銅藻巖藻黃素提取及純化工藝研究

李紅艷， 王穎*， 劉天紅， 姜曉東， 李曉， 孫元芹， 紀(jì)蕾， 唐歡歡

1. 山東省海洋生物研究院，山東 青島 266104；2. 山東省大型海藻資源保護(hù)與應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，山東 青島 266104

巖藻黃素(fucoxanthin)又稱巖藻黃質(zhì)、褐藻素，是一種類胡蘿卜素，廣泛存在于藻類、海洋浮游植物和水生貝殼類動物等海洋生物組織中[1]，尤以褐藻和硅藻中含量最為豐富[2]。國內(nèi)外許多研究表明，巖藻黃素具有多種生物學(xué)活性，包括抗炎、抗肥胖、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)血糖含量以及保護(hù)皮膚和腦血管等[3-9]，因此，其在保健品、護(hù)膚美容和醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

銅藻(Sargassumhorneri)，屬褐藻門(Phaeophyta)、圓子綱(Cyclosporeae)、墨角藻目(Fucales)、馬尾藻科(Sargassaceae)，又名丁香屋、草茜、竹茜菜，是北太平洋西部特有的暖溫帶淺海區(qū)海藻。銅藻具有較高的生態(tài)價值，是藻床重建、淺海生態(tài)修復(fù)的重要物種之一，可為魚、貝類等提供繁育場所[10]。銅藻富含膳食纖維、褐藻糖膠、褐藻淀粉、褐藻膠、多酚等活性物質(zhì)[11-12]，在食品、飼料、有機(jī)肥料、藻膠工業(yè)和醫(yī)藥等行業(yè)具有良好的應(yīng)用前景，經(jīng)濟(jì)價值較高。銅藻中巖藻黃素含量較高[12]，但是國內(nèi)目前提取巖藻黃素多采用海帶、羊棲菜、裙帶菜、鼠尾藻等[13-15]，對以銅藻為原料提取巖藻黃素的研究較少[16-19]，且以銅藻鮮藻作為原料進(jìn)行提取的報道更為少見[20]。巖藻黃素的提取多采用超聲輔助有機(jī)溶劑法、超臨界CO2法等，提取率一般為0.37～0.83 mg·g-1DW[13-19]，提取率相對較低；純化多采用硅膠柱層析法，純度最高可達(dá)80%以上[14,21]，但缺乏對更高純度巖藻黃素的研究報道。基于此，本研究以銅藻鮮藻為原料，利用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，并對巖藻黃素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，隨后采用硅膠柱層析法進(jìn)行純化，并對硅膠柱床高度、上樣量和洗脫流速進(jìn)行優(yōu)化，最后采用制備液相法對經(jīng)層析純化的巖藻黃素進(jìn)一步純化，以期為銅藻資源的開發(fā)利用提供新方向，并為高純度巖藻黃素的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用銅藻于2018年5月采自山東省威海市榮成市俚島灣海域，用過濾海水洗刷干凈，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩r藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma公司；甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正己烷均為國產(chǎn)分析純；制備液相純化所用的甲醇和液相色譜檢測所用的乙腈均為色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津儀器公司)；Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)(美國密理博公司)；FA1 604 N電子分析天平(上海精密儀器有限公司)；DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司)；BUCHI C-605梯度快速色譜系統(tǒng)(層析柱15 mm×230 mm)(瑞士步琦公司)；1260Infinity制備液相色譜儀器(色譜柱Agilent Prep C18 Column 30 mm×100 mm，10 μm)(美國安捷倫公司)。

1.3 樣品處理

將凍存的銅藻自然解凍，濾紙吸取其表面水分，剪碎后用多功能粉碎機(jī)破碎至長度約3～5 mm。另外，根據(jù)《GB5009.3-2016食品中水分的測定》[22]第一法直接干燥法測定銅藻的水分含量，以便后續(xù)將巖藻黃素提取率、得率由鮮重計算折合為干重，具體按照下式進(jìn)行計算：

(1)

