miR-148a通過靶向調(diào)節(jié)己糖激酶2基因抑制乳腺癌細(xì)胞糖酵解和細(xì)胞增殖能力

張海濤， 張宇新

華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北省慢性疾病基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 唐山 063210

乳腺癌是一種常見的惡性腫瘤，也是全球范圍內(nèi)女性罹患最多的惡性腫瘤之一，每年全球會新增270萬患者[1]。目前，乳腺癌的臨床治療方法主要包括手術(shù)治療、化療、放射治療等[2-3]。但手術(shù)治療對于已經(jīng)發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者治療效果較差，預(yù)后不良；化療聯(lián)合放射治療主要用于中晚期或者已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者，毒副作用大，患者生存質(zhì)量差。因此，有效提高乳腺癌患者的治療效果、尋找潛在的分子靶點(diǎn)、提高患者的生存質(zhì)量和預(yù)后、延緩腫瘤進(jìn)程、降低惡性腫瘤的死亡率顯得尤為重要。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平的非編碼小分子RNA，可通過靶向結(jié)合mRNA，直接降解或者抑制靶mRNA翻譯，參與細(xì)胞生長、增殖等調(diào)控過程。miRNA在不同腫瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)量具有顯著差異，并通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲等相關(guān)基因的表達(dá)，最終影響腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移和血管生成等。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA表達(dá)譜在正常乳腺組織和乳腺癌組織中的表達(dá)量具有明顯差異，提示miRNA與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。其中，miR-148a在乳腺癌組織中的表達(dá)量較正常組織顯著降低，并對乳腺癌的惡性演進(jìn)過程具有一定的抑制作用[6-7]。惡性腫瘤細(xì)胞具有高水平有氧糖酵解的代謝特點(diǎn)，有氧糖酵解代替正常細(xì)胞的氧化磷酸化過程成為腫瘤細(xì)胞主要的糖代謝途徑[8-9]。乳腺癌組織比正常組織生長迅速，不僅需要更多的能量，還需要生長過程所需的生物大分子，而糖酵解過程產(chǎn)生的中間產(chǎn)物可被腫瘤細(xì)胞用于合成生長過程中所需的蛋白質(zhì)、核苷酸等物質(zhì)[9]。糖酵解代謝作為乳腺癌細(xì)胞的主要代謝特征之一，其分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚，且miR-148a對乳腺癌細(xì)胞糖代謝功能的影響也尚未見報(bào)道。

己糖激酶2(hexokinase 2，HK2)是糖酵解途徑的首要關(guān)鍵酶，直接決定進(jìn)入糖酵解的葡萄糖量。研究表明，雖然HK2在正常組織中的表達(dá)量較低，但在包括乳腺癌在內(nèi)的大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)量顯著增加[10-11]，且當(dāng)乳腺癌組織發(fā)生轉(zhuǎn)移時(shí)，HK2的表達(dá)量進(jìn)一步升高[12]。提示HK2在乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、放化療敏感性中發(fā)揮著重要作用。

為了探討miR-148a是否通過靶向調(diào)控HK2來抑制乳腺癌細(xì)胞糖酵解代謝，本實(shí)驗(yàn)擬通過檢測多種乳腺癌細(xì)胞系中miR-148a的表達(dá)量，從中篩選miR-148a表達(dá)量相對較低的乳腺癌細(xì)胞系作為研究對象。再通過觀察miR-148a表達(dá)量的變化對乳腺癌細(xì)胞葡萄糖攝取量、乳酸生成量和細(xì)胞增殖指標(biāo)的影響，以探究miR-148a對乳腺癌細(xì)胞糖代謝能力的影響。隨后，通過TargetScan在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-148a和HK2基因的靶向關(guān)系，再通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、Western免疫印跡以及基因回復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，以進(jìn)一步明確miR-148a和HK2在乳腺癌細(xì)胞的糖酵解代謝途徑中的作用機(jī)制，以期初步闡明miR-148a調(diào)控乳腺癌細(xì)胞糖酵解功能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Gibco公司；RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗、青-鏈霉素購于上海碧云天生物公司；NC膜、ECL發(fā)光試劑盒購于美國Milipore公司；SDS、Tris-base、丙烯酰胺購于美國BioSharp公司；miR-148a mimics(miR-148a過表達(dá)載體)、anti-miR-148a(miR-148a抑制載體)、miR-negative control(陰性對照)、pcDNA-HK2(HK2基因過表達(dá)載體)、HK2-MUT和HK2-WT熒光素酶報(bào)告基因載體購于上海吉瑪生物制藥有限公司；Opti-MEM培養(yǎng)基、Lipofectamine TM2000購于美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購于北京康為試劑有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購于北京威格拉斯公司；葡萄糖檢測試劑盒購于上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；乳酸檢測試劑盒購于美國Biovision公司；兔抗HK2、兔抗GAPDH購于美國Proteintech公司。

酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)；PCR儀(美國ABI公司)；WB顯影儀(美國ProteinSample公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人正常乳腺細(xì)胞Hs 578Bst和人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB231分別采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

以對數(shù)生長期的細(xì)胞為轉(zhuǎn)染對象，根據(jù)Lipofectamine TM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書將不同基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染其中。6 h后，觀察細(xì)胞狀態(tài)并更換培養(yǎng)基。篩選miR-148a表達(dá)量相對較低的乳腺癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞不需要進(jìn)行事先轉(zhuǎn)染。

1.3 qRT-PCR檢測乳腺細(xì)胞和不同乳腺癌細(xì)胞中miR-148a mRNA的表達(dá)情況

收集人正常乳腺細(xì)胞Hs 578Bst和人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB231提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，采用qRT-PCR試劑盒通過PCR儀擴(kuò)增檢測，最終數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCt方法分析。引物序列見表1。逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR相應(yīng)的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序均按照試劑盒說明書操作。選擇miR-148a表達(dá)量相對較低的乳腺癌細(xì)胞系作為后續(xù)研究對象。

表1 qRT-PCR所用引物Table 1 Primers used for qRT-PCR

1.4 miR-148a對乳腺癌細(xì)胞糖代謝能力的影響

分別轉(zhuǎn)染miR-148a mimics、anti-miR-148a和miR-negative control至1.3篩選出的乳腺癌細(xì)胞系中，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為空白對照，并檢測相關(guān)指標(biāo)(具體如下)，以探究miR-148a對乳腺癌細(xì)胞糖代謝能力的影響。

1.4.1qRT-PCR檢測miR-148a不同表達(dá)載體在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況 轉(zhuǎn)染48 h后，收集乳腺癌細(xì)胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行qRT-PCR，具體操作同1.3。

1.4.2測定細(xì)胞葡萄糖攝取量 將乳腺癌細(xì)胞以每孔1×105個(gè)加入6孔板中，更換為無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，室溫1 000 r·min-1， 離心5 min，去除沉淀雜質(zhì)，即為上清液。

采用葡萄糖檢測試劑盒進(jìn)行測定，操作步驟如下：①工作液的配制：R1試劑∶R2試劑=1∶1，混合均勻后使用；②空白管、校準(zhǔn)管、樣本管的配置：工作液1 000 μL，分別加蒸餾水、校準(zhǔn)液、上清液10 μL；③加樣后用渦旋振蕩器充分混勻，置于 37 ℃ 恒溫水浴鍋中水浴反應(yīng)10 min；④使用酶標(biāo)儀，波長500 nm，以空白管調(diào)零，讀取校準(zhǔn)管和樣本管的吸光度；⑤按照試劑盒說明書計(jì)算上清液中葡萄糖水平，即為細(xì)胞的葡萄糖攝取量。

1.4.3測定細(xì)胞乳酸生成量 用乳酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；按照1.4.2中的方法獲得上清液，吸取20 μL上清液、26 μL緩沖液、2 μL乳酸酶混合物混合均勻，室溫下靜置30 min，置于酶標(biāo)儀中檢測其在570 nm波長下的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上清液中乳酸水平，即為細(xì)胞的乳酸生成量。

