不同菌株發(fā)酵枸杞汁中生物活性物質(zhì)與香氣組成物質(zhì)含量變化

劉予煊，程 煥，葉興乾，劉慧燕，方海田，*

(1.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021； 2.浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，智能食品加工技術(shù)與裝備國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310058)

枸杞(LyciumbarbarumL.)又名枸杞豆、枸杞子，是藥食同源的植物資源，在我國(guó)主要分布于寧夏、新疆等地。枸杞含類胡蘿卜素、多糖、黃酮、氨基酸等多種營(yíng)養(yǎng)成分，具有降血糖、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等作用[1-2]，但僅通過(guò)泡、煮的方法食用，大多數(shù)有效成分不能被完全提取利用，因此枸杞精加工成為人們研究的重點(diǎn)。目前，關(guān)于枸杞精加工的研究主要有2大類：一類是對(duì)枸杞中的有效成分如枸杞多糖、類胡蘿卜素等進(jìn)行提取，開發(fā)成功能食品或輔料，但這類制品生產(chǎn)工藝復(fù)雜且成本較高，在人群中不能被廣泛食用；另一類是利用生物技術(shù)發(fā)酵枸杞，如枸杞酒[3]、枸杞酸奶[4]和復(fù)合枸杞汁[5]，這些產(chǎn)品飲用方便，有望成為新的研究方向。但相關(guān)研究主要集中在工藝優(yōu)化方面，并且所用的菌株種類比較單一，未研究不同菌種在枸杞中的發(fā)酵能力。

發(fā)酵法生產(chǎn)果蔬制品已有大量研究，果酒和果醋歷史久遠(yuǎn)，風(fēng)味獨(dú)特。近年來(lái)，隨著對(duì)生物活性物質(zhì)作用認(rèn)識(shí)的提高，果蔬酵素逐漸受到重視。有研究發(fā)現(xiàn)，菌種在發(fā)酵過(guò)程中生成的代謝產(chǎn)物具有促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收、改善胃腸道功能、降低膽固醇、提高免疫力等生理作用[6-7]，菌株發(fā)酵不僅能改善原料的不良風(fēng)味，還能產(chǎn)生新的活性物質(zhì)，如酵素食品的功能就主要基于眾多菌株代謝來(lái)發(fā)揮作用[8]，但酵素中的菌株在枸杞發(fā)酵上的利用比較少，如果能將其分離并應(yīng)用于枸杞發(fā)酵，不僅能增加枸杞發(fā)酵用的菌株種類，拓展枸杞產(chǎn)品市場(chǎng)，也可為酵素菌在食品中的開發(fā)提供新思路。

本研究以寧夏枸杞為原料，采用從酵素食品中分離出的4種菌株分別發(fā)酵枸杞汁，分析不同菌株發(fā)酵枸杞汁后的產(chǎn)品特性，選出枸杞汁發(fā)酵后感官品質(zhì)與代謝產(chǎn)物較好的菌種，以期為枸杞發(fā)酵功能產(chǎn)品的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞干果，寧夏中寧市售(2018年)；環(huán)己酮(色譜純)、蘆丁、沒(méi)食子酸、實(shí)驗(yàn)室常規(guī)試劑(分析純)，北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司；正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品(C8-C20)，Sigma-Aldrich公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌種

由自然發(fā)酵的水果酵素食品中分離得到，測(cè)定各菌種堿基序列并與NCBI網(wǎng)站中的核酸序列進(jìn)行Blast比對(duì)，同源性均達(dá)到99%以上，確定分離菌種分別為羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri，LRE)、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus，LRH)、巴達(dá)維亞芽孢桿菌(Bacillusbataviensis，BBS)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis，BLS)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；LRH-250生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SHJ-6AB磁力攪拌水浴鍋，常州金壇良友儀器有限公司；1510全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，芬蘭Thermo Fisher Scientific Oy Ratastie；Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司；PB-LO pH計(jì)，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；打漿機(jī)，美的集團(tuán)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 發(fā)酵基液制備