1.4 巖藻黃素粗提液制備

稱量3 g處理過的銅藻鮮藻，加入提取溶劑，再加入轉(zhuǎn)子，密封后包裹錫箔紙避光，磁力攪拌，恒溫水浴提取一定時間，過濾，留取濾液為巖藻黃素粗提液，待硅膠柱層析分離。按照以下公式計算提取率：

(2)

從提取的工藝流程可以看出，提取溶劑及其濃度、料液比、提取時間和提取溫度對于巖藻黃素提取率至關(guān)重要，因此，對上述因素進(jìn)行單因素實驗和正交實驗，以確定最佳工藝參數(shù)。

1.4.1單因素實驗 采用單因素實驗對提取溶劑及其濃度、料液比、提取時間和提取溫度等因素進(jìn)行考察。提取所用的有機(jī)溶劑為：甲醇、乙醇、正己烷、石油醚、乙酸乙酯；最適有機(jī)溶劑的濃度水平設(shè)置為：60%、70%、80%、90%、100%；料液比水平設(shè)置為：1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25；提取時間水平設(shè)置為：1、2、3、4 h；提取溫度水平設(shè)置為：35、40、45、50、55、60 ℃。過濾后按公式(2)計算巖藻黃素提取率，考察各因素的不同水平對巖藻黃素提取率的影響。

1.4.2正交實驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以最適有機(jī)溶劑的濃度、提取時間、提取溫度、料液比為因素，以巖藻黃素提取率為考察指標(biāo)，采用L9(34)正交表對巖藻黃素提取條件進(jìn)行優(yōu)化，各因素的實驗水平見表1。

表1 L9(34)正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of L9(34) orthogonal test

1.5 硅膠柱層析純化

1.5.1硅膠柱層析純化的基本工藝流程 層析硅膠樣品制備：為了保證實驗的平行性，批量制備一定量層析硅膠樣品保存?zhèn)溆谩Ｈ◇w積為V0的粗提液(巖藻黃素濃度C0)38 ℃減壓濃縮，除去溶劑后，加入等質(zhì)量的100目硅膠拌勻，繼續(xù)旋蒸至硅膠粒干燥，稱量總重m0，4 ℃密封避光保存，根據(jù)實驗需求取用。

柱層析：稱取一定量活化后的硅膠，石油醚溶脹30 min，濕法裝柱，干法上樣量為mf，以不同濃度梯度的石油醚∶乙酸乙酯(體積比分別為10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4)混合溶劑為洗脫液，分別洗脫2個柱體積。收集各部分洗脫液，通過薄層層析法與巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，確定橙黃色部分為目標(biāo)巖藻黃素，收集該部分洗脫液，測量其體積Vf和巖藻黃素濃度Cf。減壓濃縮10倍，密封4 ℃避光儲存，留待制備液相純化。通過下式計算巖藻黃素回收率：

(3)

式中：R—回收率；Vf—巖藻黃素洗脫液體積，mL；Cf—洗脫液中巖藻黃素濃度，mg·mL-1；V0—層析硅膠樣品制備所使用粗提液體積，mL；C0—粗提液中巖藻黃素濃度，mg·mL-1；mf—上樣量，g；m0—層析硅膠樣品制備所得樣品總重，g。

1.5.2巖藻黃素硅膠柱層析純化工藝條件優(yōu)化 分別考察硅膠柱床高度(8、10、15、20 cm)、上樣量(2、4、6、8、10 g)、洗脫流速(6、8、10、12 mL·min-1) 3個因素對巖藻黃素硅膠柱層析純化效果的影響，計算相應(yīng)的巖藻黃素純度(峰面積比)和回收率。研究某一單因素影響效果時，其他條件為固定值，分別為硅膠柱床高度10 cm、上樣量6 g、洗脫流速10 mL·min-1。

采用優(yōu)化得到的最佳提取工藝，批量提取質(zhì)量為m1的銅藻鮮藻中的巖藻黃素，在最佳硅膠柱層析工藝條件下，將粗提取的巖藻黃素進(jìn)行純化，收集橙黃色部分洗脫液，減壓濃縮，記錄濃縮液體積V1，取樣上機(jī)檢測巖藻黃素濃度C1，根據(jù)下式計算巖藻黃素的硅膠柱層析得率Y1，文中數(shù)據(jù)為多批次收集純化樣品后測定。

