗膜后加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)后置于曝光機(jī)上曝光。用Image J軟件對Western blot條帶進(jìn)行定量分析，以目的條帶和GAPDH條帶積分光密度值比值作為最終結(jié)果。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測血液內(nèi)Nrf2/ARE mRNA表達(dá) 將3組血液加入胰蛋白酶消化,進(jìn)行PBS沖洗,并滴入0.9%的氯化鈉溶液,放入1 mL Trizol teagent,加入2 mL RNA試劑提取RNA,取3組患者血液20 mL置于EP管中,通過A3500反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄提取到cDNA,將反轉(zhuǎn)后的cDNA使用核酸凝膠染料進(jìn)行目的基因的表達(dá)檢測,檢測儀器為CFX-96 qRT-PCR儀,使用的相關(guān)引物已通過NCBI/Primer數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證,反應(yīng)條件:98 ℃ 6 min,溶液8 ℃ 28 s,75℃ 30 s,80 ℃ 4 min,總計(jì)55個(gè)循環(huán)。PCR循環(huán)中都可有效的變性。

表1 引物序列

1.3 觀察指標(biāo)及隨訪

根據(jù)Wong-Baker疼痛評分標(biāo)準(zhǔn)，大隱靜脈曲張?zhí)弁捶譃?～4分。觀察3組患者色素沉著、淺靜脈血栓、皮下硬結(jié)等并發(fā)癥發(fā)生情況，采用CIVIQ評分評估患者的生活質(zhì)量，包括社會、心理、身體體能和疼痛等 4個(gè)層面20個(gè)小項(xiàng)的評分(每個(gè)小項(xiàng)1～5分)。超聲檢測患者閉塞和反流率，術(shù)后1周，患者站立位，觀察術(shù)肢有無殘留靜脈曲張。術(shù)后3、6個(gè)月返院復(fù)診隨訪。采用CT靜脈造影檢查患者靜脈管腔改善情況。Western blot法檢測血液內(nèi)Nrf2/ARE的蛋白含量。實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測患者血液內(nèi)Nrf2/ARE mRNA的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后并發(fā)癥情況比較

術(shù)后3個(gè)月疼痛情況見表2，對照組色素沉著、淺靜脈血栓、皮下硬結(jié)等并發(fā)癥發(fā)生率最高，手術(shù)組次之，丹參組最低，3組比較差異有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與術(shù)后3個(gè)月比較，術(shù)后6個(gè)月對照組并發(fā)癥發(fā)生率顯著升高，手術(shù)組、丹參組明顯降低，差異有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3。

表2 患者術(shù)后Wong-Baker疼痛量表結(jié)果比較(n=270,例)

*：與對照組比較,P<0.01;#：與手術(shù)組比較,P<0.01

表3 患者術(shù)后并發(fā)癥情況比較[n=270,例(%)]

*：與對照組比較，P<0.01；#：與手術(shù)組比較，P<0.01；△：與術(shù)后3個(gè)月比較，P<0.05

2.2 術(shù)后CIVIQ評分比較

術(shù)后3個(gè)月對照組CIVIQ評分最高，手術(shù)組次之，丹參組最低，組間比較差異有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與術(shù)后3個(gè)月比較，術(shù)后6個(gè)月對照組CIVIQ評分明顯升高，手術(shù)組、丹參組明顯下降，差異有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表4。

表4 各組術(shù)后CIVIQ評分比較分)

*：與對照組比較，P<0.01；#：與手術(shù)組比較，P<0.01；△：與術(shù)后3個(gè)月比較，P<0.05

2.3 超聲檢查結(jié)果比較

術(shù)后3個(gè)月，對照組閉塞和反流率最低，丹參組次之，手術(shù)組最高，3組比較差異有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與術(shù)后3個(gè)月比較，術(shù)后6個(gè)月對照組閉塞和反流率明顯下降，手術(shù)組、丹參組明顯升高，差異有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表5。

2.4 CT靜脈造影檢查

CT靜脈造影結(jié)果顯示，對照組靜脈管腔內(nèi)存在長短不一、持久的類圓柱形或圓柱形密度較低的造影區(qū)域，丹參組與手術(shù)組相比靜脈管腔不規(guī)則狹小明顯較少，部分?jǐn)U張也有所縮小，差異有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

表5 各組閉塞和反流率比較[n=270,例(%)]