1.4.4BrdU法檢測細(xì)胞增殖能力 將乳腺癌細(xì)胞接種于96孔板中，并調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)·孔-1，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。用PBS緩沖液將1 000×BrdU稀釋為10×BrdU，再加入細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整為1×BrdU，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。棄去原培養(yǎng)基，每孔加入200 μL FixDenat液，37 ℃孵育30 min；棄去FixDenat液，每孔加入100 μL anti-BrdU-POD溶液，37 ℃孵育90 min；棄去anti-BrdU-POD溶液，用PBS緩沖液清洗2次，每孔加入100 μL終止液，置于酶標(biāo)儀中檢測細(xì)胞在370 nm下的吸光值。存儲分析數(shù)據(jù)。

1.5 miR-148a和HK2對乳腺癌細(xì)胞的糖酵解功能的影響

首先，通過TargetScan在線數(shù)據(jù)庫(http://www.targetscan.org/vert_71/)預(yù)測miR-148a與HK2基因的靶向關(guān)系，再通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、Western免疫印跡以及基因回復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

1.5.1雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 將含有miR-148a結(jié)合位點(diǎn)的HK2的3′-UTR片段插入PGL3熒光素酶報(bào)告基因載體，構(gòu)建野生型HK2(HK2-WT)和突變型HK2(HK2-MUT)的3′-UTR熒光素酶報(bào)告載體(上海吉瑪生物制藥有限公司)，并分別共轉(zhuǎn)染miR-148a mimics和anti-miR-148a至1.3篩選出的乳腺癌細(xì)胞系中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，測定雙熒光素酶的活性，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對照，具體按照試劑盒說明書操作。

1.5.2Western免疫印記檢測HK2蛋白的表達(dá)情況 將miR-148a mimics、anti-miR-148a和miR-negative control轉(zhuǎn)染至1.3篩選出的乳腺癌細(xì)胞系中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為空白對照，提取總蛋白。使用10%的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳分離，使用NC膜轉(zhuǎn)膜后用含5%牛血清白蛋白的TBST溶液室溫封閉2 h，在4 ℃冰箱內(nèi)搖床孵育HK2(1∶1 000稀釋)、GAPDH(1∶3 000稀釋)一抗過夜，再于室溫下?lián)u床孵育二抗(1∶5 000稀釋)2 h。使用化學(xué)發(fā)光法使條帶顯影。

1.5.3基因回復(fù)實(shí)驗(yàn) 分別將pcDNA-HK2和pcDNA-HK2+miR-148a mimics轉(zhuǎn)染至1.3篩選出的乳腺癌細(xì)胞系中，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對照，再按照1.4.2～1.4.4所述步驟，測定miR-148a和HK2表達(dá)量的變化對乳腺癌細(xì)胞葡萄糖攝取量、乳酸生成量和細(xì)胞增殖指標(biāo)的影響。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用Prism 6軟件作圖、分析，實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)，兩組之間比較采用Student’st檢驗(yàn)。以P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-148a在不同乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況

為了觀察多種不同乳腺癌細(xì)胞系中miR-148a的表達(dá)情況，通過qRT-PCR檢測MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB231 3種乳腺癌細(xì)胞系中miR-148a mRNA表達(dá)水平。與人正常乳腺細(xì)胞Hs 578Bst相比，miR-148a在乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB231)中的表達(dá)量均明顯降低，分別降低了1.8、2.2、3.1倍，尤其是在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB231中表達(dá)量顯著降低(P<0.000 1)(圖1)。為了便于研究miR-148a的功能，選擇miR-148a表達(dá)量相對較低的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231作為后續(xù)研究的對象。

注：****表示miR-148a在MDA-MB231和Hs 578Bst中的相對表達(dá)量的差異在P<0.000 1水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 miR-148a對乳腺癌細(xì)胞糖代謝能力的影響