(4)

式中：Y1—得率，mg·g-1；V1—柱層析后巖藻黃素濃縮液體積，mL；C1—柱層析后巖藻黃素濃縮液濃度，mg·mL-1;m1—銅藻鮮藻質(zhì)量，g。

1.6 制備液相純化

以經(jīng)層析純化的巖藻黃素為樣品，進(jìn)樣量為5 000 μL，流動相為甲醇∶水=90∶10(體積比)，檢測波長為450 nm，流速為10 mL·min-1，收集橙黃色部分為巖藻黃素，減壓濃縮，濃縮液氮吹得到粉末狀巖藻黃素。

將質(zhì)量為m1的銅藻鮮藻經(jīng)有機(jī)溶劑提取、硅膠柱層析后得到的巖藻黃素樣品，采用上述制備液相純化工藝進(jìn)一步純化，得到高純度巖藻黃素濃縮液體積V2，取樣上機(jī)檢測巖藻黃素濃度C2，根據(jù)下式計算巖藻黃素制備液相純化得率Y2，文中數(shù)據(jù)為多批次收集純化樣品后測定。

(5)

式中：Y2—制備液相純化得率，mg·g-1；V2—巖藻黃素濃縮液體積，mL；C2—巖藻黃素濃縮液濃度，mg·mL-1;m1—銅藻鮮藻質(zhì)量，g。

1.7 巖藻黃素的高效液相色譜檢測

色譜條件：色譜柱為Agilent TC-C18 (5 μm×4.6 mm×250 mm)；檢測波長為448 nm；柱溫為35 ℃；流動相為乙腈∶水=90∶10(體積比)；流速為1 mL·min-1；進(jìn)樣量為20 μL。

精確稱取5 mg巖藻黃素標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜級甲醇定容到10 mL，配制成濃度為500 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)液。分別取0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)液，以色譜級甲醇定容到5.0 mL，配制成濃度分別為10、30、50、70、90、100 μg·mL-1的梯度液，配制過程避光操作。取不同濃度梯度液過0.45 μm有機(jī)濾膜，采用高效液相色譜檢測，將巖藻黃素峰面積(x)與其濃度(y)進(jìn)行線性回歸，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中巖藻黃素含量。隨后，分別取1.4、1.5、1.6中得到的巖藻黃素與標(biāo)準(zhǔn)品巖藻黃素一同進(jìn)行高效液相色譜(high-performance liquid chromatography，HPLC)檢測，并計算各自的純度(峰面積比)。

1.8 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)(除特殊說明外)均為3次平行實驗結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用SPSS 16.0和Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)分析(方差分析，one-way ANOVA)和圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 巖藻黃素有機(jī)溶劑提取工藝條件優(yōu)化

2.1.1提取溶劑對巖藻黃素提取率的影響 根據(jù)相似相溶原理提取銅藻中的巖藻黃素，本研究選擇了5種不同極性的有機(jī)溶劑(甲醇、乙醇、正己烷、石油醚、乙酸乙酯)，結(jié)果如圖1所示。巖藻黃素提取率依次為甲醇>乙醇>乙酸乙酯>正己烷=石油醚=0。甲醇的提取率最高，正己烷與石油醚由于極性較低且水溶性差，未能從銅藻中提取出巖藻黃素。因此，選擇提取率最高的甲醇作為銅藻鮮藻的提取溶劑。

注：不同小寫字母表示不同處理間巖藻黃素提取率的差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計學(xué)意義。.

