基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)探討追風(fēng)透骨膠囊對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎“異病同治”的潛在分子機制＊

沈 浮，沈樂樂，盧 敏，盧芳國，鄺高艷＊＊，吳泳蓉，趙昱東，夏 雨，鄧 博＊＊

（1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 長沙 410208；2. 寧夏醫(yī)科大學(xué)研究生院 銀川 750004；3. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 長沙 410007；4. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院 長沙 410208；5. 成都中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 成都 610075）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）分別為退行性關(guān)節(jié)炎及炎性關(guān)節(jié)炎的代表性疾病，是目前導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙和致殘的重要原因，其慢性持續(xù)的關(guān)節(jié)疼痛狀態(tài)嚴重影響人們生活質(zhì)量[1，2]。OA 的基本病理特征主要包括軟骨細胞的退變和細胞外基質(zhì)降解，常累及膝、髖等負重關(guān)節(jié)，RA 是一種以慢性滑膜炎及血管翳形成為主要病理改變的慢性自身免疫性疾病[3，4]。盡管兩者的發(fā)病機制有所不同，但均有 IL-1b、IL-6、TNF-α 等炎癥介質(zhì)的參與[5]。目前尚無特效藥物，西醫(yī)治療以緩解疼痛癥狀、延緩病情進展為主。二者均屬于中醫(yī)“痹癥”的范疇，且病因病機也多有相似，素體虛弱，正氣不足，衛(wèi)外不固，腠理不密，是誘發(fā)本病的重要因素[6，7]，中醫(yī)辯證施治對于痹癥的治療具有獨特的優(yōu)勢，且療效顯著、不良反應(yīng)少，適宜長期服用，近年來愈發(fā)受到重視[8]。

表1 數(shù)據(jù)庫及軟件工具

追風(fēng)透骨膠囊最早出處可追溯到明朝董宿《奇效良方》中的大追風(fēng)散，“百節(jié)酸疼……項背拘急……面上游風(fēng)，狀若蟲行，一切頭風(fēng)”記載的大追風(fēng)散初衷本用于祛風(fēng)化痰而利頭，而痹癥同為風(fēng)邪所害，并多兼有氣滯血瘀，后人配伍祛濕散寒、行氣活血之品，并經(jīng)劑型優(yōu)化改革，遂成追風(fēng)透骨膠囊[6,9]。臨床上使用追風(fēng)透骨膠囊治療OA、RA 療效顯著，在多項臨床研究中顯示，追風(fēng)透骨膠囊可有效改善RA 患者的關(guān)節(jié)疼痛、腫脹及晨僵等臨床癥狀，并顯著降低RA 患者紅細胞沉降率、C反應(yīng)蛋白以及類風(fēng)濕因子等炎性指標[6,10]，追風(fēng)透骨膠囊亦可降低OA 患者的骨關(guān)節(jié)指數(shù)評分（VOMAC）、視覺模擬量表（VAS）評分而顯著改善患者關(guān)節(jié)活動度及疼痛反應(yīng)，降低血清炎性介質(zhì)水平，下調(diào)血液粘稠度，提高患者生活質(zhì)量[6,11-13]，對于痹癥的臨床治療有良好的應(yīng)用價值。異病同治為中醫(yī)獨有的診療思維，最早出自《黃帝內(nèi)經(jīng)》，指在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，不同疾病在其病情進展過程中出現(xiàn)相似的證候，從而采取同樣的的治療方法，可獲同樣理想的療效，反映了中醫(yī)辨證論治的特點[14，15]。追風(fēng)透骨膠囊對于寒濕痹阻型的OA、RA 均具有良好的療效，體現(xiàn)了異病同治的理念[16]。