將干枸杞?jīng)_洗干凈，純水與干枸杞的質(zhì)量比為5∶1，加入枸杞質(zhì)量0.5%的異抗壞血酸鈉護(hù)色，浸泡6 h并打漿，用4層紗布過(guò)濾除籽后，加入5%的白砂糖，用小蘇打調(diào)pH值至6.5，分裝于玻璃瓶中，每瓶100 mL，用紗布球封口，巴氏殺菌后備用[9]。

1.4.2 枸杞汁發(fā)酵

將菌種充分活化后，挑選單菌落接至液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h。向1.4.1節(jié)制備的發(fā)酵基液(100 mL)中分別接入培養(yǎng)好的羅伊氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、巴達(dá)維亞芽胞桿菌、地衣芽孢桿菌，接種量為發(fā)酵基液體積的0.3%；以1.4.1節(jié)中制備好的發(fā)酵基液為空白對(duì)照組(CK)，每個(gè)處理重復(fù)3次。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵22 h。取樣待測(cè)。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 黃酮含量

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法[10]測(cè)定。取發(fā)酵的枸杞汁0.3 mL，加入0.2 mL 30%乙醇，加入0.2 mL 5%亞硝酸鈉，搖勻靜置6 min后，加入0.2 mL 10%硝酸鋁，搖勻靜置6 min后，加入2.0 mL 4%氫氧化鈉，混勻后靜置15 min。于510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品按相同方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 蛋白質(zhì)含量

使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定。將枸杞發(fā)酵樣品離心后，將上清液稀釋10倍，按照試劑盒說(shuō)明書操作：取稀釋后的樣品2 μL于96孔板中，用水補(bǔ)至20 μL，加入200 μL的BCA工作液，于37 ℃恒溫反應(yīng)30 min，用酶標(biāo)儀于562 nm處測(cè)定吸光度。

1.5.3 總酚含量

采用福林酚法[11]測(cè)定。取經(jīng)離心后適當(dāng)稀釋的枸杞汁0.15 mL，加入0.45 mL的水、0.15 mL按照1∶1稀釋的福林酚試劑，混勻后反應(yīng)6 min，加入0.60 mL 75 g·L-1的碳酸鈉溶液，室溫避光2 h后于760 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品按相同方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.4 pH

使用pH計(jì)直接測(cè)定。

1.5.5 感官評(píng)定

由6名食品相關(guān)專業(yè)人員組成評(píng)定小組，對(duì)發(fā)酵樣品的色澤、口感、風(fēng)味進(jìn)行感官評(píng)定，樣品采用3位數(shù)隨機(jī)編碼，每個(gè)樣品間隔時(shí)間為2 min，清水漱口，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

1.5.6 揮發(fā)性成分

參照文獻(xiàn)[12]的方法并優(yōu)化測(cè)定條件。取3 g發(fā)酵液于15 mL固相微萃取小瓶中，加入0.75 g氯化鈉，加入2 μL環(huán)己酮溶液(0.25 mg·g-1)做內(nèi)標(biāo)物，50 ℃水浴加熱平衡15 min，插入萃取頭(DVB/CAR/PDMS)頂空吸附30 min后，將萃取頭插入氣相色譜儀進(jìn)樣口，240 ℃解吸3 min。毛細(xì)管柱為DB-5柱(30 cm×250 μm×0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度240 ℃，以高純氦氣(99.999%)為載氣，恒定流速1.4 mL·min-1。柱溫箱升溫程序：初始溫度50 ℃保持2 min，以5 ℃·min-1升至180 ℃保持1 min，10 ℃·min-1升至260 ℃。定性通過(guò)NIST 14譜庫(kù)檢索，結(jié)合保留指數(shù)與文獻(xiàn)進(jìn)行定性，采用內(nèi)標(biāo)法定量。