2.1.2甲醇濃度對巖藻黃素提取率的影響 在料液比1∶20、提取溫度55 ℃、提取2 h的條件下，研究不同甲醇濃度對巖藻黃素提取率的影響。由圖2可知，隨著甲醇濃度的升高，巖藻黃素的提取率呈先上升后下降趨勢，當(dāng)甲醇濃度為90%時，提取率達(dá)到最大值，為0.241 9 mg·g-1。因此，提取巖藻黃素時甲醇的最佳濃度為90%。

注：不同小寫字母表示不同處理間巖藻黃素提取率的差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.1.3料液比對巖藻黃素提取率的影響 在以90%甲醇作為提取溶劑、提取溫度55 ℃、提取2 h的條件下，研究不同料液比對巖藻黃素提取率的影響。由圖3可知，隨著料液比增大，提取率呈先上升后下降趨勢，料液比1∶10時提取率最高。這可能是由于料液比升高可使巖藻黃素與甲醇的接觸更加充分，并升高銅藻細(xì)胞內(nèi)外巖藻黃素的濃度差，有利于巖藻黃素的擴(kuò)散，從而提高巖藻黃素提取率。因此，選擇1∶10為提取的最佳料液比。

注：不同小寫字母表示不同處理間巖藻黃素提取率的差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.1.4提取時間對巖藻黃素提取率的影響 在以90%甲醇作為提取溶劑、料液比1∶10、提取溫度55 ℃的條件下，研究不同提取時間對巖藻黃素提取率的影響。由圖4可知，隨著提取時間延長，巖藻黃素提取率呈略有下降后基本不變趨勢。這是由于隨著提取時間的延長，巖藻黃素自身不穩(wěn)定易分解，導(dǎo)致提取率略有下降?？紤]到提取效率和能耗，最終選擇1 h為最佳提取時間。

注：不同小寫字母表示不同處理間巖藻黃素提取率的差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.1.5提取溫度對巖藻黃素提取率的影響 在以90%甲醇作為提取溶劑、料液比1∶10、提取1 h的條件下，研究不同提取溫度對巖藻黃素提取率的影響。由圖5可知，提取溫度升高至55 ℃前，巖藻黃素的提取率呈上升趨勢，60 ℃時提取率略有下降。溫度升高有利于加快銅藻細(xì)胞光合膜的溶解，從而促進(jìn)色素的釋放溶出，提高提取率；但是溫度過高時，巖藻黃素可能被破壞，使巖藻黃素提取率下降。因此，選擇55 ℃為最佳提取溫度。

2.1.6正交實驗結(jié)果分析 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以最適有機(jī)溶劑的濃度、提取時間、提取溫度、料液比為因素，以巖藻黃素提取率為考察指標(biāo)，采用L9(34)正交表對巖藻黃素提取條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如表2所示，各因素對巖藻黃素提取率的影響程度由高到低依次為D>A>C>B，即料液比對巖藻黃素提取率的影響最高，其次為甲醇濃度。最優(yōu)工藝組合為A2B2C1D2，即甲醇濃度90%、提取時間1 h、提取溫度50 ℃、料液比1∶10。

2.1.7驗證實驗 采用最優(yōu)工藝條件，即甲醇濃度90%、提取時間1 h、提取溫度50 ℃、料液比 1∶10，開展3組平行有機(jī)溶劑提取試驗，得到巖藻黃素提取率為(0.258 9±0.003 6) mg·g-1FW [(1.078 8±0.015 0) mg·g-1DW]，該條件下巖藻黃素的提取率高于表2中任一結(jié)果，該優(yōu)化工藝為最佳選擇。

注：不同小寫字母表示不同處理間巖藻黃素提取率的差異在P<0.05水平具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表 2 正交實驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

2.2 巖藻黃素硅膠柱層析純化工藝條件優(yōu)化

2.2.1硅膠柱床高度對巖藻黃素純化效果的影響 在上樣量6 g、洗脫流速10 mL·min-1的條件下，研究不同硅膠柱床高度對巖藻黃素純化效果的影響。從圖6可以看出，隨著硅膠柱床高度增加，巖藻黃素純度呈先迅速升高后基本不變的趨勢，回收率呈先升高后緩慢下降趨勢，硅膠柱床高度為10 cm時純度和回收率最高。洗脫過程中，不同色素由于脂溶性不同，洗脫順序也不相同，巖藻黃素洗脫順序較為靠后，先于巖藻黃素洗脫的色素在硅膠柱中有一定的殘留，影響巖藻黃素純度。當(dāng)硅膠柱床高度偏短時，色素之間未能充分分離，使巖藻黃素的純度偏低；硅膠柱床高度增長至可以使色素充分分離后，繼續(xù)增加硅膠柱床高度對巖藻黃素純度無明顯效果；而硅膠柱床高度過長，則會使已經(jīng)分離的巖藻黃素被多余的硅膠再次吸附，導(dǎo)致回收率下降。綜合考慮回收率和純度，選擇10 cm為最佳硅膠柱床高度。