然而，由于中藥復(fù)方中成分多且復(fù)雜，疾病和中醫(yī)證候涉及到許多分子變化，因此大多數(shù)中藥方劑在復(fù)雜疾病中的組合規(guī)律和作用仍有待闡明[17]。隨著現(xiàn)代生物信息學(xué)的發(fā)展，海量信息獲取技術(shù)的成熟，尤其是計算能力及系統(tǒng)建模的發(fā)展，為中藥方劑在“生物網(wǎng)絡(luò)”的應(yīng)用賦予了實質(zhì)性的內(nèi)涵[18]，高通量信息技術(shù)為中藥復(fù)方干預(yù)疾病靶標的機制研究提供快捷的方法和新的機遇，并與中藥復(fù)方復(fù)雜成分及多途徑、靶點干預(yù)疾病的機理向貼合[19，20]。近年來，不少學(xué)者陸續(xù)開展了追風(fēng)透骨膠囊治療OA、RA 的臨床對照試驗研究，但其內(nèi)在機制尚缺乏完整的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證據(jù)。本研究利用高通量信息技術(shù)及分子對接法探討追風(fēng)透骨膠囊對于OA、RA 異病同治的潛在分子機制進行預(yù)測，以期進一步拓展追風(fēng)透骨膠囊異病同治的科學(xué)內(nèi)涵，為該藥的深入研究和臨床應(yīng)用提供更多可靠的理論依據(jù)。

1 資料及方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件工具

如表1所示。

1.2 追風(fēng)透骨膠囊化學(xué)成分篩選及其靶標的獲取

本研究依托TCMSP、BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫檢索追風(fēng)透骨膠囊的21 位味中藥（地龍、朱砂未收集在內(nèi)）：制 川 烏（chuanwu）、香 附（xiangfu）、川 芎（chuanxiong）、麻黃（mahuang）、制草烏（caowu）、當(dāng)歸（danggui）、赤小豆（chixiaodou）、羌活（qianghuo）、赤芍（chishao）、細辛（xixin）、制天南星（tiannanxing）、白芷（baizhi）、甘草（gancao）、白術(shù)（baizhu）、沒藥（moyao）、乳香（ruxiang）、茯苓（fuling）、桂枝（guizhi）、天麻（tianma）、甘松（gansong）、防風(fēng)（fangfeng）的所有化學(xué)成分。在TCMSP數(shù)據(jù)庫的篩選標準為，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%并且類藥性指數(shù)（drug-likeness，DL）≥ 0.18[21]，在 BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫的篩選條件為：靶點蛋白為高可信度（prediction score cutoff ＞ 20）[22]，并將上述候選化合物的潛在靶點上傳至UniProt數(shù)據(jù)庫，進一步獲得對應(yīng)的基因信息。

圖1 追風(fēng)透骨膠囊藥物有效活性成分分布情況

1.3 追風(fēng)透骨膠囊治療OA、RA 的“藥物-化合物-共有靶標”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

OA、RA 相 關(guān) 疾 病 靶 點 來 源 于 GeneCards、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫，將化合物作用靶點與疾病靶點取交集，獲取追風(fēng)透骨膠囊干預(yù)兩者的的共有靶標，并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0 構(gòu)建“藥物-化合物-共有靶標”網(wǎng)絡(luò)圖以備后續(xù)分析。

1.4 追風(fēng)透骨膠囊干預(yù)OA與RA的互作靶蛋白提取

利用STRING 數(shù)據(jù)庫進行共有靶點的蛋白質(zhì)間相互作用關(guān)系（protein-protein interaction，PPI）分析，設(shè)置combined score ＞0.9，并將結(jié)果利用Cytoscape 3.7.0繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并進行拓撲分析，以度值大于中位數(shù)的2倍篩選出關(guān)鍵共有靶點。

1.5 GO及KEGG通路相關(guān)富集分析

為深入探究對追風(fēng)透骨膠囊異病同治相關(guān)生物途徑及機制，本研究運用R語言調(diào)用Bioconductor數(shù)據(jù)包進行追風(fēng)透骨膠囊干預(yù)OA、RA 靶基因的基因本體功能富集（gene ontology，GO）與京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics，KEGG）通路富集分析，設(shè)定P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義，并對分析結(jié)果進行可視化。

1.6 追風(fēng)透骨膠囊中核心化合物與OA 和RA 共同作用靶蛋白的分子對接驗證

為進一步驗證追風(fēng)透骨膠囊中核心化合物與OA和RA 共同作用靶蛋白的結(jié)合情況，利用SYBYL-X 2.1.1 軟件中Surflex-dock 模塊進行分子對接，以追風(fēng)透骨膠囊中核心化合物為配體，OA 和RA 共同作用靶蛋白為受體，該對接工具匹配方法主要基于結(jié)構(gòu)及形狀的相似性，有高準確性、高陽性率及匹配速度迅速的特征[23]。一般認為，受體與配體的自由結(jié)合能越小，其穩(wěn)定性越強，則Total score 值越大。Total score ≥5.0意味著配體與靶蛋白之結(jié)合活性較優(yōu)，而Total score ≥7.0 則可預(yù)測該配體分子與靶蛋白結(jié)合活性較為強烈[24]。