表1 發(fā)酵枸杞汁感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

Table1Standard of sensory evaluation for fermented goji juice

項(xiàng)目Item評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Standard評(píng)分Score色澤(25分)Color(25 Score)橘紅色,無(wú)分層,無(wú)沉淀Orange to red, no stratification and precipitation暗紅色,分層不明顯,有少量沉淀Dark red, insignificant stratification and slight precipitation紅褐色,分層明顯Reddish～brown with obvious stratification17～259～16≤8口感(25分)Taste(25 Score)酸甜適中Moderate sweet and sour酸味淡,甜味重Light sour, heavy sweet酸味重,無(wú)甜味Heavy sour, no sweet17～259～16≤8 枸杞特有香味明顯,有特殊發(fā)酵香氣,無(wú)苦澀感,無(wú)異味It had obvious special flavor of goji berry and special fermented aroma, without bitternessand disgusting odor枸杞特有香味較明顯,特殊發(fā)酵香氣較淡,有些許苦澀感和異味It had some special flavor of goji berry and slight fermented aroma, with slight bitternessand disgusting odor枸杞特有香味不明顯,無(wú)特殊發(fā)酵香氣,苦澀感較重,異味重It had insignificant special flavor of goji berry and no fermented aroma, with heavy bitternessand disgusting odor17～259～16≤8喜愛(ài)程度(25分)Degree of preference(25 Score)非常喜歡Very like比較喜歡Moderate like不太喜歡Moderate dislike非常不喜歡Very dislike19～2512～186～11≤5

1.6 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 20.0的LSD法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)；用GraphPad Prism 8.0.1軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌種發(fā)酵果汁品質(zhì)指標(biāo)分析

由表2可以看出，枸杞汁經(jīng)4種菌發(fā)酵后黃酮含量顯著升高，且4個(gè)菌株處理間差異較小，LRH、BBS、BLS、LRE發(fā)酵枸杞汁中的黃酮含量分別為枸杞原汁(CK)的1.29、1.23、1.31、1.29倍。Markkinen等[13]用凝結(jié)芽孢桿菌、植物乳桿菌等發(fā)酵果汁后黃酮類物質(zhì)含量趨于下降，而本研究中4個(gè)菌株發(fā)酵后枸杞汁中的黃酮類物質(zhì)均有增加，說(shuō)明不同菌種對(duì)該類物質(zhì)的代謝作用存在差異，本研究中所用的4株菌能促使枸杞汁中的黃酮類物質(zhì)游離出來(lái)。

各組發(fā)酵液間蛋白質(zhì)含量差異極顯著，經(jīng)LRE發(fā)酵后蛋白質(zhì)明顯增加，為CK的1.53倍，可能與該菌株在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的酶類物質(zhì)有關(guān)[14]。其他菌種發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)含量較CK都有不同程度的降低，蛋白質(zhì)含量依次為BBS[(168.11±1.00) μg·mL-1]

BBS發(fā)酵液中游離酚總含量最高并顯著高于CK，分別為L(zhǎng)RH、BLS、LRE總酚含量的1.37、1.10、3.01倍，與Sulieman等[16]得到的發(fā)酵可釋放或產(chǎn)生酚類化合物的結(jié)果一致。與對(duì)照組相比，BBS發(fā)酵提高了枸杞汁的游離酚總含量，但其他菌株發(fā)酵均降低了枸杞汁中的游離酚含量，這與各菌種對(duì)酚類物質(zhì)的代謝過(guò)程有直接關(guān)系，BBS的某些代謝產(chǎn)物可能使被包裹的某些酚類物質(zhì)游離出來(lái)，從而使發(fā)酵液中總酚含量增加。

枸杞汁經(jīng)4種菌發(fā)酵后pH值差異較小，為4.6～4.8，說(shuō)明4種菌產(chǎn)酸能力相差不大。枸杞汁經(jīng)過(guò)發(fā)酵后，感官評(píng)分均有提高，說(shuō)明發(fā)酵后的枸杞汁味道更好，其中BBS發(fā)酵液的感官評(píng)分最高，與其他菌種發(fā)酵的枸杞汁差異顯著。

