傘骨草利尿抗炎活性及急性毒性研究＊

呂 濤，吳德松，鄭春麗，胡 疆，蔡 建，張榮豪 ，黃先健 ，施曉東 ＊＊

（1. 曲靖師范學院生物資源與食品工程學院 曲靖 655011；2. 曲靖師范學院云南高原生物資源保護與利用研究中心曲靖 655011；3. 云南省藥物研究所 昆明 650111；4. 曲靖師范學院文化旅游學院 曲靖 655011）

高血壓、水腫脹和炎癥是臨床上常見疾病，并伴隨有多種并發(fā)癥。利尿藥能使電解質和水分排出，同時使血容量減少，心臟血液輸出量下降，血壓下降。利尿類藥可促進腎臟排出溶質及水而增加尿量，能治療心、肝、腎等疾病所引起的水腫，與降壓藥聯(lián)合使用治療高血壓，在臨床上被廣泛應用[1-5]。炎癥是機體對損傷因子所產生的正常防御反應過程，有研究發(fā)現(xiàn)炎癥與多種疾病的形成有關。非甾體抗炎藥、抗生素、維生素等均可以有效治療炎癥及其并發(fā)癥。然而，長期使用一些西藥用于治療水腫脹、高血壓、炎癥以及相關的疾病對人體有多種毒副作用。近年來，有關傳統(tǒng)中醫(yī)藥通過整體論治、辨證論治、調節(jié)患者全身免疫狀況等手段，對水腫脹、高血壓和炎癥性疾病的治療在臨床上也取得了顯著療效，且因其副作用小、藥效持久而受到患者的青睞[6-9]。

傘骨草（Eleusine indica（L.）Gaertn.）為一年生草本，根系極發(fā)達，稈葉強韌，全株可作飼料，又為優(yōu)良保土植物。分布于中國南北各省區(qū)及全世界溫帶和熱帶地區(qū)，多生于荒蕪之地及道路旁，全世界溫帶和熱帶地區(qū)也有分布。《中華本草》記載全草煎水服，可防治乙型腦炎[10]?！兜崮媳静荨分杏涊d：傘骨草氣息甜美，主治健脾，利水通淋，婦人白帶，煎湯服之最良[11]。民間常用于治療水腫脹、炎癥等癥狀。鑒于此，作者對傘骨草進行了大量的文獻資料查閱，發(fā)現(xiàn)目前國內外對傘骨草的研究還比較少，故對傘骨草水提取物進行抗炎、利尿活性研究及初步的安全性評價，為其進一步開發(fā)利用提供藥效學研究基礎。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

健康 SPF 級 KM 小鼠，全雌性，體質量 18-22 g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（粵）2008-0002。

健康 SPF 級 SD 大鼠，180-220 g，由遼寧長生生物技術有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（遼）2015-0001，發(fā)證單位：遼寧省科學技術廳。

1.2 樣品制備

取傘骨草藥材打粉，用蒸餾水提取3 次，合并濾液，濾液減壓濃縮，真空干燥，粉碎，得到干浸膏，常溫干燥密封保存。

1.3 儀器與試劑

電子分析天平購于梅特勒-托利多公司（型號：AG-285）、普通電子天平購于常熟市雙杰測試儀器廠（型號：JJ200）、全自動生化分析儀購于貝克曼庫爾特公司（型號：AU5800）、電解質分析儀購于希萊恒有限公司（型號：IMS-972）、YLS-7B 足趾容積測量儀購于濟南益延科技發(fā)展有限公司公司、二甲苯購于上海久億化學試劑有限公司（批號：批號：20090837）、呋塞米片購于天津力生制藥股份有限公司（批號：1509049）、角叉菜膠購于美國Sigma公司（批號：C10103），阿司匹林購于拜耳醫(yī)藥保健有限公司（批號：BJ32905）。

2 實驗方法

2.1 利尿實驗[12，13]