2 結(jié)果

2.1 追風(fēng)透骨膠囊活性化合物篩選結(jié)果及分布特征

通過檢索TCMSP、BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫最終篩選收集到追風(fēng)透骨膠囊中21 味藥物（地龍、朱砂未收集在內(nèi)）所含的活性化學(xué)成分共276 種，其中川烏1個、香附 14 個、川芎 6 個、麻黃 21 個、草烏 4 個、當(dāng)歸 2個、赤小豆 1 個、羌活 9 個、赤芍 11 個、細辛 6 個、天南星6個、白芷16個、甘草74個、白術(shù)4個、沒藥22個、乳香 2 個、茯苓 3 個、桂枝 6 個、天麻 5 個、甘松 4 個、防風(fēng)17 個，活性化合物在各類中藥的分布比例如圖1A 所示，共獲取有效活性化合物靶標共475 個。由于各類中藥含有相同類型的活性成分，本研究組對各組分的中藥所含成分進歸納（圖1B），β-谷甾醇、谷甾醇、豆甾醇、槲皮素、茚酚、山柰酚在追風(fēng)透骨膠囊中各組分中藥的分布范圍最廣。

圖2 追風(fēng)透骨膠囊與疾病靶點韋恩圖

2.2 OA及RA疾病靶基因收集結(jié)果

通過 GeneCards、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫搜集 OA、RA 相關(guān)疾病靶點，去重后獲得RA 疾病靶點共4856 個，OA疾病靶點共3145 個，將以上2 組疾病靶點與追風(fēng)透骨膠囊475 個作用靶點進行交集，共獲得交集靶標207個（圖2）。

2.3 “藥物-化合物-共有靶標”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建結(jié)果

通過Cytoscape 3.7.0 軟件構(gòu)建“藥物-化合物-共有靶標”網(wǎng)絡(luò)圖（圖3），圖中共有節(jié)點410 個，邊1185條，該網(wǎng)絡(luò)的平均度值為5.78，大于其平均值2 倍的有效活性成分有12 個，分別是槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山奈酚（kaempferol）、間羥基苯甲酸（m-hydroxybenzoic acid）、黃芩苷（baicalein）、異鼠李素（isorhamnetin）、刺 槐 素（acacetin）、漢 黃 芩 素（wogonin）、β- 谷 甾 醇（beta-sitosterol）、楊 梅 酮（myricanone）、隱丹參酮（cryptotanshinone）、8-異戊烯-山奈酚（8-Isopentenyl-kaempferol），提示其為該網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵性有效活性成分，在追風(fēng)透骨膠囊干預(yù)OA 以及RA 的過程中其重要作用。從網(wǎng)絡(luò)圖可以看出，部分活性成分具有相同的作用靶點，說明各組分的藥效具有協(xié)同作用。HSP90AA1、ESR1、CALM1、NOS2、AR為追風(fēng)透骨膠囊干預(yù)OA、RA的關(guān)鍵靶基因。

2.4 追風(fēng)透骨膠囊干預(yù)OA 與RA 的互作靶蛋白提取結(jié)果

通過STRING 數(shù)據(jù)庫，進行PPI，并通過Cytoscape軟件進行可視化分析（圖4A），共有節(jié)點數(shù)173 個，邊數(shù)863 條，度值中位數(shù)為12，根據(jù)度值大于中位數(shù)2 倍篩選出核心網(wǎng)絡(luò)蛋白12 個（圖4B），分別為STAT3、AKT1、APP、JUN、MAPK1、TNF、HSP90AA1、RELA、IL6、MAPK14、VEGFA、MAPK8。這12 個靶蛋白為PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心節(jié)點，很可能是追風(fēng)透骨膠囊干預(yù)OA以及RA的關(guān)鍵靶蛋白。

圖3 追風(fēng)透骨膠囊干預(yù)OA、RA的“藥物-化合物-共有靶標”網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO與KEGG富集分析

