高溫強光下外源褪黑素對栝樓雌花生理生化特性的影響

吳 燕，喬曉燕，葛偉強，高青海，*

(1.安徽科技學(xué)院 建筑學(xué)院，安徽 蚌埠 233000； 2.安徽科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

隨著全球氣候的變化，高溫、強光、霜凍等極端天氣頻繁發(fā)生，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成較大影響，其中夏季高溫強光對作物的影響較大[1]。研究表明，高溫強光不僅影響作物生長和生理生化，還影響作物的生殖發(fā)育。此外，高溫強光還顯著降低植物葉綠素代謝水平和光合速率，抑制植物幼苗生長[2-3]。在生產(chǎn)中，花粉是作物結(jié)出果實和種子的先決條件，其活性是作物產(chǎn)量的限制因素，35 ℃高溫條件下蘋果(MaluspumilaMill.)花粉管變粗，不能進入胚珠完成受精[4]。前人研究發(fā)現(xiàn)，40 ℃高溫影響到黃瓜(CucumissativusL.)的授粉受精，果實中幾乎沒有發(fā)育完整的種子[5]。同時，為抵御高溫強光環(huán)境，植物體內(nèi)的抗氧化酶和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的活性也發(fā)生變化。高溫脅迫下，植物體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(APX)等酶活性升高或降低，細胞電解質(zhì)滲漏率、丙二醛含量升高，細胞發(fā)生衰老和死亡[6-7]。

褪黑素(MT)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的吲哚胺類化合物，具有調(diào)節(jié)植物生長、促進種子萌發(fā)、調(diào)節(jié)光周期、調(diào)控根系生長、延緩葉片衰老等生理功能，還能夠緩解逆境脅迫對植物的影響[8]。此外，褪黑素的抗氧化特性賦予它較強的活性氧(ROS)清除能力，在光照、溫度、水分和鹽等脅迫下能提高生物體抗氧化酶的活性[9-10]。

栝樓(TrichosantheskirilowiiMaxim)為葫蘆科栝樓屬多年生攀援草本植物，生長發(fā)育適溫為15～28 ℃。近年來，安徽、江蘇、山東等地種植效益好，種植面積逐年增加。夏季6—8月是栝樓重要的開花坐果期，高溫強光影響到栝樓開花結(jié)果。目前，有關(guān)高溫強光對作物影響的研究多集中在水稻(OryzasativaL.)、棉花(GossypiumhirsutumL.)、玉米(TriticumaestivumL.)等作物上[11]，有關(guān)高溫強光下外源物質(zhì)MT對栝樓雌花生理和發(fā)育的影響鮮見報道。為此，本研究以栝樓為材料，研究高溫強光下，噴施外源MT對栝樓雌花抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、活性氧和坐果率等的影響，為進一步探明高溫強光下外源MT對栝樓的緩解機理奠定基礎(chǔ)，旨在為夏季栝樓高效生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2019年4—9月在安徽省蚌埠清菲農(nóng)業(yè)科技有限公司和安徽科技學(xué)院農(nóng)學(xué)院實驗室進行。供試栝樓品種為皖蔞9號，由蚌埠清菲農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。試驗處理所需褪黑素(melatonin)由美國AgroFresh公司提供。

1.2 處理設(shè)計

選擇地勢平坦、排水灌溉條件良好的地塊進行試驗，土壤礦質(zhì)元素均衡。試驗田位于安徽省蚌埠市曹老集鎮(zhèn)，117°21′E、33°35′N，屬暖溫帶半濕潤季風(fēng)氣候區(qū)。選用2年生的栝樓植株為試驗材料，定植密度為1.5 m×2 m，4月上旬出苗，6月上旬開始開花結(jié)果，采用水肥一體化技術(shù)，按照栝樓生長發(fā)育需求進行定量供給，病蟲害防治按照常規(guī)管理。試驗處理于7月10日進行，選擇長勢一致的栝樓，共設(shè)2個處理，分別為對照(18:00左右噴施清水)和噴施外源MT處理(18:00左右葉面噴施200 μmol·L-1MT)，進行葉片表面噴施，每次噴施以葉片均勻附著1層小水滴為準。每隔2 d噴施1次，共處理4次。每個處理小區(qū)占地24 m2(4 m×6 m)，處理小區(qū)隨機排列，重復(fù)3次。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 生物量的測定

處理20 d統(tǒng)計坐果率，果實直徑達到5 cm以上即為坐住果。坐果率=果實數(shù)/雌花數(shù)。果實充分膨大后隨機采摘測定果實單果重，重復(fù)3次，計算平均值。

