水相中氫氣濃度檢測方法的建立

張昭， 魏婭楠， 儀楊， 馬勝男， 張曉康， 馬雪梅， 張鑫

北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100124

氫氣(H2)無色無味，是自然界最小的分子，同時也是宇宙中含量最多的元素。過去H2被認(rèn)為是生物惰性氣體。近年來，隨著對其生物學(xué)功能的深入研究，研究人員認(rèn)為H2可能是繼一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)和硫化氫(H2S)之后又一個重要的氣體信號分子[1]。2007年Ohsawa等[2]發(fā)現(xiàn)氫氣可顯著改善腦缺血再灌注損傷，由此引起了對于氫氣的研究熱潮。研究表明，H2對多種人類疾病和病理狀態(tài)都具有明顯的緩解和治療效果，如氫分子在抗氧化、抗炎癥等方面都發(fā)揮著重要作用[3-6]。此外，H2在植物學(xué)上也具有重要的生理作用，其不僅可提高植物對生物/非生物脅迫的抗性，還參與調(diào)控植物的生長發(fā)育[7-9]。

目前飲用富氫水(hydrogen-rich water，HRW)是常用的攝取氫的方式[10-18]，水相中氫氣濃度的準(zhǔn)確測定是各項(xiàng)研究以及后續(xù)生產(chǎn)應(yīng)用的前提和基礎(chǔ)。目前，測定溶液中氫氣濃度的方法主要有電極法、氣相色譜法和氧化還原滴定法[19]。電極法是通過測定溶液中氧化還原電位的變化而確定溶液中氫氣的濃度；氣相色譜法主要依據(jù)樣品成分與色譜柱沸點(diǎn)、極性或吸附性的不同，氣體通過色譜柱時被分離，各種物質(zhì)到達(dá)檢測器時間有所不同，從而可以對待測組分進(jìn)行定性和定量測定；氧化還原滴定法是利用亞甲基藍(lán)在膠體鉑催化下與氫氣發(fā)生氧化還原反應(yīng)使亞甲基藍(lán)褪色，通過亞甲基藍(lán)的用量計算出溶液中氫氣的含量[19]，但此方法誤差較大，且準(zhǔn)確度不高。基于此，本研究探究分別利用氫氣微電極和頂空氣相色譜檢測小體系溶液中氫氣濃度的可行性，并對這2種方法進(jìn)行比較，以期建立一種可廣泛用于氫氣生物學(xué)研究和相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)的氫氣濃度檢測方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備

標(biāo)準(zhǔn)氮?dú)?、氧氣購自北京誠為信氣體有限公司。Milli-Q Advantage A10純水設(shè)備購自美國Millipore公司；ZK-300純水氫氣發(fā)生器購自北京中科匯恒技術(shù)開發(fā)有限公司；氫氣微電極購自丹麥Unisense公司；GCMS-QP2010 Ultra氣質(zhì)聯(lián)用儀購自日本島津公司，配備同公司的介質(zhì)阻擋放電氦等離子體檢測器(dielectric barrier discharge ionization detector，BID)、SH-RtTM-Msieve 5A色譜柱；氣相色譜瓶購自美國安捷倫科技有限公司。

1.2 飽和HRW的制備

將純水氫氣發(fā)生器制得的氫氣(99.999%)通入100 mL超純水(ddH2O)中以制備HRW，每隔10 min使用氫氣微電極測定一次，直至飽和，氫氣在20 ℃下溶解度為1.62 mg·L-1[20]。制得飽和HRW后，立即使用ddH2O稀釋，配制成不同濃度的HRW(表1)以用于測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，溶液總體系為500.0 μL。

表1 高濃度和低濃度HRW配制Table 1 Preparation of high concentration and low concentration HRW

1.3 電極法測定HRW中氫氣濃度

1.3.1電極極化 將氫氣微電極浸泡于ddH2O中，電極極化電壓設(shè)置為1 000 mV，隨后逐漸下降，并最終穩(wěn)定在某一數(shù)值，待此數(shù)值穩(wěn)定10 min以上后，電極極化結(jié)束，可以開始樣品檢測。電極極化時間一般需要1～2 h。

1.3.2樣品檢測 將500 μL不同濃度的HRW置于1.5 mL離心管中，將電極插入液面以下，待信號值穩(wěn)定后，記錄數(shù)據(jù)。

1.4 氣相色譜法測定HRW中氫氣濃度

1.4.1氣相色譜參數(shù)設(shè)定 采用恒線速度控制方法，恒線速度60 cm·s-1，使用SH-RtTM-Msieve 5A色譜柱，柱溫50 ℃，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，分流比為5∶1，壓力為200.2 kPa，柱流量為3.85 mL·min-1，檢測器為BID。