根據(jù)P值的大小，本研究用條形圖列舉了各類排名靠前的GO 富集分析結(jié)果（圖5），其中生物過程（biological process，BP）2606個，主要涉及脂多糖反應(yīng)、細菌來源分子反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)、金屬離子反應(yīng)等（圖5A）；細胞組成（cellular component，CC）85 個，主要涉及膜筏、膜微域、膜區(qū)、囊泡腔、細胞質(zhì)囊泡腔等多種細胞結(jié)構(gòu)（圖5B）；分子功能（molecular function，MF）170 個，主要涉及細胞核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接配體調(diào)控特異性DNA 結(jié)合等（圖5C）。

在KEGG 富集結(jié)果篩選得到153 條主要信號通路，根據(jù)通路上富集的基因數(shù)目對排序前20的通路及對應(yīng)的基因?qū)隒ytoscape中繪制“靶基因-信號通路”網(wǎng)絡(luò)并進行可視化（圖6）。該網(wǎng)絡(luò)圖主要涉及代謝相關(guān)通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Fluid shear stress and atherosclerosis）、病毒 感 染 相 關(guān) 通 路（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Hepatitis B、Hepatitis C、Human cytomegalovirus infection）、炎性反應(yīng)相關(guān)通路（IL-17 signaling pathway）、腫瘤相關(guān)通路（TNF signaling pathway、Prostate cancer）等多種信號途徑。

圖4 追風(fēng)透骨膠囊作用OA、RA共同靶標的PPI網(wǎng)絡(luò)及核心靶蛋白

2.6 追風(fēng)透骨膠囊中核心化合物與OA 和RA 共同作用靶蛋白的分子對接驗證

為進一步驗證追風(fēng)透骨膠囊干預(yù)OA 以及RA 的分子機制，從PubChem 數(shù)據(jù)庫中提取追風(fēng)透骨膠囊中的關(guān)鍵有效活性成分作為配體，從Protein Data Bank數(shù)據(jù)庫提取PPI中的核心靶蛋白作為受體進行分子對接，對接Total score 結(jié)果如圖7 所示，在144 個對接結(jié)果中，59個提示有較優(yōu)的（Total score ≥5.0）對接活性，9 個有強烈的匹配活性（Total score ≥ 7.0），其中β-谷甾醇與核心靶蛋白結(jié)合情況最佳，HSP90AA1 是追風(fēng)透骨膠囊中關(guān)鍵化學(xué)成分結(jié)合活性最優(yōu)的靶蛋白。

Total score 值最高的4 組對接情況在如圖8 所示，8-異戊烯-山奈酚通過氨基酸殘基TYR139、LEU103、ASN51 形成3 條氫鍵（圖8A）；β-谷甾醇通過氨基酸殘基 LYS58 形成 1 條氫鍵（圖 8C）；兩者均能與HSP90AA1密切結(jié)合。β-谷甾醇與APP通過氨基酸殘基ASN84 形成1 條氫鍵（圖8B）；異鼠李素通過氨基酸殘 基 ARG69、GLN37、LYS55、GLU109、LEU110、MET111、SER34 形成 7 條氫鍵與 MAPK-8 受體靶蛋白緊密結(jié)合（圖8D）。并且上述配體化合物均能良好的包埋在直徑為5A的受體靶蛋白的活性口袋中。

3 討論

圖5 追風(fēng)透骨膠囊治療OA、RA共同潛在靶點的GO富集分析

圖6 追風(fēng)透骨膠囊干預(yù)OA、RA共同潛在靶點的“靶基因-信號通路”網(wǎng)絡(luò)