取預選試驗中排尿功能合格的小鼠60只，隨機分為5組，每組12只，雌雄對半，分別為正常組（給藥0.5%羧甲基纖維素鈉溶液）、陽性藥物組（給藥10 mg·kg-1的呋塞米，以下簡稱陽性藥組）、傘骨草水提取物低劑量組（0.75 g·kg-1）、傘骨草水提取物中劑量組（1.5 g·kg-1）、傘骨草水提取物高劑量組（3.0 g·kg-1），連續(xù)給藥7天，實驗前禁食不禁水12 h，以減少糞便的干擾[5]。末次給藥30 min 后，各組小鼠按20 mL·kg-1體質量，用生理鹽水灌胃，造成水負荷模型，實驗開始時先輕壓動物下腹，排盡余尿。分別收集小鼠1、2、3、4，5、6 h 的尿液，測定尿液體積，并將其凍存于-20℃冰箱中。

2.2 尿液中離子濃度的測定

用上述實驗中的尿液作為樣品，采用電解質分析儀分別檢測小鼠尿液中的離子的濃度。

2.3 血清中糖原、尿素氮和肌酐的測定

用2.1 的方法給與小鼠藥物，取血前小鼠禁食不禁水12 h，然后眼眶取血于1.5 mL離心管內，37℃溫箱中靜置約1 h，然后置于離心機內以3000 r·min-1離心15 min，用移液槍吸出分離的血清，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫捎萌詣由治鰞x分別檢測小鼠血清中糖原、尿素氮和肌酐的變化。

2.4 傘骨草對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

取SPF級雄性KM小鼠60只，按體質量隨機分為5組，每組12只，分別為：溶媒對照組（給予生理鹽水，等容積）、陽性藥物組（給藥0.4 g·kg-1的阿司匹林）、傘骨草水提取物低劑量組（0.75 g·kg-1）、傘骨草水提取物中劑量組（1.5 g·kg-1）、傘骨草水提取物高劑量組（3.0 g·kg-1），每組灌胃給藥，每天1 次，連續(xù)給藥7 天，各組于末次給藥60 min 后，將小鼠右側耳廓涂抹二甲苯0.05 mL造致炎模型模，造模60 min 后，頸椎脫臼處死小鼠，剪下雙耳，用6 mm 打孔器分別在同一部位打下耳圓片，用分析天平稱重。計算小鼠耳腫脹度和耳廓腫脹抑制率。公式如下：

小鼠耳腫脹度Δm=右耳片重量-左耳片重量

耳廓腫脹抑制率I（%）=（生理鹽水組平均腫脹度- 給藥組平均腫脹度）/生理鹽水組平均腫脹度×100%。

2.5 傘骨草對角叉菜膠所致大鼠足趾腫脹的影響

取SPF 級雄性SD 大鼠50 只，按體質量隨機分為5組，每組10只，分別為：溶媒對照組（給予生理鹽水，等容積）、陽性藥物組(給藥0.4 g·kg-1的阿司匹林)、傘骨草水提取物低劑量組（0.75 g·kg-1）、傘骨草水提取物中劑量組（1.5 g·kg-1）、傘骨草水提取物高劑量組（3.0 g·kg-1），每組灌胃給藥，每天 1 次，連續(xù)給藥 7 天，各組于末次給藥60 min 后，給每只大鼠右后足趾皮下注射1%角叉菜膠 0.1 mL，于注射后0.5、1、2、4、6 h 分別測定各鼠右后足趾容積，比較各組大鼠致炎后不同時間右后足趾腫脹度和足趾腫脹抑制率。

足趾腫脹度Δm=致炎后足趾容積-致炎前足趾容積

足趾腫脹抑制率I（%）=（模型組平均足腫脹度-給藥組平均足腫脹度）/模型組平均足腫脹度×100%。

2.6 急性毒性實驗

圖1 傘骨草各劑量組對小鼠排尿量影響（，n=12）

參考文獻[13]方法，將70 只KM 小鼠隨機分為7 組，即溶媒對照組(純水)和傘骨草水提物17.30，14.71，12.49，10.62，9.03和7.67 g·kg-1劑量組，每組10只，雌雄各半。禁食不禁水約12 h后，各劑量組均以40 mL·kg-1灌胃給予傘骨草水提物不同濃度溶液1 次，陰性對照組同法給予純水1 次。給藥當天連續(xù)觀察4 h 動物出現(xiàn)的各種毒性反應、癥狀及死亡情況，以后每天觀察1次，連續(xù)14天;于給藥第3、7、14天稱量體質量；觀察結束后處死動物，大體解剖觀察各組動物臟器、器官的體積、顏色、質地等有無明顯異常。采用Bliss 法計算傘骨草水提物小鼠急性毒性的LD50及95%可信限。

