肺腺癌胸水標(biāo)本中PD-L1的蛋白表達(dá)與臨床病理特征及分子改變的相關(guān)性研究

馬海玥 賈佳 郭會芹 趙煥 王聰 趙琳琳 孫悅 李衛(wèi)華 張智慧

目前，肺癌是世界上發(fā)病率及死亡率均位居第一位的癌癥，且發(fā)病率逐年增高，其中非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）占85%[1]。近年來，免疫治療取得了長足的進(jìn)展，腫瘤誘導(dǎo)的特異性T細(xì)胞活化抑制，主要由抑制途徑介導(dǎo)，為程序性死亡蛋白受體1（programmed cell death protein 1, PD-1）或其配體程序性死亡配體1（programmed cell death ligand 1, PD-L1）相互作用的特異性抗體開辟了一種全新的治療選擇。在黑色素瘤、肺癌等多個(gè)瘤種的治療過程中取得了顯著療效，已被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于臨床治療。目前PD-L1的檢測可以依賴組織學(xué)標(biāo)本，但是部分肺腺癌患者就診時(shí)已經(jīng)處于晚期，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，文獻(xiàn)[2]報(bào)道大約50%以上肺癌患者隨著病情進(jìn)展出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，約15%患者初診時(shí)已有胸腔積液，漿膜腔積液是可獲得的形態(tài)學(xué)標(biāo)本來源之一。目前免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry,IHC）方法是一種重要的PD-L1檢測方法，免疫組織化學(xué)方法在細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中的應(yīng)用已經(jīng)有許多報(bào)道，尤其應(yīng)用細(xì)胞塊標(biāo)本的檢測也已經(jīng)成熟。應(yīng)用轉(zhuǎn)移灶的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本制作成細(xì)胞塊對PD-L1進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測，其結(jié)果能否應(yīng)用于臨床診斷中，目前國內(nèi)還未見報(bào)道。

本研究收集肺腺癌惡性胸水標(biāo)本，制作成細(xì)胞塊進(jìn)行PD-L1免疫細(xì)胞化學(xué)檢測，分析比較細(xì)胞塊石蠟切片和組織學(xué)檢測結(jié)果的一致性和差異性，以及細(xì)胞塊石蠟切片PD-L1表達(dá)與肺癌驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的相關(guān)性，探索細(xì)胞學(xué)標(biāo)本PD-L1檢測的可行性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集 選取2017年11月-2018年10月于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院就診的患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：①胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本；②細(xì)胞學(xué)診斷為肺腺癌，且經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)證實(shí)；③腫瘤細(xì)胞含量＞30%；④腫瘤細(xì)胞數(shù)＞100個(gè)。共收集符合條件的惡性胸水患者60例，其中男性28例，女性32例，中位年齡為55歲，共51例有影像學(xué)資料及完整治療過程。排除標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤細(xì)胞數(shù)量≤100個(gè)的患者及病例資料不完整者。

1.2 標(biāo)本的制備 將新鮮的胸腔積液靜置20 min-30 min，收集底部的沉淀液，將其放置在離心管中，離心處理10 min，轉(zhuǎn)速為2,500 r/min，傾其上清液后，加入少許血漿（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院血庫提供），后滴入相應(yīng)數(shù)量的凝血酶（長春雷允上藥業(yè)有限公司生產(chǎn)），快速攪拌形成凝塊。將凝塊置于貼有標(biāo)識的包埋盒后于10%中性福爾馬林液中固定。依次進(jìn)行脫水、包埋、切片。切片兩張，一張用于PD-L1染色，一張用于陰性對照。

1.3 免疫細(xì)胞化學(xué)

1.3.1 試劑與儀器 一抗為即用型SP263（Roche，羅氏公司，美國），二抗為羅氏OptiView DAB顯色系統(tǒng)。緩沖液、清洗液、免疫組化抗原修復(fù)液、蘇木素染色液和返藍(lán)染色液均為羅氏全自動(dòng)免疫組化儀的配套產(chǎn)品。BenchMark GX全自動(dòng)免疫組化儀為美國羅氏公司產(chǎn)品。