圖7 追風(fēng)透骨膠囊中的關(guān)鍵活性化合物與PPI核心靶蛋白分子對接Total score值熱圖

圖8 追風(fēng)透骨膠囊中關(guān)鍵活性化合物與PPI核心靶蛋白分子對接對接情況

OA 與RA 均屬于中醫(yī)“痹癥”范疇，其病機多為本虛標實，外感風(fēng)、寒、濕之邪易誘發(fā)本病，追風(fēng)透骨膠囊由制川烏、香附、川芎、麻黃等23 位藥物組成，其中細辛、川烏散寒溫經(jīng)通絡(luò)，羌活、防風(fēng)祛風(fēng)除濕，并配伍赤芍、當(dāng)歸等養(yǎng)血活血之品，共效活血通絡(luò)、散寒祛濕之功?，F(xiàn)代研究證明，追風(fēng)透骨膠囊具有顯鎮(zhèn)痛抗炎及抗凝的功效，能加速血液循環(huán)、改善血液粘稠度，調(diào)節(jié)機體免疫平衡[25]，其改善關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)可能與下調(diào)滑液及滑膜組織中miR-155、TGF-β1 的表達有關(guān)[26]。川烏在追風(fēng)透骨膠囊為君藥，其不僅能顯著抑制前列腺素E、組胺等炎性介質(zhì)的釋放，在體外還可抑制軟骨細胞基質(zhì)降解，降低單碘乙酸鹽誘導(dǎo)的軟骨細胞損傷，對OA 模型具有一定的軟骨保護作用[27，28]。川芎與當(dāng)歸的配伍增強了追風(fēng)透骨膠囊的抗炎鎮(zhèn)痛效應(yīng)，有研究顯示兩者配伍比例為1:1 時，其活血化瘀之功最優(yōu)，這與追風(fēng)透骨膠囊中二者的配比相吻合[29]。芍藥苷為追風(fēng)透骨膠囊臣藥赤芍的主要成分，有報道顯示，芍藥苷能顯著改善RA 模型大鼠的足腫脹，降低關(guān)節(jié)內(nèi)的 TNF-α、IL-1β、IL-6 等促炎因子的釋放，抑制Rho 激酶在滑膜組織內(nèi)的激活，以及下調(diào)p-NF-κB、p65和p-MYPT1的表達[30]。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接的方法對追風(fēng)透骨膠囊對于OA、RA 異病同治的機制進行探討，在“藥物-化合物-共有靶標”網(wǎng)絡(luò)圖中對追風(fēng)透骨膠囊干預(yù)OA 及RA 共有靶標的關(guān)鍵有效活性成分進行了篩選，并通過分子對接技術(shù)對篩選得到的活性成分及進行驗證，其中槲皮素、木犀草素、山奈酚的度值排名靠前，而在分子對接結(jié)果中β-谷甾醇與核心靶蛋白結(jié)合情況最佳，提示它們在追風(fēng)透骨膠囊干預(yù)OA、RA發(fā)揮的作用最大。追風(fēng)透骨膠囊中關(guān)鍵活性成分多歸類于黃酮類單體化合物，現(xiàn)代研究表明槲皮素可減少 TNF-α、IL-1β、IL-6 等促炎性細胞因子生成，調(diào)控NF-κB、Nrf-2/HO-1 等多種炎癥相關(guān)信號通路，降解弱炎癥環(huán)境下軟骨細胞內(nèi)MMP-13 產(chǎn)生、基質(zhì)降解和細胞凋亡，從而保護關(guān)節(jié)軟骨，具有治療OA 以及RA的潛在藥物價值[31-34]。木犀草素是一種具有多種藥理特性的天然黃酮，由于其具有較強的抗炎作用，木犀草素已被用于治療多種炎性相關(guān)疾病，有報道顯示，木犀草素可通過下調(diào)的OA 軟骨細胞JNK、p38 的表達以及抑制NF-κB磷酸化，來抑制NO、TNF-α和IL-6的釋放，并逆轉(zhuǎn)II 型膠原蛋白的降解，從而減緩軟骨的退化[35，36]。山奈酚通過抑制bFGF-FGFR3–RSK2信號傳導(dǎo)抑制RA-FLSs 的增殖和遷移，從而減少IL-17、IL-21 和TNF-α等活化的T 細胞介導(dǎo)的炎性細胞因子的釋放，進而降低體外和體內(nèi)的破骨細胞分化，對于RA 的誘導(dǎo)和進展發(fā)揮關(guān)鍵作用[37，38]。β-谷甾醇具有抗炎效應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)的功效，其可提高脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的J774A1 巨噬細胞的IL-10 活性，減小趨化因子和促炎因子活性，亦可以增加Th-1 型淋巴細胞增殖，調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫從而抑制IL-6 和TNF 發(fā)揮抗炎作用[39]。本研究預(yù)測得出在追風(fēng)透骨膠囊干預(yù)OA、RA 的過程主要涉及 HSP90AA1、ESR1、CALM1、NOS2、AR 等靶基因，其中Ⅱ型一氧化氮合酶（NOS2）相關(guān)基因與關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜炎癥密切，普遍認為高濃度的NO 抑制與線粒體代謝有關(guān)的多種酶，此外，在病理條件下，迅速分解為具有很強毒性的NO2 相關(guān)自由基從而對滑膜、軟骨細胞有直接殺傷作用[40]。CALM1 基因位于編碼Ca M染色體上，有研究顯示Ca M 與細胞內(nèi)Ca2+結(jié)合的情況較為多見，并參與關(guān)節(jié)軟骨中軟骨細胞的分化及維持軟骨正常形態(tài)和功能[41]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對于追風(fēng)透骨膠囊干預(yù)OA、RA 的關(guān)鍵活性化合物及潛在靶基因進行預(yù)測，部分結(jié)果干預(yù)OA、RA 的機制已在體內(nèi)外實驗中得到體現(xiàn)，表明通過此法篩選的化學(xué)成分雖有一定的參考價值，另外，仍有部分預(yù)測結(jié)果在目前發(fā)表的文獻中尚未得到驗證，其可能是追風(fēng)透骨膠囊對于OA、RA 異病同治的潛在活性成分，還需要結(jié)合進一步實驗研究。