圖6 硅膠柱床高度對巖藻黃素純化效果影響Fig.6 Effect of silica column bed height on the purification effect of fucoxanthin

圖7 上樣量對巖藻黃素純化效果影響Fig.7 Effect of loading amount on the purification effect of fucoxanthin

2.2.2上樣量對巖藻黃素純化效果的影響 在硅膠柱床高度10 cm、洗脫流速10 mL·min-1的條件下，研究不同上樣量對巖藻黃素純化效果的影響。從圖7可以看出，上樣量小于6 g時，巖藻黃素純度基本不變，超過6 g后，純度不斷下降，而回收率則呈先升高后下降趨勢，上樣量6 g時回收率最高。在硅膠柱長確定的情況下，上樣量增加，巖藻黃素在硅膠中的殘留比有所降低，因此回收率有所提高；但是上樣量進(jìn)一步增大，硅膠柱床高度也有所增加，使得巖藻黃素發(fā)生二次吸附，回收率有所降低。同時，上樣量過大時，可能會導(dǎo)致硅膠吸附達(dá)到飽和，部分色素帶洗脫時發(fā)生重疊，導(dǎo)致巖藻黃素純度降低。因此，綜合考慮選擇6 g作為最佳上樣量。

2.2.3洗脫流速對巖藻黃素純化效果的影響 在硅膠柱床高度10 cm、上樣量6 g的條件下，研究不同洗脫流速對巖藻黃素純化效果的影響。從圖8可以看出，隨著洗脫流速增加，巖藻黃素純度和回收率均呈先升高后下降趨勢。洗脫流速較低時，柱層析時間較長，由于巖藻黃素自身不穩(wěn)定，易分解，可能會在柱層析過程中部分降解，使巖藻黃素回收率偏低；且流速低時，色素條帶存在拖尾現(xiàn)象，也導(dǎo)致巖藻黃素的純度和回收率降低。而洗脫流速過快時，各色素條帶之間未能充分分離，導(dǎo)致巖藻黃素純度下降。綜合考慮選擇10 mL·min-1為最佳洗脫流速。

圖8 洗脫流速對巖藻黃素純化效果影響Fig.8 Effect of flow rate on the purification effect of fucoxanthin

2.2.4優(yōu)化后的硅膠柱層析工藝純化巖藻黃素 在硅膠柱床高度10 cm、上樣量6 g、洗脫流速10 mL·min-1的條件下，開展硅膠柱層析純化實驗，巖藻黃素得率為0.176 5 mg·g-1FW(0.735 3 mg·g-1DW)。

2.3 巖藻黃素制備液相純化

以經(jīng)層析純化的巖藻黃素為樣品，進(jìn)樣量為5 000 μL，流動相為甲醇∶水=90∶10(體積比)，檢測波長為450 nm，流速為10 mL·min-1，進(jìn)行制備液相純化，巖藻黃素得率為0.127 1 mg·g-1FW(0.529 4 mg·g-1DW)。

2.4 巖藻黃素高效液相色譜法分析

取不同濃度梯度液過0.45 μm有機(jī)濾膜，采用高效液相色譜檢測，將巖藻黃素峰面積(x)與其濃度(y)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=4×10-6x+2.637 2(R2=0.999 1)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各樣品中巖藻黃素含量。