2.7 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 傘骨草對小鼠尿液量的影響

傘骨草水提取物對KM 小鼠的排尿量的影響見圖1。結果顯示，與空白組比較，在1 h 內，傘骨草水提物低、中、高劑量組（0.75、1.5、3.0 g·kg-1）小鼠排尿量明顯增加（P＜ 0.05、P＜ 0.01、P＜ 0.01）；在 2 h、3 h 內，中、高劑量組（1.5、3.0 g·kg-1）小鼠排尿量明顯增加（P＜ 0.05、P＜ 0.01）；在4 h、5 h、6 h 內，中、高劑量組（1.5、3.0 g·kg-1）小鼠排尿量明顯增加（P＜ 0.05、P＜0.05），實驗結果表明，傘骨草水提物對能增加KM 小鼠的排尿量，且高劑量組效果最佳。

3.2 傘骨草對小鼠尿液中鉀、鈉、氯、鈣離子濃度的影響

收集給藥后6 h 的總尿液，對尿液中的離子濃度進行測定，結果顯示，與對照組相比，陽性藥能顯著增加K+、Cl-和Ca2+的排出量（P＜ 0.01），顯著增加Na+排出量（P＜ 0.05）；傘骨草低、中、高劑量能顯著增加K+、Cl-的排出量（P＜0.01），；傘骨草高劑量能顯著增加Na+、Ca2+的排出量（P＜0.05）；傘骨草各劑量對小鼠尿液的pH均無顯著影響（P＞0.05）。說明傘骨草水提物在發(fā)揮利尿作用的同時，對K+、Na+、Cl-、Ca2+等離子濃度有一定的影響，其利尿作用可能與NaCl等電解質的重吸收有關，從而增加利尿作用（表1）。

3.3 傘骨草對小鼠血清中糖原、尿素氮、肌酐的影響

給藥7 天后，對小鼠血清中糖原、尿素氮、肌酐進行檢測，結果顯示，與對照組相比，陽性藥對小鼠血清中的糖原、尿素氮、肌酐均無明顯影響（P＞0.05）；傘骨草低、中、高各劑量對小鼠血清中的糖原、尿素氮、肌酐均無明顯影響（P＞0.05）。結果表明，傘骨草水提物在發(fā)揮利尿作用的同時，對糖原代謝和腎臟功能沒有明顯損傷，毒副作用較?。ū?）。

表1 傘骨草各劑量對小鼠尿液離子濃度的影響（，n = 12）

表1 傘骨草各劑量對小鼠尿液離子濃度的影響（，n = 12）

注：與溶媒對照組相比，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01

離子濃度/（mmol·L-1）Ca2+0.7±0.4 1.2±0.3**0.6±0.2 0.8±0.4 1.0±0.2*組別溶媒對照組呋塞米（10 mg·kg-1）傘骨草低（0.75 g·kg-1）傘骨草中（1.5 g·kg-1）傘骨草高（3.0 g·kg-1）pH 6.1±0.2 6.4±0.5 6.1±0.3 6.1±0.3 6.2±0.6 K+29.0±3.1 34.9±6.9**46.5±8.1**61.8±8.1**88.4±7.6**Na+81.3±27.3 107.7±17.9*82.0±24.4 93.0±20.9 107.2±18.4*Cl-128.0±9.9 106.4±7.4**208.3±39.3**369.2±51.0**802.8±133.1**

表2 傘骨草各劑量對小鼠血清中糖原、尿素氮、肌酐的影響（，n = 12）

表2 傘骨草各劑量對小鼠血清中糖原、尿素氮、肌酐的影響（，n = 12）

注：與溶媒對照組相比，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01

肌酐/（ummol·L-1）15.48±4.43 18.96±7.11 16.42±5.11 12.29±4.75 12.89±3.64組別溶媒對照組呋塞米（10 mg·kg-1）傘骨草低（0.75 g·kg-1）傘骨草中（1.5 g·kg-1）傘骨草高（3.0 g·kg-1）糖原/（mmol·L-1）7.64±1.44 7.57±0.95 7.55±1.28 6.75±1.54 8.23±1.04尿素氮/（mmol·L-1）7.55±1.86 8.82±1.87 6.57±1.02 6.92±0.67 6.54±0.16

