離子交換萃取-反相色譜法測定嬰幼兒配方乳粉和保健食品中葉酸

宋戈,王鑫

（1.黑龍江省華測檢測技術(shù)有限公司，哈爾濱150028；2.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，哈爾濱150028）

0 引 言

葉酸( folic acid) 又稱維生素B9，是一種重要的B族維生素，是維持人體正常物質(zhì)代謝和某些特殊生理功能不可缺少的一類有機(jī)化合物，在人體生長代謝、發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用，是嬰幼兒配方奶粉中的基本營養(yǎng)成分。同時(shí)由于人體不能自身合成葉酸,只有從膳食中攝取[1],所以葉酸會在保健食品或者營養(yǎng)補(bǔ)充品中添加。目前檢測葉酸的方法有很多,微生物法是應(yīng)用最為廣泛的, 也是美國官方分析化學(xué)家協(xié)會的推薦方法?，F(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.211-2014《食品中葉酸的測定》[2]采用的也是微生物法。微生物法靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確，但周期長、步驟繁瑣、重復(fù)性差，影響因素多。隨著技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)以微生物理論為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫法[3]、試劑盒法（96 微孔板法）[4]，雖然耗時(shí)縮短，操作簡便，但精密性和穩(wěn)定性仍然較差。與此同時(shí)國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道利用儀器檢測葉酸的方法也很多，如電化學(xué)法[5-11]、超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[12-17]、超高效液相色譜串聯(lián)離子色譜法[18]等，靈敏度高但須要特殊的配備，不適合日常檢測；還有熒光法[19-21]和紫外法[22-26]，但需要進(jìn)行衍生反應(yīng)或不適用于基質(zhì)復(fù)雜的嬰幼兒配方奶粉和保健食品中葉酸的提取與測定。

本研究嘗試采用不同溶劑對嬰幼兒配方乳粉和保健食品樣品進(jìn)行提取，配以不同的固相萃取方式進(jìn)行凈化富集，加以優(yōu)化并比較除雜效果、重復(fù)性、準(zhǔn)確性以及靈敏度，建立操作方便準(zhǔn)確性好的固相萃取-高效液相色譜法，為嬰幼兒配方乳粉和保健食品中葉酸的日常檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

LC-20AD 高效液相色譜儀，日本島津公司；SPD-20AV 紫外檢測器,日本島津公司；TTL-DCⅡ水浴加熱氮吹儀,北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；pB-10酸度計(jì)，德國Sartorius 公司；KQ-250DE 超聲波振蕩器，昆山市超聲儀器有限公司；VORTEX3 渦旋混合器，德國IKA 公司；SQP天平，德國Sartorius公司。

1.2 材料與試劑

葉酸(≥99%)，德國Dr.Ehretorfer 公司；二水合磷酸二氫鉀(色譜純)、乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、甲酸（色譜純）、氫氧化鈉、氨水（質(zhì)量分?jǐn)?shù)約25%）、碳酸鈉、L-抗壞血酸和二水合乙二胺四乙酸二鈉，天津科密歐公司；WatersOasis MAX 固相萃取柱6cc/150mg，美國Waters 公司，實(shí)驗(yàn)用水均為蒸餾水，以上試劑除標(biāo)注的外均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液

葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取葉酸對照品12.5 mg左右，用0.1 mol/L Na2CO3溶液溶解，加入250 mg 抗壞血酸并用水定容至50 mL 棕色容量瓶中，配制成250 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。4 ℃避光保存，有效期為2個(gè)月。

葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確量取1.0 mL 葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用水定容至50 mL 容量瓶中，稀釋成5.0 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 樣品處理

稱取嬰幼兒配方乳粉、保健品等固體樣品約2.0 g于50 mL 離心管中，加入10 mL (50±5 ℃）的水將試樣充分振蕩溶解；液體樣品約10.0g 于50 mL 離心管中。加入5.0mL，0.1 mol/L EDTA 溶液充分混合后，再加入10 mL，0.1 mol/L Na2CO3（含5 mg/mL 的L-抗壞血酸）溶液進(jìn)行混勻后超聲波振蕩15 min，加入15 mL 乙腈漩渦振蕩1 min，用水轉(zhuǎn)移定容至50 mL。搖勻?yàn)V紙過濾后取濾液10 mL,上樣到用甲醇和水活化過的WatersOasis MAX 固相萃取柱（6 cc/150 mg）中，分別用6 mL 水和甲醇淋洗，再用6 mL 5%甲酸甲醇溶液洗脫至氮吹管中，于50 ℃下濃縮近干，加入1 mL 0.002 mol/L Na2CO3（含0.1 mg/mL 的L-抗壞血酸），振蕩超聲溶解后過0.45 um 水膜上機(jī)測定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Inertsustain AQ-C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫：25 ℃；檢測器：紫外檢測器，檢測波長：280 nm；流動(dòng)相：甲醇+0.05 mol/L 磷酸二氫鉀（pH 為4.5）=30+70，流速：1.0 mL/min。葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜見圖1。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取劑的選擇與優(yōu)化