分別取經(jīng)有機(jī)溶劑萃取、硅膠柱層析純化以及制備液相純化的巖藻黃素與標(biāo)準(zhǔn)品巖藻黃素進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果如圖9所示。由圖9A可以看出，粗提液色譜圖的雜峰較多，在7.771 min出現(xiàn)的吸收峰與標(biāo)準(zhǔn)品(圖9D)巖藻黃素峰(7.889 min)較為接近，為巖藻黃素峰，此時巖藻黃素純度為24.51%±1.62%。硅膠柱層析純化后(圖9B)，與粗提液相比，雜峰大大減少，在7.814 min出現(xiàn)的吸收峰與標(biāo)準(zhǔn)品一致，判斷該物質(zhì)為巖藻黃素，巖藻黃素純度為87.01%±0.88%；制備液相純化后(圖9C)，雜峰幾乎不可見，與標(biāo)準(zhǔn)品圖譜(圖9D)一致，僅在7.844 min可見一明顯巖藻黃素峰，此時，巖藻黃素純度為99.27%±0.22%。由此可見，硅膠柱層析對提高巖藻黃素純度有顯著效果，適合用于巖藻黃素的純化生產(chǎn)；制備液相純化則是良好的高純度巖藻黃素的獲得方法。

圖9 巖藻黃素粗提液、硅膠柱層析純化、制備液相純化后和標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜Fig.9 HPLC analyses of fucoxanthin in crude extract, after silica column chromatography, after preparative liquid chromatography and standard.

3 討論

目前，巖藻黃素的提取原料主要為褐藻門的海藻，其中產(chǎn)量比較高的有海帶、裙帶菜、羊棲菜、馬尾藻、鼠尾藻等。近年來陸續(xù)有采用銅藻提取巖藻黃素的報道，銅藻作為一種巖藻黃素含量較高的褐藻，越來越被認(rèn)可作為提取巖藻黃素的優(yōu)良原料。胡永東等[16]通過70%乙醇溶劑萃取法提取銅藻中的巖藻黃素，在最佳工藝條件(溫度70 ℃、時間127 min、料液比68.3 mg·L-1)下，提取率達(dá)到0.72 mg·g-1(UV檢測)；韓典峰等[17]采用超聲輔助乙醇提取銅藻中的巖藻黃素，優(yōu)化得到最佳提取工藝為：乙醇濃度70%，料液比1∶100，起始溫度60 ℃，超聲時間40 min，此工藝條件下提取率達(dá)1.09 2 mg·g-1；嚴(yán)國富等[18]采用超臨界CO2法萃取銅藻中巖藻黃素，最佳工藝為：萃取壓力27.5 MPa，萃取3 h，夾帶劑200 mL，萃取溫度35 ℃，此時巖藻黃素萃取率達(dá)0.83 mg·g-1； 張怡評等[19]采用超臨界CO2法萃取銅藻中巖藻黃素，在樣品粉碎粒度80目、萃取溫度40 ℃、壓力25 MPa、萃取時間30 min的工藝條件下，巖藻黃素提取率為1.12 mg·g-1；李紅艷等[20]通過超聲輔助有機(jī)溶劑萃取法提取銅藻鮮藻中的巖藻黃素，在乙醇濃度90%、超聲時間18 min、料液比1∶5、提取溫度45 ℃下提取2次，提取率達(dá)1.460 3 mg·g-1。上述研究中，除李紅艷等[20]外，均采用烘干或凍干后的銅藻干藻作為提取原料。而本研究采用甲醇有機(jī)溶劑萃取法提取銅藻鮮藻中的巖藻黃素，提取率為(0.258 9±0.003 6) mg·g-1FW [(1.078 8 ±0.015 0) mg·g-1DW]。這說明，原料產(chǎn)地不同、采樣季節(jié)不同導(dǎo)致銅藻巖藻黃素的含量可能有所差異，而對原料的預(yù)處理方法、檢測方法以及提取工藝的不同也會導(dǎo)致結(jié)果的不同。