綜合來(lái)看，與原汁相比，LRH發(fā)酵后蛋白質(zhì)含量降低程度不大，總酚含量明顯降低，感官評(píng)價(jià)較差。楊紅梅[17]將LRH同其他菌株配合使用，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵效果有所提升，之后可嘗試與其他菌復(fù)配使用。BBS發(fā)酵后蛋白質(zhì)含量顯著降低，總酚含量顯著提高，感官評(píng)價(jià)較好。BLS發(fā)酵后蛋白質(zhì)和總酚含量下降，感官評(píng)價(jià)低于BBS。LRE發(fā)酵后蛋白質(zhì)含量顯著提升，總酚含量明顯下降，產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，感官評(píng)分較低。

表2 不同菌種發(fā)酵枸杞汁各類品質(zhì)指標(biāo)

Table2Various quality indicators of fermented goji juices of different strains

處理Treatment黃酮Flavonoid/(mg·mL-1)蛋白質(zhì)Protein/(μg·mL-1)總酚Total phenol/(mg·mL-1)pH感官評(píng)分Sensory scoreCK0.35±0.01 c392.33±6.67 b5.30±0.07 b6.46±0.01 a65.17±2.86 dLRH0.45±0.03 ab343.21±2.09 c4.00±0.08 c4.72±0.06 bc69.83±2.64 cBBS0.43±0.01 b168.11±1.00 d5.48±0.13 a4.80±0.07 b89.83±1.72 aBLS0.46±0.02 a269.69±0.58 c4.96±0.03 b4.76±0.07 b75.50±2.26 bLRE0.45±0.01 ab599.50±1.53 a1.82±0.03 d4.63±0.04 c72.67±2.50 c

同列數(shù)據(jù)后無(wú)相同字母表示差異顯著(P<0.05)(n=3)。CK表示對(duì)照組，LRH、BBS、BLS、LRE分別表示經(jīng)L.rhamnosus、B.bataviensis、B.licheniformis、L.reuteri發(fā)酵的枸杞汁。

Data marked without the same letter in the same line indicated significant differences atP<0.05 (n=3). CK indicated control group， LRH， BBS， BLS， and LRE represent goji juice fermented byL.rhamnosus，B.bataviensis，B.licheniformis andL.reuteri， respectively. The same as below.

2.2 不同菌種發(fā)酵枸杞汁中揮發(fā)性物質(zhì)分析

如表3所示，在不同菌種發(fā)酵的樣品中，共檢測(cè)到52個(gè)揮發(fā)性化合物，其中醛類9個(gè)、醇類9個(gè)、酯類7個(gè)、萜烯類3個(gè)、酸類6個(gè)、酮類12個(gè)、酚類3個(gè)，其他類3個(gè)。枸杞原汁(CK)和LRH、BBS、BLS、LRE發(fā)酵果汁中分別檢出揮發(fā)性成分27、37、37、36、38個(gè)，各菌種發(fā)酵液所含種類明顯多于對(duì)照組，說(shuō)明發(fā)酵過(guò)程明顯增加了揮發(fā)性成分的種類。發(fā)酵后的枸杞汁風(fēng)味更豐富，這與微生物代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸和小分子肽有關(guān)[18]。枸杞中含有特殊的苦味，含硫化合物一般呈現(xiàn)出苦味[19]，但本次研究中未檢測(cè)到硫化物，可能是因?yàn)榭辔段镔|(zhì)存在于枸杞籽中，打漿過(guò)程未將其破碎。

表3 各菌種發(fā)酵枸杞汁中揮發(fā)性物質(zhì)種類與含量

Table3Types and contents of volatile substances in fermented goji juices by various strains