圖1 葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜

由于葉酸在堿性條件下易溶且穩(wěn)定性好，稱取固體樣品用10 mL 水溶解或液體樣品后，分別采用0.05 mol/L 磷酸鹽溶液[2]（pH6.8）、0.01 mol/L 氫氧化鈉[2]、0.1%氫氧化鈉[2，22]、0.5%氨水溶液[13，24]、0.01 mol/L 碳酸鈉溶液[14], 0.1 mol/L 碳酸鈉溶液[25-26]提取。為了防止葉酸氧化損失，每種提取劑都含有5 mg/mL 的L-抗壞血酸。經(jīng)過振蕩、超聲提取后進(jìn)行pH 值測定，只有用0.1 mol/L 碳酸鈉溶液提取的溶液呈堿性。由于嬰幼兒配方乳粉和保健食品樣品體系呈酸性，而且具有一定的緩沖性，加入的提取劑的堿性弱，無法中和樣品自身的酸性，會導(dǎo)致葉酸提取不完全和損失。此外葉酸在酸性條件下不穩(wěn)定，易氧化損失，為保證在整個(gè)處理過程包括進(jìn)一步固相萃取處理的堿性基質(zhì)環(huán)境，應(yīng)采用堿性強(qiáng)的提取劑，所以選擇0.1 mol/L 碳酸鈉，比氫氧化鈉緩沖性強(qiáng)，穩(wěn)定且存放時(shí)間長，也避免了氨水的刺激性氣味和易揮發(fā)的缺點(diǎn)。

2.2 固相萃取的選擇

葉酸具有谷氨酸結(jié)構(gòu)[27]，樣品經(jīng)堿性溶劑提取后，在提取液中葉酸呈弱陰離子態(tài)，提取液進(jìn)一步處理上樣凈化前仍呈堿性，則可以采用混合陰離子交換固相萃取柱凈化富集；若提取液經(jīng)過處理上樣凈化前變成酸性，葉酸在溶液中呈分子態(tài)，具有蝶啶環(huán)和苯環(huán)，可以采用聚合二乙烯苯/N-乙烯基吡咯烷酮固相萃取柱凈化富集。由于樣品溶液加入提取劑提取后無法得到澄清的濾液，結(jié)合日常實(shí)驗(yàn)沉淀蛋白除雜的方法，選取了加入甲醇、乙醇、乙腈、亞鐵氰化鉀與乙酸鋅、高氯酸和調(diào)pH 值處理。其中亞鐵氰化鉀與乙酸鋅結(jié)合沉淀處理得到了澄清的濾液，但無論采用混合陰離子交換固相萃取柱（MAX）還是采用聚合二乙烯苯/N-乙烯基吡咯烷酮固相萃取柱(HLB)進(jìn)行凈化富集后測定，檢測結(jié)果和回收率均偏低近三分之一。因?yàn)橐宜徜\和亞鐵氰化鉀混合使用會形成白色的絡(luò)合物, 此絡(luò)合物會與部分葉酸結(jié)合, 使部分葉酸損失, 造成結(jié)果不準(zhǔn)確[20]。用甲醇、乙醇、乙腈沉淀蛋白質(zhì)除雜時(shí)，即使在提取溶液中加入比例到達(dá)50%, 仍難以過濾。當(dāng)提取液中加入5 mL 0.1 mol/L 的EDTA 溶液，不僅可以螯合金屬元素，有利于葉酸的提取[25]，同時(shí)加入乙腈的比例達(dá)到30%沉淀效果較好，固相萃取凈化時(shí)不會導(dǎo)致被測物流失，而改用甲醇和乙醇時(shí)，即使加入的比例達(dá)到50%沉淀效果仍較差。0.1 mol/L EDTA 溶液加入的量過少，則加大乙腈的量才會有較好的沉淀效果，當(dāng)凈化液中乙腈比例過大，無論用MAX 固相萃取柱還是用HLB 固相萃取柱凈化，都會導(dǎo)致被測物流失；0.1 mol/L EDTA 溶液加入的量過多，即使加大乙腈的量也會導(dǎo)致沉淀效果較差。提取液加入EDTA 溶液和乙腈，混勻超聲振蕩后過濾得到濾液呈堿性，于是按1.3.2 進(jìn)行凈化處理,上機(jī)測定的色譜見圖2。

另外提取液經(jīng)過加高氯酸和調(diào)pH 值處理后都能得到澄清的濾液，加高氯酸和調(diào)pH 值沉淀蛋白的原理一樣，但加高氯酸簡單直接。提取液經(jīng)過加高氯酸處理得到的濾液呈酸性，則取10 mL 濾液上樣到用甲醇和水活化過的WatersOasis HLB 固相萃取柱（6cc/150 mg）中，用6 mL 水淋洗，再用6 mL 甲醇洗脫至氮吹管中，于50 ℃下濃縮近干，加入1 mL 0.002 mol/L Na2CO3（含0.1 mg/mL 的L-抗壞血酸），振蕩超聲溶解后過0.45 um 水膜上機(jī)測定，色譜見圖3。