根據(jù)PPI 核心蛋白的網(wǎng)絡(luò)分析中的度值排序，靠前的核心靶標主要與炎癥、免疫、增殖以及分化相關(guān)聯(lián)，分子對接結(jié)果提示追風(fēng)透骨膠囊中關(guān)鍵活性成分與HSP90AA1 靶蛋白結(jié)合活性最優(yōu)。HSP90AA1 誘導(dǎo)NF-κB 信號通路組分的抑制后降解，阻滯該信號通路的激活，并導(dǎo)致炎性細胞的細胞因子產(chǎn)生減少，并且越來越多的證據(jù)表明，HSP90AA1 相關(guān)的靶向藥物減少滑膜炎癥和防止軟骨破壞，有助于RA 的治療[42]。STAT3 是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）家族成員之一，其激活可導(dǎo)致促炎細胞因子的產(chǎn)生和免疫反應(yīng)增加，通過抑制STAT3 的表達可以限制免疫炎癥反應(yīng)，改善自身免疫性相關(guān)的關(guān)節(jié)炎癥狀[43，44]。AKTI 通過Thr308 和Ser473 的磷酸化激活，活化的AKT1 通過多種信號途徑促進細胞生長，并使凋亡級聯(lián)的各種成分失活來參與OA 的進展[45]。IL-6 是重要的促炎因子，在RA、OA 患者的血清以及關(guān)節(jié)滑液中均明顯升高[46]，其可增強 RA 發(fā)病過程中 IL-1 和 TNF-α的效應(yīng)可加速B 淋巴細胞增殖，活化T淋巴細胞，破壞關(guān)節(jié)軟骨，并通過IL-6 通過JAK/STAT 信號通路的介導(dǎo)影響滑膜細胞纖維化以及骨的再吸收加速病情進展[47-48]。TNF-α亦扮演了重要的角色，可誘導(dǎo)效應(yīng)T 細胞引起滑膜組織損傷[49，50]。MAPK8、MAPK14 均屬于絲裂原活化蛋白激酶家族，它們參與調(diào)節(jié)許多細胞功能，如分化、增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)，其參與RA 的疾病進程中得到廣泛驗證[51]。血管生成活動對于OA 與RA 的誘發(fā)及進展有著密切的聯(lián)系，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）與內(nèi)皮細胞（EC）上的同源受體結(jié)合，并激活這些細胞產(chǎn)生蛋白水解酶，其降解基底膜導(dǎo)致內(nèi)皮細胞遷移并進一步增殖，這是RA 滑膜血管生成的重要促炎過程[52]。由此推測追風(fēng)透骨膠囊對于OA、RA 的干預(yù)涉及多種靶蛋白，這些可能追風(fēng)透骨膠囊對于兩者異病同治的潛在治療靶點，本研究預(yù)測的相關(guān)靶標基于高通量信息技術(shù)進行科學(xué)篩選，可為后續(xù)相關(guān)靶點的深入研究提供有意義的參考。