為了與超聲輔助有機(jī)溶劑萃取法有所比較，采用同一批次的銅藻，應(yīng)用優(yōu)化后的銅藻鮮藻超聲輔助乙醇提取最佳工藝[20]進(jìn)行了巖藻黃素提取，提取率為(0.226 5±0.002 1) mg·g-1FW[(0.943 8±0.008 8) mg·g-1DW](數(shù)據(jù)未發(fā)表)，比本研究所用的甲醇有機(jī)溶劑萃取法提取率低12.51%。通常來講，超聲輔助有機(jī)溶劑法具有提取時間短、能耗低、有效成分破壞少、提取率高等特點，但是上述結(jié)果與之不符，超聲提取率小于有機(jī)溶劑提取率，推測可能的原因有：甲醇極性(6.6)高于乙醇(4.3)，根據(jù)相似相溶原理，其對巖藻黃素的提取率高于乙醇；巖藻黃素不穩(wěn)定，超聲和提取過程溫度變化導(dǎo)致降解；由于大量巖藻黃素在褐藻中以巖藻黃素-葉綠素蛋白復(fù)合體(fucoxanthin-chlorophyll protein，F(xiàn)CP)形式[23]存在于類囊體膜上，超聲過程可能導(dǎo)致蛋白變性，阻礙了巖藻黃素的溶出，具體原因有待進(jìn)一步驗證。

硅膠柱層析法是一種經(jīng)典的分離純化技術(shù)，具有靈活方便、選擇性高、制備量大、成本低等優(yōu)點，是天然物質(zhì)和性質(zhì)相近的物質(zhì)分離純化的首選方法之一[21,24-25]。在巖藻黃素純化方面，王樂等[21]采用硅膠柱層析純化了從鼠尾藻中提取的巖藻黃素，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，純化后巖藻黃素純度為86.88%±1.34%，得率為(0.048±0.002) mg·g-1，但未給出巖藻黃素回收率；吳素煌等[26]采用減壓硅膠柱層析和制備高效液相色譜制備出3種巖藻黃素異構(gòu)體，但未給出硅膠柱層析后巖藻黃素的純度和回收率；周衛(wèi)松等[27]對裙帶菜提取的巖藻黃素進(jìn)行了硅膠柱層析純化，正己烷-乙醚洗脫，純化后巖藻黃素含量為24.2%，回收率90.9%；宋月等[28]采用硅膠柱層析純化巖藻黃素，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，巖藻黃素純度達(dá)70.0%，回收率數(shù)據(jù)未給出。本研究以石油醚-乙酸乙酯為洗脫劑梯度洗脫，巖藻黃素純度達(dá)87.01%±0.88%，回收率約為68.16%，低于周衛(wèi)松等[27]的回收率，這可能是由于洗脫方法的不同導(dǎo)致的；較常見的硅膠柱層析回收率(80%以上)[23-25]也偏低，這可能是由于純化過程較長，且難以做到完全避光，巖藻黃素有所降解。

本研究首先采用有機(jī)溶劑法提取銅藻鮮藻中的巖藻黃素，通過單因素實驗和正交實驗優(yōu)化提取工藝，得到最佳工藝條件如下：甲醇濃度90%，提取時間1 h，提取溫度50 ℃，料液比1∶10。此條件下巖藻黃素提取率達(dá)到(0.258 9±0.003 6) mg·g-1FW[(1.078 8±0.015 0) mg·g-1DW]。然后，本研究采用硅膠柱層析法對粗提取的巖藻黃素進(jìn)行了純化，通過單因素實驗對硅膠柱層析工藝進(jìn)行優(yōu)化，最佳工藝條件為：硅膠柱床高度10 cm，上樣量6 g，洗脫流速10 mL·min-1，此條件下，巖藻黃素得率為0.176 5 mg·g-1FW(0.735 3 mg·g-1DW)，純度為87.01%±0.88%。最后，采用制備液相對硅膠柱層析后的巖藻黃素進(jìn)一步純化，巖藻黃素得率為0.127 1 mg·g-1FW(0.529 4 mg·g-1DW)，純度為99.27%±0.22%。本研究建立了有機(jī)溶劑萃取-硅膠柱層析純化-制備液相純化的高純巖藻黃素制備工藝，為高純度巖藻黃素的制備提供了新的參考。