表3 傘骨草各劑量對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響（，n = 12）

表3 傘骨草各劑量對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響（，n = 12）

注：與溶媒對照組相比，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01

腫脹抑制率/%-32.50 10.50 15.44 20.25組別溶媒對照組阿司匹林傘骨草低傘骨草中傘骨草高劑量/（g·kg-1）-0.4 0.75 1.5 3.0腫脹度13.33±1.63 9.00±2.79 11.93±2.02 11.28±2.50*10.63±2.24**

3.4 傘骨草對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響

給藥7 天后，對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹進行檢測，結果顯示，與溶媒對照組相比，傘骨草中劑量對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹具有明顯的抑制作用（P＜0.05），傘骨草高劑量對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹具有明顯的抑制作用（P＜ 0.01）（表3）。結果表明，傘骨草水提物對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹具有明顯的抑制作用。

3.5 傘骨草對角叉菜膠所致大鼠足趾腫脹的影響

給藥7 天后，對角叉菜膠所致大鼠足趾腫脹進行檢測，結果顯示，與溶媒對照組相比，傘骨草中劑量對角叉菜膠所致大鼠足趾腫脹具有明顯的抑制作用（P＜0.05），傘骨草高劑量對角叉菜膠所致大鼠足趾腫脹具有明顯的抑制作用（P＜0.05），與陽性藥相比抑制效果稍弱；造模4 h后足趾腫脹度達到最大，6 h后足趾腫脹度開始下降（表4、表5）。結果表明，傘骨草水提物角叉菜膠所致大鼠足趾腫脹具有明顯的抑制作用。

3.6 急性毒性試驗

傘骨草水提物24 h內小鼠單次灌胃給藥急性毒性試驗的LD50為：12.33 g·kg-（1相當于生藥82.15 g·kg-1），為本次實驗所用高、中、低劑量的4倍、8倍、16倍，95%的可信限為 11.90 g·kg-1-17.16 g·kg-1。給藥后 15 min出現(xiàn)毒性反應。動物在4 h 內出現(xiàn)的毒性反應，主要表現(xiàn)為腹瀉、俯臥、豎毛、運動失調、死亡（表6）。腹瀉至給藥第2 天恢復，死亡小鼠解剖情況：肺充血。給藥后第3、7、14天給小鼠稱重，各組小鼠體質量均持續(xù)增長，與溶媒對照組比較，傘骨草水提物組小鼠體質量均無顯著性差異（P＞0.05），結果見表7。試驗結束后對存活動物進行大體解剖觀察，除傘骨草水提物組有7 只小鼠子宮充血外，其余小鼠臟器、器官的體積、顏色、質地等均未見明顯異常。據(jù)毒性反應結果推測其毒性可能涉及的組織、器官、系統(tǒng)為中樞神經、神經肌肉、自主經和胃腸道的損傷。

4 討論

利尿藥一直作為一線降壓藥治療高血壓，主要通過增加腎臟對電解質及水的排出發(fā)揮作用[14-16]。炎癥是機體對損傷因子所產生的正常防御反應過程，一些抗炎藥物，如非甾體抗炎藥、抗生素、維生素等均可以有效治療炎癥及其并發(fā)癥，但是類似西藥通常會帶來一些副作用[17]。傳統(tǒng)中藥通過調節(jié)患者自身的免疫情況在治療高血壓和炎癥等方面取得了顯著的效果?！兜崮媳静荨穂11]中記載傘骨草氣具有利水通淋的作用，在云南民間用水煎治療水腫脹和炎癥等癥狀。為了進一步開發(fā)利用本植物，我們提取傘骨草并進行利尿、抗炎活性和急性毒性研究。

