過氧化物酶體增殖物激活受體γ激動劑對食管鱗癌化療敏感性影響的研究

吳 愷，何宏博，張 澎，曾 誠，劉東雷，趙 松

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院胸外科，河南 鄭州 450052)

據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計報道，在世界范圍內(nèi)食管癌發(fā)病率高居惡性腫瘤第7位，死亡率高居第6位[1]。其中食管鱗癌是食管癌的主要病理類型[2]。目前，以順鉑為基礎的聯(lián)合化療仍是食管鱗癌患者最為常見的化療方案，但對順鉑化療的不敏感是食管鱗癌患者治療失敗的主要原因，嚴重威脅患者的生命健康，影響預后[3-4]。因此，提高食管鱗癌的順鉑化療敏感性，可提高提高食管鱗癌的臨床治療效果，改善預后。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ (peroxisome proliferator activated receptor γ，PPAR-γ)是Ⅱ型核激素受體超家族的一類由配體激活的核轉錄因子[5]。通常與視黃素X受體形成異二聚體并招募共抑制蛋白復合物與之結合，進而抑制靶基因的轉錄；此外，也可與配體結合激活，釋放共抑制蛋白并結合輔激活蛋白，與所調節(jié)基因的啟動子上游因子結合從而對靶基因的轉錄進行調控，發(fā)揮生物學功能[6]。研究[7]報道，PPAR-γ可通過調控脂肪和糖代謝、能量平衡、炎癥反應等抗肝纖維化、抗動脈粥樣硬化、改善心衰、抗腫瘤等。

據(jù)研究[8]報道，在多種腫瘤細胞中均存在PPAR-γ的表達，經(jīng)配體激活后，PPAR-γ可抑制結腸癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌等多種腫瘤細胞的生長。有研究[9]報道PPAR-γ在食管癌和肺癌中的表達顯著降低，經(jīng)配體激活后可通過多種途徑誘導腫瘤細胞凋亡。此外，還有研究[10-11]發(fā)現(xiàn)PPAR-γ激動劑可顯著增強5-Fu對人結腸癌化療的敏感性。這些研究結果均提示PPAR-γ在不同腫瘤中的功能具有多樣性。但目前有關PPAR-γ在食管鱗癌化療敏感性中的作用仍無報道。基于此，闡明PPAR-γ在順鉑耐藥的食管鱗癌中的生物特性、對順鉑化療敏感性的影響，可為其作為靶點應用于食管鱗癌的綜合治療奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑食管鱗癌EC109細胞購自上海生物科學院細胞庫；順鉑、羅格列酮購自美國Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；MTT試劑盒均購自美國Thermo公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。

1.2 細胞系及培養(yǎng)采用體積分數(shù)10%胎牛血清、質量分數(shù)1%雙抗(青霉素/鏈霉素)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)EC109細胞，在37 ℃恒溫、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)期狀態(tài)良好的細胞用于實驗。

1.3 MTT法檢測細胞增殖取生長良好的處于對數(shù)期的EC109細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL(約1×104個細胞)。另設對照組、羅格列酮組(5、10、20、40 μmol/L)、順鉑組(10 μmol/L)、羅格列酮聯(lián)用順鉑組，分別于24、48、72 h后收集細胞，每孔加入15 μL MTT溶液[用磷酸鹽緩沖液(PBS)配成5 g/L]避光培養(yǎng)4 h，棄去96孔板中培養(yǎng)基，每孔加150 μL二甲亞砜，振蕩10 min，37 ℃環(huán)境中放置30 min，酶標儀測定570 nm處每孔吸光度值。計算細胞存活率，實驗重復3次。

1.4 細胞周期分布檢測細胞經(jīng)處理48 h后，收集細胞并用PBS洗滌1次，沉淀用預冷的體積分數(shù)70%乙醇固定過夜。離心去除固定液并用PBS洗滌1次，調整細胞密度為1×106個/mL，加入核糖核酸酶(0.25 g/L)，37 ℃水浴30 min，加入碘化丙啶染色液至終濃度為20 mg/L，室溫避光染色10 min，用流式細胞儀檢測細胞周期變化。

1.5 荷瘤裸小鼠模型的建立及分組BALB/c，nu/nu裸小鼠，雌性，4～5周齡，體質量18～20 g，購自北京維通利華有限公司，SPF級條件下進行適應性飼養(yǎng)1周。將處于對數(shù)生長期的EC109細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，離心去上清洗滌，再用培養(yǎng)基洗滌，制備成細胞懸液(1×107個/mL)，于裸小鼠后背右側皮下進行腫瘤細胞接種(200 μL，2×105個細胞)。

接種完食管鱗癌細胞約12 d后即可形成腫瘤。將24只EC109細胞移植瘤荷瘤裸小鼠隨機分為4組：對照組、羅格列酮組(3 mg/kg)、順鉑組(6 mg/kg)、羅格列酮(3 mg/kg)聯(lián)合順鉑(6 mg/kg)組。采用灌胃給藥，連續(xù)每天給藥2周，給藥量約0.2 mL，對照組給予相同體積的生理鹽水。