1.3.2 染色方法 將所需檢測試劑和輔助試劑放置在全自動(dòng)免疫組化儀試劑架上。將固定后的切片根據(jù)抗體的修復(fù)時(shí)間、孵育時(shí)間及溫度等不同在電腦中設(shè)定相應(yīng)的染色方案。通過電腦輸入一抗名稱，Ebar條碼打印機(jī)打出標(biāo)簽，分別貼在相應(yīng)玻片上。將玻片放入羅氏BenchMark GX全自動(dòng)免疫組化儀的相應(yīng)位置，其余步驟均由機(jī)器自動(dòng)操作。每組加入1張?zhí)ケP切片作為陽性對照。染色完成后取出玻片，用清洗液洗去緩沖液，經(jīng)95%乙醇和二甲苯脫水透明，封片。

1.4 高通量測序（next-generation sequencing, NGS）檢測 本實(shí)驗(yàn)使用基于雜交捕獲法的高通量NGS方法，對NSCLC相關(guān)腫瘤驅(qū)動(dòng)基因進(jìn)行基因變異檢測，包括表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）、Kirsten鼠肉瘤病毒癌基因（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog,KRAS）、間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）、ROS1（c-ros oncogene 1 receptor tyrosine kinase）、間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化因子（mesenchymalepithelial transition factor,MET）、鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1,BRAF），檢測的基因變異類型包括基因的點(diǎn)突變、插入及缺失、擴(kuò)增，另外還包括ALK、ROS1的融合狀態(tài)。檢測平臺為Illumina NextSeq 50操作流程按照說明書進(jìn)行，流程同參考文獻(xiàn)[3]。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果評價(jià) 免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，在顯微鏡下評價(jià)PD-L1染色得分。腫瘤比例評分（tumor proportion score, TPS）指腫瘤細(xì)胞中染色陽性的細(xì)胞比例。本實(shí)驗(yàn)將1%≤TPS＜50%，TPS≥50%作為陽性表達(dá)區(qū)間進(jìn)行分析[4]。由兩名有經(jīng)驗(yàn)的細(xì)胞病理醫(yī)師獨(dú)立判讀，任何不一致的結(jié)果均重新評價(jià)得到共識。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

60例胸水細(xì)胞學(xué)肺腺癌標(biāo)本，PD-L1陽性表達(dá)的有35例，陽性表達(dá)率為58.3%；腫瘤細(xì)胞PD-L1的陽性表達(dá)數(shù)目1%-49%為20例，陽性率為33.3%；腫瘤細(xì)胞PD-L1的陽性表達(dá)數(shù)目≥50%為15例，陽性率為25.0%，見圖1。60例標(biāo)本的臨床特征見表1，由表1可見，PD-L1的陽性表達(dá)率與研究人群的年齡、性別、是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及是否進(jìn)行放化療或靶向治療無相關(guān)性（P＞0.05）。

本院應(yīng)用術(shù)后組織學(xué)標(biāo)本57例，抗體為sp263檢測PD-L1的表達(dá)，有19例表達(dá)陽性，陽性表達(dá)率為33.3%，見圖1。

60例患者中26例用高通量雜交捕獲法同時(shí)進(jìn)行了NGS，其中21例（80.1%）有遺傳變異。發(fā)現(xiàn)12例PD-L1表達(dá)陽性的患者中，有5例發(fā)生了EGFR基因突變，其中第19號外顯子突變3例，第21號外顯子突變2例，PD-L1表達(dá)與EGFR基因突變無相關(guān)性（P=0.233＞0.05），見圖2。另外14例PD-L1表達(dá)陰性的病例中，有10例發(fā)生了EGFR基因突變，其中第19號外顯子突變5例，第21號外顯子突變5例。KRAS及MET基因突變例數(shù)各3例，PD-L1全部表達(dá)陽性，而且表達(dá)均為TPS≥50%強(qiáng)陽性。2例BRAF突變的患者，PD-L1表達(dá)均為陰性，2例ROS1基因融合患者中，PD-L1表達(dá)陰性及陽性各1例。3例ALK基因融合患者中，有PD-L1陽性表達(dá)2例。KRAS、ROS1、BRAF、MET及ALK基因異常由于病變例數(shù)少，無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。EGFR、KRAS、ROS1、BRAF、MET及ALK基因異常情況與PD-L1表達(dá)關(guān)系見表2。