1.3.2 栝樓雌花抗氧化酶活性和H2O2含量測定

處理10 d，分別在09:00、11:00、13:00、15:00、17:00取樣全雌花，利用液氮將鮮樣冷凍，然后測定抗氧化酶SOD、POD、CAT和APX的活性，測定方法參照高俊鳳[12]的方法。H2O2含量測定參照高俊鳳[12]的方法，每組處理重復(fù)3次。

1.3.3 可溶性糖和脯氨酸含量測定

處理10 d，分別在09:00、11:00、13:00、15:00、17:00取樣全雌花，并進行栝樓雌花可溶性糖、脯氨酸含量的測定，具體參照高俊鳳[12]的方法。

1.3.4 相對電導(dǎo)率和丙二醛(MDA)含量測定

處理10 d，分別在09:00、11:00、13:00、15:00、17:00取樣全雌花，進行栝樓雌花相對電導(dǎo)率和MDA含量測定，MDA采用硫代巴比妥酸法，具體參照Schmedes等[13]的方法。

1.3.5 花粉萌發(fā)率測定

取完全開放的栝樓雄花，待花粉陰干后播于100 mg·L-1硼酸+250 g·L-1蔗糖+10 g·L-1瓊脂的固體培養(yǎng)基上，25 ℃暗培養(yǎng)4 h，統(tǒng)計花粉萌發(fā)率，具體方法參照文獻[14]。

1.3.6 氣溫和光照強度測量

氣溫和光照強度均采用傳感器測定，氣溫傳感器和光照傳感器安裝在與栝樓雌花同水平的位置，每12 m2安裝1套，共安裝12套，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2017和DPS 6.55軟件進行數(shù)據(jù)分析，對有顯著(P<0.05)差異的處理采用新復(fù)極差法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫強光下溫度和光照強度日變化

夏季高溫強光影響到作物正常生長發(fā)育。由圖1可以看出，2019年7月10日氣溫變化比較平穩(wěn)，均高于28 ℃，14:00氣溫達到41 ℃。光照強度變化幅度較大，13:00光量子通量密度達到1 440 μmol·m-2·s-1(圖1)?？梢钥闯觯募緶囟群凸庹諒姸染鲨闃巧L發(fā)育的適宜需求，說明夏季高溫強光會對栝樓造成一定的逆境脅迫。

2.2 高溫強光下外源MT對栝樓雌花SOD和POD活性的影響

由圖2可以看出，夏季高溫強光下栝樓雌花抗氧化酶活性隨著時間的變化呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。與對照相比，外源MT的施用，可顯著(P<0.05)提高栝樓雌花的SOD和POD活性，在13:00，外源MT處理的栝樓雌花SOD和POD活性分別為140.3、83.5 U·mg-1，分別比對照組高68.02%和90.8%。這說明，夏季高溫強光下，外源MT可顯著提高栝樓雌花SOD和POD的活性。

2.3 高溫強光下外源MT對栝樓雌花CAT和APX活性的影響

無相同字母的表示差異顯著(P<0.05)。下同。Point marked without the same letters indicated significant difference at P<0.05. The same as below.

圖中數(shù)據(jù)以蛋白計。圖3同。Data was detected based on protein. The same as figure 3.

由圖3可以看出，夏季高溫強光條件下，栝樓雌花CAT和APX的活性也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，13:00達到最高值。外源MT處理可顯著(P<0.05)提高CAT和APX的活性，分別比對照提高17.5%和88.9%，這也與氣溫和光照強度的變化趨勢相似。表明在高溫逆境脅迫下，外源MT可以提高栝樓雌花抗氧化酶活性，降低細胞內(nèi)活性氧積累。

2.4 高溫強光下外源MT對栝樓雌花H2O2含量的影響

圖4顯示在夏季高溫強光條件下，栝樓雌花組織內(nèi)H2O2含量與光照強度和氣溫呈正相關(guān)。外源MT處理可顯著(P<0.05)降低栝樓雌花體內(nèi)的H2O2含量，在15:00比對照處理降低了27.5%。由此說明，高溫強光下外源MT處理可以降低栝樓雌花H2O2積累，從而減緩活性氧對雌花的危害。