序號(hào)No.揮發(fā)性成分Volatilesubstances化學(xué)式Chemicalformula保留時(shí)間Time/min保留指數(shù)RIcal.ref.樣品含量Sample content/(μg·g-1)CKLRHBBSBLSLRE醛類AldehydeA1正己醛 HexanalC6H12O4.81<800<800[20]0.06±0.01—0.01±00.05±0.010.03±0.01A2(E)-2-庚烯醛 (E)-2-HeptenalC7H12O8.86952 967[21]——0.01±00.03±00.02±0.01A3苯甲醛 BenzaldehydeC7H6O9.03959 960[19]0.05±00.04±0.010.02±00.07±00.08±0A4(E,E)-2,4-己二烯醛C6H8O10.481011 1011[19]0.03±0—0.01±00.05±0—(E,E)-2,4-HeptadienalA5苯乙醛 BenzeneacetaldehydeC8H8O11.471044 1061[21]0.02±00.06±0.010.03±00.13±0.010.12±0.01A6反式-2-壬烯醛 (E)-2-NonenalC9H16O14.911162 1160[19]0.08±0.010.09±0.010.03±00.11±0.010.06±0.02A72,4-二甲基-苯甲醛C9H10O15.361177 NG0.33±0.05—0.02±0—0.04±02,4-Dimethyl-benzaldehydeA82,6,6-三甲基-1,3-環(huán)己二烯-1-甲醛C10H14O16.091202 NG0.11±0.010.08±0.020.04±00.13±0.010.10±0.012,6,6-Trimethyl-1,3-cyclohexadiene-1-carboxaldehydeA9(E,E)-2,4-癸二烯醛C10H16O19.351321 NG0.12±0——0.19±0.02—(E,E)-2,4-Decadienal醇類Alcohol B1正己醇 1-HexanolC6H14O6.41855 851[19]————0.05±0B21-辛烯-3-醇 1-Octen-3-olC8H16O9.55978 982[19]0.08±0.01———0.06±0B3苯甲醇 Benzyl alcoholC7H8O11.171034 1030[22]0.12±00.14±0.010.07±0.010.28±00.15±0B45-乙基環(huán)戊-1-烯基-甲醇C8H14O12.411076 NG————0.02±05-Ethylcyclopent-1-enyl-methanolB5芳樟醇 3,7-Dimethyl-1,6-octadien-3-olC10H18O13.141101 1102[23]—0.24±0.060.13±0.020.56±0.010.22±0.05B6苯乙醇 Phenylethyl alcoholC8H10O13.521114 1136[24]0.10±00.08±00.04±00.13±0.020.34±0.07B7(E)-2-壬烯-1-醇 (E)-2-Nonen-1-olC9H18O15.101168 NG—0.04±0.010.02±00.07±00.06±0.01B8D-薄荷醇C10H20O15.481181 1179[23]————0.03±0.01D-5-Methyl-2-(1-methylethyl)-cyclohexanolB9香葉醇 GeraniolC10H18O17.521254 1248[22]0.03±00.06±0.010.03±0—0.04±0.01酯類Ester C1N-羥基苯甲酰亞胺酸甲酯C8H9NO27.25892 NG0.04±0——0.11±00.07±0.04N-Methoxy-phenyl-oximeC2亞硫酸壬基戊酯C14H30O3S12.961095 NG——0.03±0—0.05±0Sulfurous acid, nonyl pentyl esterC32,2,2-三氯乙基環(huán)丙烷羧酸酯C6H7Cl3O218.171277 NG—0.08±0.03———Cyclopropanecarboxylic acid,2,2,2-trichloroethyl esterC42,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二異丁酸酯C16H30O426.041589 NG0.04±00.04±0———2,2,4-Trimethyl-1,3-pentanediol diisobutyrateC5鄰苯二甲酸異丁基壬基酯C21H32O431.771863 NG—0.18±0.040.02±00.06±00.03±0Phthalic acid, isobutyl nonyl esterC6十六烷酸甲酯C17H34O232.771928 1923[22]—0.04±0.020.01±00.07±0.01—Hexadecanoic acid, methyl esterC7十六烷酸乙酯C18H36O233.681994 NG0.04±0.010.06±0.010.02±00.05±0—Hexadecanoic acid, ethyl ester

續(xù)表3 Continued Table 3

cal.，計(jì)算所得的保留指數(shù)；ref.，文獻(xiàn)中的保留指數(shù)：表中數(shù)字上標(biāo)為參考文獻(xiàn)序號(hào)?！啊北硎疚礄z出，“NG”表示文獻(xiàn)中未涉及相應(yīng)的保留指數(shù)。

The “cal.” meant calculated retention index (RI); The “ref.” meant RI from the reference. The superscript numbers were order number of references. The “—” meant not detected; The “NG” meant not involved in references.