3 討論

采用TPS方法評價(jià)得分，本研究肺腺癌胸水細(xì)胞塊組中免疫細(xì)胞化學(xué)PD-L1檢測總陽性率為58.3%，應(yīng)用同種抗體美國羅氏SP263，本院組織學(xué)標(biāo)本的一組數(shù)據(jù)顯示肺腺癌PD-L1總陽性率為33.3%[5]。兩組數(shù)據(jù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.07＞0.05）。但胸水細(xì)胞塊標(biāo)本的陽性率明顯高于手術(shù)后組織學(xué)標(biāo)本，其結(jié)果與文獻(xiàn)[6]報(bào)道相符。Heymann等[6]報(bào)道，在40例細(xì)胞學(xué)標(biāo)本和76例組織學(xué)標(biāo)本非一對一PD-L1免疫組織化學(xué)檢測中，陽性表達(dá)率分別為39%、25%（P=0.083），與72例小活檢標(biāo)本的陽性表達(dá)率比較無明顯差異（39%vs23%;P=0.094）。同樣，Bratton等[7]也有相似的研究結(jié)果，他們對12例腺癌細(xì)胞學(xué)標(biāo)本和12例腺癌組織學(xué)標(biāo)本非一對一PD-L1免疫組織化學(xué)檢測，其陽性表達(dá)率分別為67%、50%。Noll等[8]研究表明41例細(xì)胞學(xué)涂片或細(xì)胞塊與同例組織學(xué)標(biāo)本一對一PD-L1免疫組織化學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)僅有1例標(biāo)本兩者結(jié)果不一致，細(xì)胞塊表達(dá)陽性，而組織學(xué)標(biāo)本表達(dá)為陰性。Rehman等[9]報(bào)道，在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室用同一型號的抗體在同一瘤體內(nèi)不同蠟塊的切片中PD-L1檢測出現(xiàn)不同的表達(dá)結(jié)果，由此表明同一瘤體內(nèi)存在著細(xì)胞的異質(zhì)性。

表1 PD-L1的表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系Tab 1 The relationship between the expression of PD-L1 and the clinicopathological features of the patients

圖1 PD-L1在細(xì)胞學(xué)及組織學(xué)標(biāo)本中的IHC表達(dá)結(jié)果。A：PD-L1免疫細(xì)胞化學(xué)表達(dá)結(jié)果呈陰性（DAB染色，×400）；B：PD-L1免疫細(xì)胞化學(xué)表達(dá)結(jié)果呈陽性，陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)目＜50%（DAB染色，×400）；C：PD-L1免疫細(xì)胞化學(xué)表達(dá)結(jié)果呈強(qiáng)陽性，陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)目≥50%（DAB染色，×400）；D：手術(shù)后組織學(xué)標(biāo)本，PD-L1免疫組織化學(xué)表達(dá)結(jié)果呈陽性（DAB染色，×400）。Fig 1 PD-L1 IHC expression in cytology and surgical specimens.A: 1 representative cytology case with negative PD-L1 expression (DAB staining,×400); B: 1 representative cytology case with positive PD-L1 expression (≥1% but ＜50%) (DAB staining, ×400); C: 1 representative cytology case with high PD-L1 expression (≥50%) (DAB staining, ×400); D: PD-L1 expression positive in representative surgical specimens (DAB staining, ×400).IHC: immunohistochemistry.

圖2 胸水細(xì)胞塊HE染色及高通量二代測序突變結(jié)果。A：胸水細(xì)胞塊HE染色（×400）；B：ALK基因的高通量二代測序突變結(jié)果；C：EGFR基因的高通量二代測序第19號外顯子突變結(jié)果；D：EGFR基因的高通量二代測序第21號外顯子突變結(jié)果。Fig 2 HE staining of pleural effusion cell block and mutation results by NGS.A: pleural effusion cell block (HE staining, ×400); B: 1 representative cytology case with ALK translocations by NGS; C: 1 representative cytology case with EGFR exon 19 mutations by NGS; D: 1 representative cytology case with EGFR exon 21 mutations by NGS.EGFR: epidermal growth factor receptor; NGS: next-generation sequencing; ALK: anaplastic lymphoma kinase.