通過比較譜圖2 和3，可以看出樣品經(jīng)過MAX 固相萃取柱凈化處理后測定，雜質(zhì)干擾少，分離度好。另外樣品經(jīng)過HLB 固相萃取柱凈化處理須要將提取液加高氯酸處理使濾液呈酸性，會導(dǎo)致葉酸不穩(wěn)定。通過試驗(yàn)證明樣品經(jīng)過HLB 固相萃取柱凈化處理的測定結(jié)果重復(fù)性較差，回收率較低，故最終采用1.3.2處理方式。

圖2 樣品經(jīng)混合陰離子交換固相萃取的色譜

圖3 樣品經(jīng)聚合二乙烯苯/N-乙烯基吡咯烷酮固相萃取的色譜

2.3 色譜條件的確定

查閱文獻(xiàn),分離測定葉酸采用的流動(dòng)相為0.05 mol/L或0.1 mol/L 的磷酸鹽溶液和甲醇體系，色譜柱為常規(guī)鍵合C18 柱[20-25]。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件，選用了Inertsus?tain AQ-C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。雖然高濃度的緩沖液做流動(dòng)相可以改善峰形和提高靈敏度，但對色譜系統(tǒng)會帶來堵塞和損傷的風(fēng)險(xiǎn)，在被測物的峰形和靈敏度有保障的前提下，選用0.05 mol/L的磷酸鹽溶液。而甲醇比乙腈兼溶鹽的能力強(qiáng)，在葉酸的檢測波長280 nm 下沒有背景吸收，宜選作做流動(dòng)相的組分。實(shí)驗(yàn)證明葉酸在C18 色譜柱中的保留性與磷酸鹽溶液的pH 值和流動(dòng)相中甲醇的比例有關(guān)，由于葉酸易溶于堿性溶液，磷酸鹽溶液的pH 值越大時(shí)，葉酸在色譜柱中呈離子態(tài)，流動(dòng)相對葉酸洗脫能力越強(qiáng)，葉酸的保留時(shí)間越短，會導(dǎo)致雜質(zhì)干擾和分離度下降；而磷酸鹽溶液的pH 值變小時(shí)，葉酸在色譜柱中呈分子態(tài)，流動(dòng)相對葉酸洗脫能力變?nèi)?，葉酸的保留時(shí)間變長，靈敏度會下降。磷酸鹽溶液pH 值不變時(shí)，流動(dòng)相中甲醇的比例越大，葉酸的保留時(shí)間越短，在保障被測物分離度的前提下，應(yīng)選擇提高靈敏度的流動(dòng)相組分和配比。通過對比不同pH 值磷酸鹽溶液和不同甲醇比例的流動(dòng)相對樣品中葉酸測定的分離度和靈敏度，采用0.05 mol/L 磷酸鹽溶液（pH4.5）和甲醇比例為70∶30 混合的流動(dòng)相較為合適，測定標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的色譜見圖1和2.

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

取不同濃度葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.5、1.0、5.0、50、250 mg/L 注入HPLC，記錄目標(biāo)峰峰面積。以峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度繪制線性回歸曲線，其線性關(guān)系為:y=11.817x-1.411，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998,線性范圍0.2～250 mg/L，并以3 倍信噪比計(jì)算出固體樣品稱取2 g 的檢出限為0.5 mg/kg，液體樣品稱取10 g 的檢出限為0.1 mg/kg。

2.5 回收率和精密度

以同一個(gè)嬰幼兒配方乳粉為實(shí)驗(yàn)材料，稱取樣品平行測定8 次，再稱取樣品分別加入0.5 mL 和1 mL 5 mg/L 的葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)行8 次平行測定，計(jì)算回收率以及樣品測定值與回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。回收率在91.2～103.5%，回收率的RSD 在2.99%～7.56%，樣品測定值的RSD 在2.59%～6.96%。由此可以看出，測定結(jié)果的較為穩(wěn)定，方法的重復(fù)性較好，準(zhǔn)確性好。

2.6 實(shí)際樣品的測定

按照本方法對市售的嬰幼兒配方乳粉、復(fù)合維生素片、葉酸片樣品進(jìn)行葉酸含量的測定，結(jié)果見表1。從實(shí)際樣品的檢測結(jié)果來看，該方法的靈敏度和準(zhǔn)確度可以滿足實(shí)際測試的需求。

表1 樣品中葉酸的含量

3 結(jié) 論

本文重點(diǎn)探討了堿性溶劑對嬰幼兒配方乳粉和保健食品樣品中葉酸進(jìn)行提取，采用EDTA 溶液配合乙腈進(jìn)行沉淀除雜，比較不同的固相萃取方式的除雜效果、分離度以及靈敏度，確定以混合陰離子交換固相萃取的方式凈化富集，用0.05 mol/L 磷酸鹽溶液（pH4.5）-甲醇（7+3）做流動(dòng)相，鍵合C18 色譜柱分離測定，結(jié)果重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，適合嬰幼兒配方乳粉和保健食品中葉酸含量的生產(chǎn)監(jiān)測和日常監(jiān)管檢測。