2.2.1過表達(dá)miR-148a對MDA-MB231細(xì)胞的影響 MDA-MB231細(xì)胞培養(yǎng)至匯合率大于80%，分別將miR-negative control(陰性對照)和miR-148a mimics轉(zhuǎn)染其中，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為空白對照。為了檢測miR-148a在MDA-MB231細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率，48 h后通過qRT-PCR檢測miR-148a mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比，miR-148a在MDA-MB231中表達(dá)量上升2.3倍(P<0.001)(圖2A)。按照公式計(jì)算檢測過表達(dá)miR-148a后MDA-MB231細(xì)胞葡萄糖攝取量的變化，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，MDA-MB231細(xì)胞葡萄糖攝取量下降了1.8倍(P<0.01)(圖2B)。通過建立乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測過表達(dá)miR-148a后MDA-MB231細(xì)胞乳酸生成量的變化，發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比，MDA-MB231細(xì)胞乳酸生成量下降了2.4倍(P<0.001)(圖2C)。通過BrdU法檢測過表達(dá)miR-148a后對MDA-MB231細(xì)胞增殖的變化，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，MDA-MB231細(xì)胞增殖指標(biāo)下降了2.2倍(P<0.001)(圖2D)。

注：**和***分別表示miR-148a mimics組與空白對照組在同一指標(biāo)上的差異在P<0.01和P<0.001水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.2抑制miR-148a表達(dá)對MDA-MB231細(xì)胞的影響 MDA-MB231細(xì)胞培養(yǎng)至匯合率大于80%，分別轉(zhuǎn)染miR-negative control和anti-miR-148a到MDA-MB231細(xì)胞中，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為空白對照。為了檢測miR-148a在MDA-MB231中的轉(zhuǎn)染效率，48 h后通過qRT-PCR檢測miR-148a mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與空白對照組細(xì)胞相比，miR-148a在MDA-MB231中表達(dá)量下降10.0倍(P<0.000 1)(圖3A)。通過公式計(jì)算抑制miR-148a表達(dá)后MDA-MB231細(xì)胞葡萄糖攝取量的變化，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，MDA-MB231細(xì)胞葡萄糖攝取量上升了1.6倍(P<0.01)(圖3B)。通過建立乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測抑制miR-148a表達(dá)后MDA-MB231細(xì)胞乳酸生成量的變化，發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比，MDA-MB231細(xì)胞乳酸生成量上升了1.7倍(P<0.01)(圖3C)。通過BrdU法檢測抑制miR-148a表達(dá)后對MDA-MB231細(xì)胞增殖的變化，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，MDA-MB231細(xì)胞增殖指標(biāo)上升了1.6倍(P<0.01)(圖3D)。

2.3 miR-148a和HK2對乳腺癌細(xì)胞的糖酵解代謝功能的影響

2.3.1miR-148a與HK2靶向關(guān)系預(yù)測 為了探究HK2是否為miR-148a的直接靶分子，采用TargetScan在線數(shù)據(jù)庫(http://www.targetscan.org/vert_71/)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)miR-148a與HK2基因3′-UTR區(qū)具有部分結(jié)合位點(diǎn)(圖4A)。

注：**和****分別表示Anti-miR-148a組和空白對照組在同一指標(biāo)上的差異在P<0.01和P<0.000 1水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

注：*、**和****分別表示處理組和對照組在同一指標(biāo)上的差異在P<0.05、P<0.01和P<0.000 1水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；NS表示差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3.2雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 為了明確miR-148a與HK2的靶向關(guān)系，將miR-148a與HK2基因3′-UTR結(jié)合的區(qū)域進(jìn)行突變，并分別構(gòu)建含有PGL3熒光素酶報(bào)告基因的野生型HK2(HK2-WT)和突變型HK2(HK2-MUT)3′-UTR載體。將miR-148a mimics分別與HK2-WT和HK2-MUT共轉(zhuǎn)染到MDA-MB231細(xì)胞中，48 h后，通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)觀察miR-148a與野生型(HK2-WT)和突變型(HK2-MUT)mRNA結(jié)合的程度。結(jié)果顯示，HK2-WT組雙熒光素酶的活性下降2.8倍(P<0.000 1)，而HK2-MUT組雙熒光素酶的活性無明顯改變(圖4B)。將anti-miR-148a分別與HK2-WT和HK2-MUT共轉(zhuǎn)染到MDA-MB231細(xì)胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HK2-WT組雙熒光素酶的活性上升2.2倍(P<0.01)，而HK2-MUT組雙熒光素酶的活性無明顯改變(圖4C)。說明，miR-148a與野生型HK23′-UTR熒光素酶報(bào)告載體結(jié)合，不與突變型HK23′-UTR結(jié)合。