為了深入了解追風(fēng)透骨膠囊對于OA 和RA 異病同治的作用機制，本課題組基于R 語言調(diào)用相關(guān)程序包對追風(fēng)透骨膠囊干預(yù)OA、RA 的交集靶標進行GO及KEGG富集分析，GO富集分析提示追風(fēng)透骨膠囊異病同治的生物學(xué)途徑主要涉及脂多糖生物反應(yīng)、細菌分子應(yīng)激反應(yīng)以及氧化應(yīng)激等生物學(xué)過程，以及核受體、細胞因子活性等多種分子功能。KEGG 分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)炎性反應(yīng)、代謝、病毒感染、腫瘤相關(guān)通路富集較多的靶向基因，其中AGE-RAGE 排名最靠前，對于晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）信號傳導(dǎo)途徑的深入研究，使人們認識到AGEs 可以誘導(dǎo)人OA 滑膜細胞COX-2 的表達和前列腺素 E2（PGE2）、IL-6 和 MMP-13 的產(chǎn)生[53]，另外AGEs 受體中和抗體（RAGE）能有效逆轉(zhuǎn)人滑膜細胞的炎癥反應(yīng)和VEGF 生成，提示RAGE 在滑膜細胞活化中起重要作用，從而促進OA 的進展[54]。IL-17通路在RA進程中被MMP13被激活，miR-19a可以通過介導(dǎo)IL-17 信號通路介導(dǎo)HFLS-RA 的增殖和侵襲，從而調(diào)節(jié)RA 人成纖維樣滑膜細胞中MMP13 的表達，從而參與軟骨細胞的降解[55]。可以發(fā)現(xiàn)，追風(fēng)透骨膠囊作用對于OA、RA 異病同治作用途徑的范圍十分寬泛，并可以通過多種途徑對不同的信號通路及生物學(xué)過程進行干預(yù)，由于通路的篩選基于相關(guān)靶基因在備選通路的富集數(shù)目進行篩選，不排除部分通路的預(yù)測出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，因此，后續(xù)科研驗證工作仍需結(jié)合OA、RA 相關(guān)前期文獻研究進行綜合分析，本課題組認為追風(fēng)透骨膠囊發(fā)揮異病同治的機制非常復(fù)雜，本次預(yù)測篩選的炎癥、代謝及腫瘤相關(guān)的通路具有后續(xù)研究的參考意義。

本研究仍存在一些不足之處，首先，由于數(shù)據(jù)庫的局限性，追風(fēng)透骨膠囊中地龍、朱砂尚未納入本次研究范圍內(nèi)，且本研究依賴于TCMSP、BATMAN-TCM等數(shù)據(jù)庫對于追風(fēng)透骨膠囊各活性成分的收集，由于數(shù)據(jù)庫本身可能存在對于藥物活性成分及對應(yīng)靶標的欠完整性及準確性不高等局限，對于各組分中藥在體內(nèi)的相互作用及代謝情況尚不明確，這與追風(fēng)透骨膠囊實際干預(yù)OA、RA 的機制可能存在偏倚，后期研究可以通過液相色譜等方法來獲取活性成分來提高準確性。其次，根據(jù)中醫(yī)辯證論治的基本原則，追風(fēng)透骨膠囊干預(yù)寒濕痹阻證的痹癥更符合中醫(yī)的病理病機，由于目前暫缺乏中醫(yī)證候相關(guān)的基因數(shù)據(jù)庫，因此本研究尚無法做到方證對應(yīng)，后續(xù)研究可以通過基因芯片方法得到該證候相關(guān)的差異基因并加以實驗驗證。綜上所述，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及分子對接技術(shù)對追風(fēng)透骨膠囊干預(yù)OA、RA 異病同治作用的機制進行預(yù)測，篩選得到的關(guān)鍵活性化合物、核心靶標以及相關(guān)通路與目前研究OA、RA 的機制具有一致性，并且在分子對接驗證結(jié)果中多數(shù)活性成分與靶蛋白結(jié)合匹配度較高，從一定程度上表明預(yù)測結(jié)果的可靠性與準確性，體現(xiàn)了追風(fēng)透骨膠囊具有多成分、多靶點、多途徑的特點，并豐富了追風(fēng)透骨膠囊異病同治的科學(xué)內(nèi)涵，可為下階段的研究提供參考。