1.4.2可行性鑒定 為了鑒定利用氣相色譜法測定水相中氫氣濃度的可行性，利用99.999%的標(biāo)準(zhǔn)氫氣、氮?dú)?、氧氣?.9 mL氣相色譜瓶中配制混合氣體。按照1.4.1進(jìn)行參數(shù)設(shè)定，對混合氣體樣品進(jìn)行分離測定。

1.4.3平衡時間對于氣相色譜法測定結(jié)果的影響 平衡時間是指在一定條件下達(dá)到Henry平衡所需要的時間。由Henry平衡定律可知，在密閉空間中，當(dāng)密閉空間中氣液體積比大于2時可近似認(rèn)為液相中的氣體全部轉(zhuǎn)化到氣相中[21]。因而，按照1.4.1進(jìn)行參數(shù)設(shè)定，測定在37 ℃、500 r·min-1的條件下[20]達(dá)到Henry平衡所需要的時間。

1.4.4樣品檢測 將不同濃度的HRW置于1.9 mL氣相色譜瓶中，溶液總體系為500 μL。達(dá)到Henry平衡后[20-21]，采用頂空法手動進(jìn)樣1 mL。

1.5 方法檢出限及精確度分析

1.5.1電極檢出限的確定 取少量HRW，使1.5 mL離心管中HRW的濃度為預(yù)期方法檢出限(method detection limit，MDL)的1～5倍，按照1.3進(jìn)行測定。根據(jù)劉麗君等[11]的MDL測定方法，MDL的計算公式如下：

MDL=S×t(n-1,1-a=0. 99)

式中：n—重復(fù)測定樣品數(shù)；S—n次測定濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差；t—自由度為n-1時的 Student值；1-a—置信水平。

1.5.2氣相檢出限的確定 取少量HRW，使HRW的氫氣濃度為預(yù)期MDL的1～5倍，達(dá)到Henry平衡后，按照1.4進(jìn)行測定。計算方法同1.5.1。

1.5.3精確度計算 對于某一濃度樣品(在高、低濃度范圍內(nèi)隨機(jī)配制)平行測定9次，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差及變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 飽和HRW的制備

向100 mL ddH2O中通入氫氣(99.999%)，水相中氫氣的濃度隨著通氫氣時間的延長而增加，如圖1所示，在常溫常壓條件下，通氫氣20 min即可制得飽和HRW。

圖1 飽和HRW的制備Fig.1 Preparation of saturated HRW

2.2 電極法測定水相中氫氣濃度

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線 利用氫氣微電極分別測定高濃度HRW(0、0.324 0、0.648 0、0.972 0、1.296 0、1.620 0 mg·L-1)及低濃度HRW(0、0.040 5、0.081 0、0.121 5、0.162 0、0.202 5 mg·L-1)中氫氣的濃度。以水相中氫氣濃度為縱坐標(biāo)，以氫電極的信號值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖2A所示，高濃度HRW標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.001 402x-0.028 35，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999 8；如圖2B所示，低濃度HRW標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.001 580x-0.030 28，R2=0.999 7。因此，低濃度、高濃度HRW中，水相中氫氣濃度與氫氣微電極信號值之間均具有良好的線性關(guān)系。

圖2 氫電極法檢測水相中氫氣濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of detecting hydrogen concentration in HRW by hydrogen microsensor

2.2.2精確度分析及檢出限分析 利用氫氣微電極對某一高濃度(0.72 mg·L-1)、低濃度(0.012 mg·L-1)樣品進(jìn)行9次平行測定，對該測定方法進(jìn)行精確度分析，由表2可知在0～1.620 0 mg·L-1范圍內(nèi)，該方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.012 9 mg·L-1，變異系數(shù)為1.775 3%。結(jié)果表明該方法精確度較高，滿足水相中高濃度氫氣的測定要求。

表2 電極法檢測高濃度和低濃度HRW的精確度分析Table 2 Accuracy analysis of high concentration and low concentration HRW detection by hydrogen microsensor

由表2可知,在0～0.202 5 mg·L-1范圍內(nèi)，用電極法測定低濃度HRW的樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.001 3 mg·L-1，變異系數(shù)為11.734 0%。根據(jù)1.5中的公式，t(8,1-a=0. 99)=3.355 0，MDL=S×t(8,1-a=0.99)=0.004 4 mg·L-1。表明該方法精確度較高，滿足水相中低濃度氫氣的測定要求。

2.3 氣相色譜法測定水相中氫氣濃度

2.3.1方法可行性鑒定 采用頂空氣相色譜法對混合樣品進(jìn)行分離測定。如圖3所示，按照1.4.1設(shè)定儀器工作條件，氫氣、氧氣和氮?dú)饪梢酝耆蛛x，氫氣、氧氣和氮?dú)獾谋Ａ魰r間分別為(1.0±0.1)min、(1.4±0.1)min、(2.1±0.1)min。3.0 min之內(nèi)即可完成樣品的測定，是一種可以快速有效的分離測定氫氣濃度的方法。