2.3.3Western免疫印跡檢測 為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-148a對HK2的調(diào)控作用，通過Western免疫印跡檢測過表達(dá)和抑制miR-148a表達(dá)后MDA-MB231細(xì)胞中的HK2蛋白水平，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，過表達(dá)miR-148a組MDA-MB231乳腺癌細(xì)胞中的HK2蛋白表達(dá)量下降2.4倍(P<0.000 1)，抑制miR-148a表達(dá)組MDA-MB231乳腺癌細(xì)胞中的HK2蛋白表達(dá)量上升1.2倍(P<0.05)(圖4D、E)。

2.3.4miR-148a可逆轉(zhuǎn)HK2過表達(dá)所致促葡萄糖攝取效應(yīng) 為了觀察HK2基因?qū)DA-MB231細(xì)胞葡萄糖攝取量的作用，把HK2基因過表達(dá)載體pcDNA-HK2轉(zhuǎn)染到MDA-MB231細(xì)胞中，48 h后，通過公式計(jì)算檢測過表達(dá)HK2基因后MDA-MB231細(xì)胞葡萄糖攝取量的變化，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，HK2過表達(dá)可使MDA-MB231細(xì)胞葡萄糖攝取量上升1.6倍(P<0.01)(圖5A)。

為了探究miR-148a調(diào)控HK2基因的表達(dá)對MDA-MB231細(xì)胞葡萄糖攝取量的作用，將pcDNA-HK2與miR-148a mimics共轉(zhuǎn)染MDA-MB231細(xì)胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn) MDA-MB231細(xì)胞葡萄糖攝取量上升1.2倍，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖5A)。

2.3.5miR-148a可逆轉(zhuǎn)HK2過表達(dá)所致促乳酸生成效應(yīng) 為了觀察HK2基因?qū)DA-MB231細(xì)胞乳酸生成量的作用，把pcDNA-HK2轉(zhuǎn)染到MDA-MB231細(xì)胞中，48 h后，通過建立乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測過表達(dá)HK2基因后MDA-MB231細(xì)胞乳酸生成量的變化，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，MDA-MB231細(xì)胞乳酸的生成量上升1.5倍(P<0.01)(圖5B)。

為了探究miR-148a調(diào)控HK2基因的表達(dá)對MDA-MB231細(xì)胞乳酸生成量的作用，將pcDNA-HK2與miR-148a mimics共轉(zhuǎn)染MDA-MB231細(xì)胞，結(jié)果顯示，MDA-MB231細(xì)胞乳酸生成量沒有明顯變化(P>0.05)(圖5B)。

2.3.6miR-148a可逆轉(zhuǎn)HK2過表達(dá)所致促細(xì)胞增殖效應(yīng) 為了觀察HK2基因?qū)DA-MB231細(xì)胞增殖作用的影響，把pcDNA-HK2轉(zhuǎn)染到MDA-MB231細(xì)胞中，48 h后，通過BrdU法檢測過表達(dá)HK2基因后MDA-MB231細(xì)胞增殖的變化，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，MDA-MB231細(xì)胞增殖指標(biāo)上升1.7倍(P<0.01)(圖5C)。

為了探究miR-148a調(diào)控HK2基因的表達(dá)對MDA-MB231細(xì)胞增殖的影響，pcDNA-HK2與miR-148a mimics共轉(zhuǎn)染MDA-MB231細(xì)胞，結(jié)果顯示，MDA-MB231細(xì)胞增殖沒有出現(xiàn)明顯的變化(P>0.05)(圖5C)。