2.5 高溫強光下外源MT對栝樓雌花相對電導(dǎo)率和丙二醛含量的影響

由圖5可以看出，在夏季高溫強光脅迫下栝樓雌花的相對電導(dǎo)率和丙二醛含量均呈先升高后降低的日變化趨勢，在13:00達到最大值，分別為83.5%和60.2 nmol·g-1。外源MT可以顯著(P<0.05)降低栝樓雌花相對電導(dǎo)率和丙二醛含量，與對照處理相比，分別降低了29.5%和19.9%。由此說明，夏季高溫強光條件下，栝樓雌花細胞膜受到一定程度損害，外源MT可以緩解高溫強光對栝樓雌花的損傷，同時栝樓雌花細胞膜隨外界環(huán)境變化而發(fā)生變化。

圖3 高溫強光下外源MT對栝樓雌花CAT和APX活性的影響Fig.3 Effects of exogenous MT on CAT and APX activities in female flowers of trichosanthes under high temperature and strong light

數(shù)據(jù)以鮮質(zhì)量計。下同。Data was detected based on fresh weight. The same as below.

2.6 高溫強光下外源MT對栝樓雌花脯氨酸和可溶性糖含量的影響

圖6表明，高溫強光下栝樓雌花脯氨酸和可溶性糖含量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，外源MT處理的栝樓雌花脯氨酸含量在11:00達到最大值，為5.82 μg·g-1，比對照顯著(P<0.05)升高了45.5%。外源MT處理不僅提高了栝樓雌花的脯氨酸含量，同時也增加了其可溶性糖含量。11:00栝樓雌花可溶性糖含量達到7.8 g·kg-1，隨著時間的延長，栝樓雌花可溶性糖含量略有下降，變化較平穩(wěn)；對照組的栝樓雌花可溶性糖含量在13:00達到最大值，為6.2 g·kg-1。由此說明，高溫強光下，外源MT處理可以促進栝樓雌花小分子物質(zhì)脯氨酸和可溶性糖積累，增強栝樓雌花的滲透調(diào)節(jié)能力。

圖5 高溫強光下外源MT對栝樓雌花相對電導(dǎo)率和MDA含量的影響Fig.5 Effects of exogenous MT on relative conduction and MDA content in female flowers of trichosanthes under high temperature and strong light

圖6 高溫強光下外源MT對栝樓雌花脯氨酸和可溶性糖含量的影響Fig.6 Effects of exogenous MT on proline and soluble sugar contents in female flowers of trichosanthes under high temperature and strong light

2.7 高溫強光下外源MT對栝樓花粉萌發(fā)率的影響

由圖7可以看出，栝樓花粉萌發(fā)率對高溫強光比較敏感，隨著溫度升高和光照增強，栝樓花粉萌發(fā)率呈現(xiàn)降低趨勢，09:00花粉萌發(fā)率較高。與對照處理相比，外源MT處理可以顯著提高花粉萌發(fā)率，在09:00達到35.5%，對照處理的僅為26.8%。栝樓花粉萌發(fā)率也受到溫度和光照強度日變化的影響，下午盡管溫度和光照強度有所降低，但是花粉萌發(fā)率仍然降低。綜上，高溫強光下外源MT處理可以提高栝樓的花粉萌發(fā)率。

2.8 高溫強光下外源MT對栝樓坐果率和單果鮮質(zhì)量的影響

由圖8可知，高溫強光下栝樓坐果率較低，僅為15.8%，外源MT處理可以顯著(P<0.05)提高栝樓坐果率，使其達到24.9%，與對照相比提高了9.1百分點。高溫強光下外源MT處理不僅促進栝樓坐果，而且提高了果實質(zhì)量，其單果鮮質(zhì)量比對照處理顯著(P<0.05)提高了36.3 g。由此說明，在高溫強光下使用外源MT可以促進栝樓坐果和果實發(fā)育。

圖7 高溫強光下外源MT對栝樓花粉萌發(fā)率的影響Fig.7 Effects of exogenous MT on pollen germination rate of trichosanthes under high temperature and strong light

圖8 高溫強光下外源MT對栝樓坐果率和單果鮮質(zhì)量的影響Fig.8 Effects of exogenous MT on fruit setting rate and single fruit weight of trichosanthes under high temperature and strong light