尿液量的排除可以直接反應藥物是否具有利尿作用[18]，從圖1 可以看出，傘骨草水提物可明顯增加小鼠的排尿量，且高劑量的傘骨草水提物效果最佳。尿液離子可以反應機體電解質的狀態(tài)，也可以一定程度上說明藥物利尿的作用機制。呋塞米屬于髓袢利尿藥可能通過特異性抑制髓袢升支的Na+/K+/2Cl-共同轉運體和遠曲小管的Na+/Cl-共同轉運體[19，20]，選擇性抑制NaCl的重吸收、降低腎的尿濃縮功能達到利尿的效果。表1 結果提示，各劑量傘骨草給藥組小鼠的尿液中 Na+、K+、Cl-和Ca2+的濃度均有不同程度的升高，且存在一定的量-效關系，推測傘骨草可能選擇性抑制Na+、K+、Cl-和Ca2+離子的重吸收，增加 Na+、K+、Cl-和Ca2+的排泄從而達到利尿的效果。

表4 傘骨草對角叉菜膠所致大鼠足趾腫脹抑制作用（，n = 10）

表4 傘骨草對角叉菜膠所致大鼠足趾腫脹抑制作用（，n = 10）

注：與溶媒對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

組別溶媒對照組阿司匹林傘骨草低傘骨草中傘骨草高腫脹度/μL 6 h 2154.8±74.1 1458±33.2**2050±80.3 1895±63.2*1643±50.2**劑量/（g·kg-1）-0.4 0.75 1.5 3.0 0.5 h 1580±50.1 1023±42.3**1405±70.2 1301±52.1*1195±45.2**1 h 1667±52.1 1098±42.8**1580±58.2 1390±48.2*1290±48.2**2 h 2024±57.3 1302±52.8**1892±80.9 1742±60.3*1514±53.2**4 h 2533±60.6 1680±45.4**2520±71.3 2302±61.0*2033±60.2**

表5 傘骨草對角叉菜膠所致大鼠足趾腫脹抑制作用（，n = 10）

表5 傘骨草對角叉菜膠所致大鼠足趾腫脹抑制作用（，n = 10）

組別溶媒對照組阿司匹林傘骨草低傘骨草中傘骨草高劑量/（g·kg-1）-0.4 0.75 1.5 3.0 0.5 h-35.25 11.08 17.66 24.37腫脹度抑制率/%1 h-34.13 5.22 16.62 22.62 2 h-35.67 6.52 13.93 25.20 4 h-33.68 0.51 9.12 19.74 6 h-32.34 4.86 12.06 23.75

表6 傘骨草提取物小鼠急性毒性實驗毒性反應（n = 10）

糖原是由葡萄糖分子通過糖苷鍵聚合而成的高分子物質，作為重要的能源物質儲存于肝臟、肌肉和腦等重要器官，在體內異常會對機體造成傷害，糖原檢測對某些疾病的的診斷具有重要的意義[21]。表2 中顯示傘骨草對小鼠血清中的糖原代謝無明顯影響。

表7 傘骨草提取物小鼠急性毒性實驗動物體質量（♀/♂，n =10）

尿素氮和肌酐是人體內代謝的主要產物，主要由腎小球濾過排出體外。尿素氮和血肌酐是腎功能的兩個最重要的指標[14,22]。為考察傘骨草水提物在發(fā)揮利尿作用的同時是否對腎臟功能造成影響，我們檢測了小鼠血清尿素氮、肌酐，結果顯示尿素氮、肌酐水平沒有顯著變化，提示傘骨草在發(fā)揮利尿作用的同時對腎臟功能沒有明顯損傷。

炎癥是機體受到各種損傷因子刺激后，血管系統(tǒng)的活體組織產生的防御反應，病理過程是炎癥區(qū)組織滲出、變性、增生，臨床表現(xiàn)為紅腫熱痛和機能障礙[8，9]。二甲苯和角叉菜膠均能使機體產生炎癥，通過二甲苯所致小鼠耳廓腫脹和角叉菜膠所致大鼠足趾腫脹實驗發(fā)現(xiàn)，傘骨草均具有明顯的抗炎作用，并且隨著劑量的提高其抗炎效果明顯增加，具有一定的劑量依賴性。

綜上所述，傘骨草具有利尿和抗炎的活性，其利尿的主要機制應該與K+、Cl-、Ca2+排出量有關，然而傘骨草對小鼠的糖原合成和腎臟功能沒有明顯影響，傘骨草中主要活性物質將進一步研究。