表2 PD-L1表達(dá)與NGS檢測中基因異常結(jié)果的關(guān)系Tab 2 The relationship between the expression of PD-L1 and the molecular alterations of NGS

細(xì)胞學(xué)標(biāo)本比組織學(xué)標(biāo)本PD-L1免疫組織化學(xué)陽性表達(dá)率高的另一個(gè)原因可能是原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶問題[10]。胸腹水標(biāo)本來自肺腺癌晚期患者發(fā)生廣泛轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本，組織學(xué)標(biāo)本大多來源于手術(shù)患者的原發(fā)灶，不能確定是否PD-L1表達(dá)的腫瘤細(xì)胞惡性程度更高，更具有侵襲性，更容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致幾項(xiàng)研究結(jié)果[6-8]均表明，細(xì)胞學(xué)標(biāo)本PD-L1檢測的陽性表達(dá)率高于組織學(xué)標(biāo)本。但采集標(biāo)本間隔時(shí)間長短是否影響PD-L1表達(dá)，以及放化療、靶向治療等治療手段是否會造成同一患者不同時(shí)期標(biāo)本表達(dá)的差異還有待研究。

本研究有26例用高通量二代測序雜交捕獲法同時(shí)檢測了EGFR、KRAS、ROS1、BRAF、MET及ALK基因異常情況，15例有EGFR基因突變的病例中有5例PD-L1表達(dá)陽性，PD-L1表達(dá)與EGFR基因突變無相關(guān)性（P=0.233＞0.05）。同時(shí)也未發(fā)現(xiàn)EGFR基因第19號外顯子突變與第21號外顯子突變的患者與PD-L1表達(dá)存在差異。本研究中雖然KRAS及MET基因突變的病例PD-L1表達(dá)均為陽性，但是KRAS僅3例，MET僅3例，由于病變例數(shù)少，無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。美國的研究[11]表明PD-L1表達(dá)與KRAS突變具有顯著相關(guān)性，但是與其他突變基因未見相關(guān)性。他們發(fā)現(xiàn)190例接受NGS基因檢測的病例中74例（38.9%）伴有遺傳變異，其中KRAS突變56例，KRAS突變率為29.5%。他們的結(jié)果顯示有遺傳改變的病例PD-L1陽性表達(dá)的病例數(shù)明顯高于無遺傳改變的病例數(shù)。PD-L1表達(dá)水平僅在KRAS突變組和無KRAS突變組之間有顯著差異（78%vs40%）。目前，美國食品和藥物管理局已批準(zhǔn)免疫調(diào)節(jié)療法作為晚期NSCLC患者的二線藥物，但是對于無EGFR突變或ALK重排的患者當(dāng)PD-L1表達(dá)＞50%時(shí)可以作為NSCLC患者的一線藥物應(yīng)用于臨床[12]?；赑D-L1表達(dá)與PD-1/PD-L1抑制劑臨床療效具有顯著相關(guān)性的數(shù)據(jù)，2018年美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network, NCCN）指南已經(jīng)將PD-L1列為NSCLC患者的推薦常規(guī)檢測對象，建議結(jié)合PD-L1表達(dá)狀態(tài)進(jìn)行治療選擇[13]。腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá)目前被認(rèn)為是抗PD-1/PD-L1治療的優(yōu)勢人群選擇的最合理標(biāo)志物，PD-1/PD-L1抑制劑的療效與PD-L1表達(dá)水平密切相關(guān)，PD-L1表達(dá)水平越高，治療有效的機(jī)會將大大增加，但目前檢測PD-L1表達(dá)所采用的檢測平臺、抗體、評價(jià)方法的體系均有所不同，使得PD-L1檢測存在缺乏一致性與檢測金標(biāo)準(zhǔn)的缺陷，仍需進(jìn)一步探索。由于細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的敏感性高，可能部分組織學(xué)標(biāo)本PD-L1表達(dá)陰性患者也可能在轉(zhuǎn)移灶的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中有PD-L1的表達(dá)，可以應(yīng)用PD-L1免疫抑制劑進(jìn)行治療。因此，細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的高敏感性更加有助于晚期肺腺癌患者從PD-L1抑制劑的治療中獲益。

總之，肺腺癌胸水細(xì)胞學(xué)標(biāo)本可以協(xié)助PD-L1的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測，有助于肺腺癌晚期患者應(yīng)用PD-L1抑制劑進(jìn)行治療。