2.2.1 醛類

共檢測(cè)到9個(gè)醛類物質(zhì)，CK中2，4-二甲基-苯甲醛含量最高，占其醛類總量的41.2%，該物質(zhì)具有杏仁味，遇酸易分解[27]，其含量經(jīng)發(fā)酵后明顯降低或未檢出，可能是因?yàn)榘l(fā)酵產(chǎn)生有機(jī)酸使該物質(zhì)轉(zhuǎn)化或分解；BBS發(fā)酵液中醛類物質(zhì)的種類較多，但含量都少于0.05 μg·g-1；BLS發(fā)酵液中(E，E)-2，4-癸二烯醛含量最多，占其醛類總量的25.0%，其特征風(fēng)味為炸土豆香[28]，該物質(zhì)可能對(duì)枸杞汁風(fēng)味有正影響。

2.2.2 醇類

醇類物質(zhì)是花草香氣的主要來(lái)源組分[29]，該組分在枸杞汁中共檢測(cè)到9個(gè)，CK中醇類物質(zhì)僅有3個(gè)，LRE發(fā)酵液所含醇類物質(zhì)的種類最豐富，正己醇、5-乙基環(huán)戊-1-烯基-甲醇和D-薄荷醇是其特有的醇類化合物，但含量較少，僅占其醇類總量的9.0%。芳樟醇和(E)-2-壬烯-1-醇是各菌株發(fā)酵液中共有而CK中沒(méi)有的醇類物質(zhì)，其中芳樟醇在LRH、BBS、BLS、LRE發(fā)酵液中的含量均較高，分別占其醇類總量的42.1%、41.9%、47.9%、21.8%。Lu等[24]發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)主要在發(fā)酵過(guò)程中形成，表現(xiàn)出花香[30]。另外，各發(fā)酵組均含有苯乙醇，該物質(zhì)的產(chǎn)生與菌種發(fā)酵中蛋白質(zhì)水解有關(guān)，并可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成苯乙醛[31]，表現(xiàn)出果香[32]，這2種揮發(fā)性物質(zhì)多次被證明是發(fā)酵果汁中的主要香氣貢獻(xiàn)成分[33]。

2.2.3 酯類

酯類物質(zhì)是果香的主要來(lái)源組分[26]，該組分在枸杞汁中共檢測(cè)到7個(gè)，鄰苯二甲酸異丁基壬基酯是各菌株發(fā)酵液中共有但在CK中沒(méi)有的組分。2，2，2-三氯乙基環(huán)丙烷羧酸酯是LRH中特有的酯類組分，占其酯類總量的20.0%；N-羥基苯甲酰亞胺酸甲酯是BLS中含量最高的酯類物質(zhì)，占其酯類總量的37.9%。本研究中酯類物質(zhì)含量較少，且各樣品中共有的酯類成分較少，可能與枸杞本身果香味不足有直接關(guān)系。

2.2.4 萜烯類

僅檢測(cè)到3個(gè)萜烯類物質(zhì)，在CK中未檢出，(Z)-3-乙基-2-甲基-1，3-己二烯是4種不同菌株發(fā)酵液中共有組分，在BLS發(fā)酵液中含量最高，占其萜烯類總量的72.0%；LRE發(fā)酵液中特有的組分是3，5，5-三甲基-環(huán)己烯，但含量?jī)H有0.05 μg·g-1，顯著低于(Z)-3-乙基-2-甲基-1，3-己二烯。