注：**表示pcDNA-HK2組與對照組在同一指標(biāo)上的差異在P<0.01水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；NS表示差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

幾乎所有的腫瘤中均出現(xiàn)miRNA的異常表達(dá)，并與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為(如侵襲、增殖、轉(zhuǎn)移等)密切相關(guān)[13-14]。已發(fā)現(xiàn)miR-320、miR-770、miR-421、miR-1246、miR-27a等miRNA可通過抑制癌基因的表達(dá)負(fù)向調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖或遷移、侵襲[15-19]。本研究中，miR-148a在MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB231 3種乳腺癌細(xì)胞系中mRNA表達(dá)水平均明顯下降，提示miR-148a與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展存在一定關(guān)系。為了便于研究miR-148a的功能，本研究選擇miR-148a表達(dá)量相對較低的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231作為研究對象。

與正常組織細(xì)胞相比，糖酵解過程在惡性腫瘤組織中明顯增強(qiáng)，而且即使在有氧環(huán)境中，惡性腫瘤細(xì)胞仍以糖酵解為主要的葡萄糖代謝途徑，而不是產(chǎn)生更多ATP的氧化磷酸化途徑[20]。本研究結(jié)果顯示，在MDA-MB231細(xì)胞中過表達(dá)miR-148a可使細(xì)胞葡萄糖攝取量降低、乳酸生成量下降，并抑制細(xì)胞增殖；而抑制miR-148a表達(dá)，則增加葡萄糖攝取量和乳酸生成量，促進(jìn)細(xì)胞增殖，提示miR-148a可抑制乳腺癌細(xì)胞的糖酵解能力和細(xì)胞增殖能力。

HK2作為糖酵解過程中重要的限速酶，通過催化葡萄糖分解為6-磷酸葡萄糖成為糖酵解發(fā)生的第一步關(guān)鍵調(diào)控酶，其在正常組織中的表達(dá)量較少但在腫瘤組織中的表達(dá)量異常[10-11]，是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞糖酵解過程增強(qiáng)的重要原因之一。研究顯示，多種miRNA可靶向調(diào)控HK2的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控腫瘤的糖酵解代謝途徑[21-22]。本研究通過TargetScan在線數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果，選取糖酵解限速酶HK2作為miR-148a的靶向抑制對象。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-148a靶向HK2的3′-UTR，而突變位點(diǎn)未與miR-148a靶向結(jié)合，因此推測miR-148a可以靶向結(jié)合HK2mRNA的3′-UTR，抑制其蛋白質(zhì)翻譯過程。Western免疫印跡結(jié)果顯示，過表達(dá)或抑制miR-148a的表達(dá)可以分別抑制或促進(jìn)HK2基因表達(dá)，提示miR-148a能夠靶向抑制HK2表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-148a可通過靶向抑制HK2來調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的糖酵解能力，本實(shí)驗(yàn)通過轉(zhuǎn)染過表達(dá)HK2載體，發(fā)現(xiàn)HK2基因過表達(dá)，可顯著增加細(xì)胞葡萄糖攝取量、乳酸生成量，并促進(jìn)細(xì)胞增殖；將過表達(dá)miR-148a載體與過表達(dá)HK2載體共轉(zhuǎn)染MDA-MB231細(xì)胞，miR-148a則可逆轉(zhuǎn)HK2所致的葡萄糖攝取量增加和乳酸生成量上升，并抑制細(xì)胞增殖，提示miR-148a可抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231的糖酵解和促細(xì)胞增殖能力。

綜上所述，過表達(dá)miR-148a可以靶向抑制HK2基因的表達(dá)，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞的葡萄糖攝取量下降、乳酸生成減少、細(xì)胞增殖降低，可為乳腺癌靶向治療提供新靶點(diǎn)。但本研究僅進(jìn)行了體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，還需進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)研究，以期為乳腺癌診斷及評估患者預(yù)后提供分子標(biāo)志物。