圖3 氣相色譜檢測圖Fig.3 Mass spectrum of hydrogen gas analyzed by gas chromatogram

2.3.2平衡時間對于產(chǎn)氫的影響 為了確定HRW中氫氣完全從超純水中逸散的平衡條件，測定不同平衡時間下頂空中的氫氣濃度。如圖4所示，在37 ℃、500 r·min-1條件下平衡10 min即可達(dá)到Henry平衡。

圖4 不同平衡時間對氣相檢測氫氣濃度的影響Fig.4 The effect of equilibrium time on the detection of HRW by gas chromatogram

2.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線 利用氣相色譜分別測定高濃度HRW(0、0.324 0、0.648 0、0.972 0、1.296 0、1.620 0 mg·L-1)及低濃度HRW(0、0.040 5、0.081 0、0.121 5、0.162 0、0.202 5 mg·L-1)中氫氣的濃度。以HRW中氫氣的濃度為縱坐標(biāo)，以氣相色譜峰面積為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖5 A所示，高濃度HRW標(biāo)準(zhǔn)曲線性方程為y=1.642×10-6x-0.047 78，R2=0.996 2。如圖5B所示，低濃度HRW標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.961×10-6x-0.005 294，R2=0.999 7。因此，結(jié)果表明，低濃度、高濃度HRW中氫氣濃度與氣相色譜峰面積之間具有良好的線性關(guān)系。

2.3.4精確度分析 按照1.4.1設(shè)定儀器工作條件，對某一高濃度(0.72 mg·L-1)、低濃度(0.002 5 mg·L-1)樣品進(jìn)行9次平行測定，對測定結(jié)果進(jìn)行精確度分析。由表3可知，在0～1.620 0 mg·L-1范圍內(nèi)，該方法測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.052 0 mg·L-1，變異系數(shù)為7.694 5%。結(jié)果表明該方法精確度較高，滿足水相中高濃度氫氣的測定要求。

由表3可知，在0～0.202 5 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，該方法測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.000 3 mg·L-1，變異系數(shù)為9.926 7%。根據(jù)1.5中的公式，標(biāo)準(zhǔn)偏差S=0.000 3 mg·L-1，t(8,1-a=0. 99)=3.355 0，MDL=S×t(8,1-a=0. 99)=0.000 9 mg·L-1。表明該方法精確度較高，滿足水相中低濃度氫氣的測定要求。

圖5 氣相色譜法檢測HRW中氫氣濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of detecting hydrogen concentration in HRW by gas chromatogram

表3 氣相色譜檢測高濃度和低濃度HRW精密度分析Table 3 Accuracy analysis of high concentration and low concentrantion HRW detection by gas chromatogram

3 討論

本研究建立了使用氫氣微電極以及氣相色譜測定水相中氫氣濃度的方法。2種方法對于高濃度和低濃度HRW中氫氣的檢測均具有良好的線性關(guān)系。電極法測定高濃度、低濃度的HRW的變異系數(shù)分別為1.775 3%、11.734 0%，氣相色譜法測定高濃度、低濃度的HRW的變異系數(shù)分別為7.694 5%、9.926 7%，電極法及氣相色譜法的樣品方差均在12%以內(nèi)，因此2種方法均可以精確測定溶液中氫氣的濃度。

氣相色譜法對水相中氫氣濃度的MDL為0.000 9 mg·L-1，高于電極法的0.004 4 mg·L-1，表明氣相色譜法更適用于對水相中低氫氣濃度的測定。但是從檢測方式來看，電極法可以直接實(shí)時監(jiān)測水相中氫氣的濃度；氣相色譜法只能通過測定頂空氫氣進(jìn)而間接得到溶液中的氫氣濃度，無法實(shí)時監(jiān)測。從測定原理來看，電極法根據(jù)溶液中氧化還原電位的變化而測定溶液中氫氣的含量，由于生物樣本成分較為復(fù)雜，電極法的測定結(jié)果容易受到多種因素的干擾；而氣相色譜法是先將氫氣與其他物質(zhì)在色譜柱上進(jìn)行分離，再通過靈敏度高、重復(fù)性好的BID進(jìn)行分析，能夠?qū)崿F(xiàn)快速完成永久性氣體的檢測。綜上所述，對于需要實(shí)時監(jiān)測的樣品，使用氫微電極法較為合適；對于成分復(fù)雜或者氫氣濃度較低的樣品，則可優(yōu)先選擇氣相色譜法。