2.2.5 酸類

酸類物質(zhì)共檢測(cè)到6種，該類物質(zhì)對(duì)發(fā)酵枸杞汁風(fēng)味貢獻(xiàn)較大，如圖1所示，總體來(lái)看，除BBS處理外，酸類物質(zhì)含量與感官評(píng)分呈正相關(guān)趨勢(shì)。甲酸是各組的共有組分，且含量較高，分別占酸類總量的92.8%、49.7%、68.4%、55.7%、61.6%。甲酸具有強(qiáng)烈的刺激性氣味，經(jīng)發(fā)酵后其含量占比明顯減少，說(shuō)明發(fā)酵可改善枸杞汁中的刺激性氣味。醋酸、己酸、辛酸是各菌種發(fā)酵液的共有組分。己酸表現(xiàn)出令人不快的汗臭味[34]。與其他3組相比，甲酸和己酸在BBS中的含量較低，感官評(píng)分較高，因此推測(cè)以上2種酸類化合物對(duì)發(fā)酵枸杞汁的感官評(píng)定有負(fù)影響。庚酸是LRH發(fā)酵液中的特有組分，但含量較少，僅占酸類總量的5%。除LRE處理外，其他樣品中均含有正十六烷酸，與其他酸類組分相比含量相對(duì)較高，但正十六烷酸無(wú)明顯嗅感，閾值高從而限制了它對(duì)發(fā)酵枸杞汁香氣的貢獻(xiàn)。

2.2.6 酮類

共檢測(cè)到12個(gè)酮類物質(zhì)，各樣品中共有的反式-β-紫羅蘭酮含量最高，分別占酮類總量的41.4%、30.8%、31.4%、34.4%、31.7%。6-甲基-3，5-庚二烯-2-酮是CK中沒(méi)有而其他發(fā)酵組中共有的組分，在BLS中含量最高，是LRH、BBS、LRE的1.86、3.25、1.63倍，該物質(zhì)是類胡蘿卜素降解產(chǎn)物，表現(xiàn)出果香[35]，該物質(zhì)的產(chǎn)生與催化類胡蘿卜素降解的酶有關(guān)[36]，故推測(cè)實(shí)驗(yàn)所用4株菌株在發(fā)酵過(guò)程中均會(huì)產(chǎn)生這類酶。2，3-丁二酮、1-[4-(1-甲基-2-丙烯基)苯基]-乙酮是LRH發(fā)酵液的特有組分，占其酮類總量的12.8%，其中2，3-丁二酮可通過(guò)二乙酰還原酶轉(zhuǎn)化成3-羥基丁-2-酮[25]，而3-羥基丁-2-酮在BBS和BLS發(fā)酵液中存在，可能是這2株菌會(huì)產(chǎn)生二乙酰還原酶使2，3-丁二酮轉(zhuǎn)化，而在LRH發(fā)酵過(guò)程中沒(méi)有這種酶產(chǎn)生。

CK表示對(duì)照組;LRH、BBS、BLS、LRE分別表示經(jīng)L. rhamnosus、B. bataviensis、B. licheniformis、L. reuteri發(fā)酵的枸杞汁。下同。CK indicated control group; LRH， BBS， BLS， and LRE represent goji juice fermented by L. rhamnosus， B. bataviensis， B. licheniformis and L. reuteri， respectively. The same as below.

2.2.7 酚類

揮發(fā)性酚共檢測(cè)到3個(gè)，在CK中共檢測(cè)到1個(gè)組分，也是各組共有的組分。4-乙烯基愈創(chuàng)木酚是含量最高的揮發(fā)性酚類組分，枸杞汁經(jīng)發(fā)酵后該物質(zhì)含量升高，在各發(fā)酵樣品中分別占酚類總量的80.9%、84.3%、87.3%、73.5%，該物質(zhì)具有花香和煙草香[37]。如圖2所示，雖然在BBS中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚含量不高而感官評(píng)分高，但與其占比看，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚與感官評(píng)分呈正相關(guān)趨勢(shì)，說(shuō)明該物質(zhì)對(duì)枸杞汁的風(fēng)味呈現(xiàn)正影響，與該物質(zhì)提高枸杞酒香味的作用相似[38]。

2.2.8 其他

共檢測(cè)到3種其他揮發(fā)性化合物，其中，2-戊基呋喃的含量在發(fā)酵后增加了0.75～5.25倍，該物質(zhì)是脂肪酸的氧化產(chǎn)物[39]，有花果香、焙烤香，且香味閾值極低[40]，對(duì)發(fā)酵枸杞汁的風(fēng)味可能有較大影響。