3 討論

隨著工業(yè)化進程的加快，全球氣溫逐漸變暖，氣溫升高嚴重影響植物的生長發(fā)育[15]。研究表明，氣溫每升高1 ℃，小麥(TriticumaestivumL.)和水稻的產(chǎn)量分別降低4%和10%[16]。相對于生長過程，植物的生殖過程對高溫更為敏感，因此植物的生殖器官更容易受到高溫脅迫的危害[17]。前人研究表明，高溫不僅會降低開花數(shù)量[18]，還會影響到花器官發(fā)育的全過程，導(dǎo)致花粉結(jié)構(gòu)和發(fā)育異常，花粉活性降低或喪失[19]。同種作物不同品種對高溫的響應(yīng)也有差異，耐高溫的水稻品種保持較高的抗氧化酶活性、較低的膜透性和MDA含量，這也是水稻耐高溫的生理基礎(chǔ)[19-20]。

ROS是一類化學(xué)性質(zhì)活躍且具有較高氧化活性的分子，在高溫強光等逆境脅迫下植物體內(nèi)會大量積累。為了應(yīng)對ROS脅迫，植物會提高其抗氧化酶SOD、POD、APX等的活性，清除體內(nèi)ROS，保持體內(nèi)活性氧代謝平衡[21]。本試驗中，夏季高溫強光下栝樓雌花抗氧化酶SOD、POD、CAT、APX活性與溫度和光照強度變化呈正相關(guān)，隨著溫度和光照強度增加均呈現(xiàn)升高趨勢，而后隨著溫度和光照強度的降低呈現(xiàn)下降的趨勢。與對照相比，噴施外源MT可以降低雌花細胞內(nèi)H2O2含量，有效維護細胞膜結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，表現(xiàn)在雌花相對電導(dǎo)率和丙二醛含量降低。這是因為在高溫強光脅迫下外源MT可顯著提高栝樓雌花抗氧化酶SOD、POD、CAT、APX活性，從而加速了細胞內(nèi)活性氧的清理。前人對茄子(CapsicumannuumL.)、黃瓜、甜瓜(SolanummelongenaL.)等作物的研究也有類似的報道[22-24]。

可溶性糖和脯氨酸在植物對高溫等逆境脅迫響應(yīng)中起著重要作用，高溫等逆境脅迫下植物細胞內(nèi)會迅速積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以增強自身的滲透調(diào)節(jié)能力，維持細胞的滲透壓，調(diào)節(jié)細胞的正常生理功能[25-26]。本研究結(jié)果表明，在高溫強光處理下，栝樓雌花的可溶性糖和脯氨酸的含量變化受溫度和光強的日變化影響，呈先升高后降低的變化趨勢。外源MT的施用可以顯著提高栝樓雌花可溶性糖和脯氨酸含量，使?jié)B透調(diào)節(jié)物質(zhì)迅速積累，在11:00栝樓雌花脯氨酸含量達到最大值，為5.82 μg·g-1，比對照提高了45.5%，可有效緩解高溫強光對栝樓雌花組織造成的滲透脅迫。與夏惠等[27]在獼猴桃(ActinidialindL.)上的研究結(jié)果一致。

溫度是影響植物繁殖的重要因子之一，在雌雄配子發(fā)育過程中，溫度脅迫常導(dǎo)致花粉敗育[28-29]。前人研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫降低了水稻結(jié)實率，外源硅處理可提高水稻花粉的萌發(fā)率和結(jié)實率[20]。本研究結(jié)果表明，高溫強光下外源MT不僅顯著提高了栝樓花粉的萌發(fā)率，而且還可以提高栝樓的坐果率，達到24.9%，比對照提高9.1百分點。這是由于夏季高溫強光下，外源MT可以提高栝樓雌花的抗氧化酶活性，促進滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)迅速積累，進而緩解高溫強光對栝樓生殖器官的危害，促進夏季高溫強光條件下栝樓的果實發(fā)育，表現(xiàn)為單果鮮質(zhì)量明顯增大。

夏季溫度和光照對栝樓生殖生長影響較大，尤其是栝樓雌花的生理發(fā)生較大的變化。隨著溫度和光照強度的日變化，栝樓雌花抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。噴施外源MT可以顯著提高栝樓雌花抗氧化酶SOD、POD、CAT和APX的活性，較高的抗氧化酶活性可使植物體及時清除雌花細胞內(nèi)的活性氧，降低細胞內(nèi)的活性氧含量、丙二醛含量和相對電導(dǎo)率，提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，如可溶性糖和脯氨酸的含量，有效維持細胞滲透調(diào)節(jié)平衡，進而提高栝樓花粉萌發(fā)率，促進高溫強光季節(jié)栝樓的坐果和果實的發(fā)育，表現(xiàn)為坐果率和單果鮮質(zhì)量顯著提高。