*：與對照組比較，P<0.01；#：與手術(shù)組比較，P<0.01

a:對照組；b：手術(shù)組；c：丹參組

2.5 Western blot法檢測Nrf2/ARE的蛋白含量

Western blot結(jié)果顯示，對照組的Nrf2/ARE蛋白含量最低，丹參組的Nrf2/ARE蛋白含量最高，且丹參組Nrf2/ARE蛋白含量明顯高于手術(shù)組，差異有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

a: 血液內(nèi)Nrf2/ARE的蛋白含量;b: 血液內(nèi)Nrf2/ARE的蛋白相對表達(dá)量 *：與對照組比較，P<0.01;#：與手術(shù)組比較，P<0.01

圖2 患者血液內(nèi)Nrf2/ARE的蛋白含量

2.6 qRT-PCR法檢測Nrf2/ARE mRNA表達(dá)量

對照組患者血液中的Nrf2/ARE mRNA表達(dá)量最低，丹參組的Nrf2/ARE mRNA表達(dá)量最高，丹參組Nrf2/ARE mRNA表達(dá)量明顯高于手術(shù)組，差異有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

3 討論

大隱靜脈曲張是一種常見的下肢靜脈疾病，在成年人中發(fā)病率約占50%，其特征為下肢血管如同蚯蚓狀突起，在站立時(shí)尤其明顯，在平躺時(shí)會消失[14-15]。研究表明，大隱靜脈曲張的發(fā)病原因與長時(shí)間站立或靜坐、激素、遺傳等均有關(guān)系，在從事長時(shí)間站立工作和體力勞動(dòng)人群中發(fā)病率高[16]。長期血液淤滯會造成下肢營養(yǎng)不良，可能會出現(xiàn)皮膚潰爛、潰瘍，甚至?xí)?dǎo)致下肢深靜脈血栓[17]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，隨著年齡增長，大隱靜脈曲張發(fā)病率呈上升趨勢，女性相較于男性發(fā)病率更高[18]。該病長期以來的治療方法是傳統(tǒng)外科手術(shù)。近年來，隨著其他方法的深入研究，中醫(yī)治療方案也陸續(xù)出現(xiàn)[19]。

a: 血液內(nèi)Nrf2/ARE mRNA表達(dá)量;b:血液內(nèi)Nrf2/ARE mRNA相對表達(dá)量 *：與對照組比較,P<0.01;#：與手術(shù)組比較,P<0.01

圖3 各組患者血液內(nèi)Nrf2/ARE mRNA表達(dá)量

本研究發(fā)現(xiàn)，盡管手術(shù)組術(shù)后并發(fā)癥、CIVIQ評分等指標(biāo)較對照組明顯好轉(zhuǎn)，但是情況仍然不樂觀。本研究在手術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)一步使用丹參注射液輔助治療后發(fā)現(xiàn)其對于手術(shù)后的情況改善非常明顯，閉塞和反流率均明顯改善，管腔狹窄情況進(jìn)一步減少。大隱靜脈曲張患者進(jìn)行靜脈主干高位結(jié)扎手術(shù)后，病情得到控制，手術(shù)后注射丹參注射液的患者恢復(fù)明顯加快，術(shù)后并發(fā)癥明顯減少，說明丹參注射液對大隱靜脈曲張有治療作用，且效果較好。Yu等[3]從丹參中分離出的一種新型天然產(chǎn)物Diethyl Blechnic，其通過抑制ROS和激活JNK1/2來抑制靜脈曲張，而本文發(fā)現(xiàn)丹參注射液對于Nrf2/ARE同樣具有改善作用，是否是其中Diethyl Blechnic成分的功效還需要后續(xù)深入探究。此外，有報(bào)道顯示，丹參注射液聯(lián)合低分子肝素鈣可有效抑制靜脈曲張的發(fā)展，對治療大隱靜脈曲張具有一定的促進(jìn)作用，可縮短患者術(shù)后的恢復(fù)時(shí)間[20]，對于后續(xù)丹參注射液聯(lián)合用藥治療大隱靜脈曲張?zhí)峁┝私梃b。

本研究結(jié)果顯示，丹參組的Nrf2/ARE mRNA和蛋白相對表達(dá)量均最高，說明注射丹參注射液能夠促進(jìn)Nrf2/ARE的表達(dá)，加快大隱靜脈曲張患者的恢復(fù)。Zhang等[21]的研究證實(shí)丹參能夠活化Nrf2/ARE，促進(jìn)Nrf2/ARE mRNA的表達(dá)，加快病情好轉(zhuǎn)，本研究結(jié)果與之一致。

綜上所述，通過注射丹參注射液能夠促進(jìn)Nrf2/ARE的表達(dá)，抑制大隱靜脈曲張的發(fā)展，對大隱靜脈曲張有治療作用。