圖2 感官評(píng)分與4-乙烯基愈創(chuàng)木酚含量對(duì)比Fig.2 Comparison of sensory scores with content of 2-Methoxy-4-vinylphenol

2.2.9 各類揮發(fā)性組分含量分析

各類揮發(fā)性物質(zhì)含量如圖3所示，4個(gè)菌種發(fā)酵液均由7大類組成，各組樣品間差異顯著。CK和BLS中醛類物質(zhì)含量顯著高于其他3組，CK和BBS中醇類物質(zhì)含量顯著低于其他3組，LRH和BLS中酯類物質(zhì)含量顯著高于其他組。CK中未檢測(cè)到萜烯類化合物，在各菌種發(fā)酵后，萜烯類化合物含量依次為BLS[(0.25±0.01) μg·g-1]>LRE[(0.18±0) μg·g-1]>LRH[(0.12±0.01) μg·g-1]>BBS[(0.09±0.02) μg·g-1]。LRH、BLS中酸類物質(zhì)含量顯著高于其他組，是其他組的2.01～2.68倍，酸類物質(zhì)對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)主要體現(xiàn)在滋味上。BLS中酮類物質(zhì)含量最高，分別是CK、LRH、BBS、LER的2.60、1.66、4.31、2.40倍。枸杞汁經(jīng)發(fā)酵后揮發(fā)性酚類物質(zhì)含量顯著增加，LRH、BBS、BLS、LRE發(fā)酵液中揮發(fā)性酚較CK分別增加了7.9、4.1、20.3、3.9倍。CK中其他類物質(zhì)含量顯著低于各發(fā)酵組，LRH、BBS、BLS、LRE發(fā)酵枸杞汁中其他類物質(zhì)含量分別為CK的3.50、3.00、8.63、2.25倍。

LRH的酸類物質(zhì)含量較高，發(fā)酵風(fēng)味最明顯。BBS中風(fēng)味物質(zhì)含量均不高，可能是其風(fēng)味柔和的原因。BLS中各類風(fēng)味物質(zhì)含量較高，某些呈味能力強(qiáng)的物質(zhì)就會(huì)表現(xiàn)得過(guò)于突出。LRE的醇類物質(zhì)含量較高，使其刺激性氣味增加。比較各菌種發(fā)酵的風(fēng)味特性，對(duì)這些菌種在食品發(fā)酵和生產(chǎn)中的應(yīng)用有一定的指導(dǎo)性意義，但僅通過(guò)含量不能完全確定發(fā)酵枸杞汁中的主要呈香物質(zhì)，還需通過(guò)嗅聞儀、電子鼻等分析手段輔助驗(yàn)證[19，41]。

圖3 各菌種發(fā)酵枸杞汁中各類揮發(fā)性物質(zhì)總含量Fig.3 Total volatile contents in goji juices fermented by various strains

3 結(jié)論

枸杞汁經(jīng)過(guò)不同益生菌發(fā)酵后，黃酮含量均有顯著增加，同時(shí)揮發(fā)性物質(zhì)種類增加，發(fā)酵風(fēng)味濃厚。其中，鼠李糖乳桿菌發(fā)酵后各指標(biāo)較其他組均無(wú)明顯優(yōu)勢(shì)，地衣芽孢桿菌發(fā)酵液中揮發(fā)性物質(zhì)含量最高但整體風(fēng)味不優(yōu)，這2株菌發(fā)酵枸杞汁的效果不突出。羅伊氏乳桿菌發(fā)酵速度快，產(chǎn)生的酸類物質(zhì)含量較高，發(fā)酵后品質(zhì)指標(biāo)劣于未發(fā)酵枸杞汁，可以與其他菌種復(fù)配使用。巴達(dá)維亞芽胞桿菌發(fā)酵后品質(zhì)指標(biāo)和感官評(píng)價(jià)優(yōu)于對(duì)照組，發(fā)酵的枸杞汁風(fēng)味柔和，酸度適中，并有其他菌株發(fā)酵后沒(méi)有的淡奶香，適宜用于枸杞發(fā)酵。