1.6 荷瘤裸小鼠腫瘤結節(jié)生長的測定分別于治療后的第0、4、8、12和16天精密測量腫瘤結節(jié)的最長徑(a)和最短徑(b)，根據(jù)公式計算腫瘤體積V=1/6 π(ab2)，取得均值繪制腫瘤生長曲線。于第18天處死裸鼠，精密稱量腫瘤質量，計算腫瘤生長抑制率。腫瘤生長抑制率=(對照組腫瘤平均瘤質量-實驗組腫瘤平均瘤質量)/對照組腫瘤平均瘤質量×100%。

2 結果

2.1 羅格列酮、順鉑、羅格列酮聯(lián)合順鉑對EC109細胞的抑制作用羅格列酮可顯著增強順鉑對EC109細胞的抑制作用，并呈現(xiàn)時間和劑量依賴性。見圖1。

圖1 羅格列酮、順鉑、羅格列酮聯(lián)合順鉑對EC109細胞的抑制作用

2.2 羅格列酮、順鉑、羅格列酮聯(lián)合順鉑對EC109細胞細胞周期的影響細胞周期分布分析結果顯示羅格列酮聯(lián)合順鉑使EC109細胞S期細胞顯著增多。見表1。

表1 羅格列酮、順鉑、羅格列酮聯(lián)合順鉑對EC109細胞細胞周期的影響 %

2.3 羅格列酮、順鉑、羅格列酮聯(lián)合順鉑對EC109細胞移植瘤荷瘤裸小鼠腫瘤的影響羅格列酮、順鉑、羅格列酮聯(lián)合順鉑對EC109細胞裸鼠移植瘤的抑制率分別為40.21%、52.84%、75.22%。羅格列酮聯(lián)合順鉑組小鼠腫瘤體積顯著減小。見圖2、表2。

表2 羅格列酮、順鉑、羅格列酮聯(lián)合順鉑對EC109細胞移植瘤荷瘤裸小鼠腫瘤質量和生長抑制率的影響

圖2 羅格列酮、順鉑、羅格列酮聯(lián)合順鉑對EC109細胞移植瘤荷瘤裸小鼠腫瘤生長曲線的影響

3 討論

化療是食管癌的重要基礎治療手段，順鉑目前是臨床治療食管鱗癌的常規(guī)一線化療藥物[2]。但許多患者在應用以順鉑為基礎的傳統(tǒng)化療方案后對順鉑不敏感，復發(fā)率高，易產(chǎn)生耐藥性，進一步造成食管鱗癌患者的化療失敗和死亡[3]。研究[4]報道，食管癌患者對順鉑的不敏感是一個多因素、多機制參與的復雜過程，主要與多藥耐藥轉運蛋白、微管蛋白、熱休克蛋白等密切相關。但食管鱗癌耐藥的機制仍未完全闡釋清楚。而將不同作用機制的化療藥物聯(lián)合應用可能能提高食管鱗癌的化療效果，增加其對順鉑的敏感性。

PPAR-γ作為PPARs家族的一種核轉錄因子，與相應配體結合后可誘導或抑制靶基因的表達[12]。據(jù)研究[13]報道，在結腸癌、乳腺癌、肺癌及多種消化道腫瘤中PPAR-γ均有表達。PPAR-γ可通過阻滯細胞周期、誘導腫瘤細胞分化或凋亡等抑制其生長。Liang等[14]研究報道乳腺癌患者中，高表達PPAR-γ者疾病無進展生存期更長。而在非小細胞肺癌細胞系中，PPAR-γ活化可致腫瘤細胞分化并誘導其凋亡[15]。此外，Ogino等[16]報道PPAR-γ的表達水平與結腸癌患者的臨床預后呈正相關，PPAR-γ可作為結腸癌治療效果的靶點。上述研究提示，PPAR-γ下調可能為腫瘤細胞耐藥的機制之一。但PPAR-γ在食管癌化療敏感性中的作用報道極少。

本研究分別從細胞水平、動物水平探討過PPAR-γ激動劑羅格列酮對食管癌化療敏感性的影響。結果表明：羅格列酮可顯著增強順鉑對EC109細胞的抑制作用，并呈現(xiàn)時間和劑量依賴性。細胞周期分布分析結果顯示羅格列酮聯(lián)合順鉑可使EC109細胞S期細胞顯著增多。羅格列酮、順鉑、羅格列酮聯(lián)合順鉑對EC109細胞裸鼠移植瘤的抑制率分別為40.21%、52.84%、75.22%羅格列酮聯(lián)合順鉑組小鼠腫瘤體積顯著減小。以上結果表明羅格列酮聯(lián)合順鉑可顯著提高食管癌化療敏感性。

綜上所述，PPAR-γ激動劑羅格列酮能夠顯著增強順鉑對食管癌的化療敏感性，其機制主要與S期細胞周期阻滯有關。本研究結果可為提高食管癌的臨床治療效果奠定理論和實驗基礎。