甲炎康泰對自身免疫性甲狀腺炎大鼠T-bet/GATA3的影響＊

張程斐，王明慧，孫伯菊，吳 悠，秦 帥，吳麗麗 ，秦靈靈 ，劉銅華 ＊＊

（1. 北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院 北京 100078；2. 陜西中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院 咸陽 712000；3. 成都中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院 成都 610075；4. 北京中醫(yī)藥大學教育部中醫(yī)養(yǎng)生學重點實驗室 北京 100029；5. 北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)養(yǎng)生學研究所 北京 100029；6. 北京中醫(yī)藥大學科技處 北京 100029）

自身免疫性甲狀腺炎（autoimmune thyroiditis，AIT）是器官特異性自身免疫疾病，因免疫功能的紊亂導致甲狀腺自身抗體的產(chǎn)生，繼而誘發(fā)淋巴細胞的浸潤，甲狀腺組織結構破壞與功能減退為其主要特征。血清中甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）與甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）的高表達是AIT自身抗體的主要表現(xiàn)[1]。且在光鏡下見甲狀腺組織內炎性浸潤和不同程度的甲狀腺濾泡損壞[2]。臨床上通過甲狀腺自身抗體以及影像學等檢查來確診。AIT 中年女性多發(fā)，且近年患病率呈上升趨勢[3]。其可合并其他自身免疫性疾病，如腎上腺功能不全，惡性貧血等，嚴重影響患者的生活質量。

甲炎康泰是劉銅華教授治療自身免疫性甲狀腺炎多年總結的臨床經(jīng)驗方，經(jīng)甲炎康泰治療6 個月后臨床療效評定，TPOAb 總有效率為94.44%，TgAb 總有效率為97.22%[4]，甲炎康泰治療AIT臨床療效確切。

前期研究發(fā)現(xiàn)，甲炎康泰可下調AIT 模型大鼠血漿細胞因子IL-4、IL-5、TNF-α、IFN-γ、IL-1α的表達水平，從而下調Th1/Th2比率以恢復Th1/Th2細胞免疫平衡并維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)[5]。

T-bet（T-box expressed in T cells）是重要的Th1 轉錄因子，可對Thl 細胞的分化及效應功能發(fā)揮重要的作用；GATA3（GATA-binding protein-3）則在Th2 細胞的發(fā)育中起到關鍵的作用。T-bet 和GATA3 對Th1/Th2細胞進行調控，并在分化過程中起重要作用[6]。T-bet 和GATA-3 能直接反映機體Th1/Th2 細胞平衡狀態(tài)[7]。但甲炎康泰對AIT 模型大鼠Th1/Th2 細胞中轉錄因子T-bet和GATA3的作用如何？這方面仍未揭示清楚，本次實驗以AIT 模型大鼠Th1/Th2 細胞中轉錄因子 T-bet 和 GATA3 為靶點，從調控 Th1/Th2 細胞中轉錄因子T-bet 和GATA-3 等途徑切入，探討甲炎康泰是否通過調節(jié)轉錄因子T-bet 和GATA3 而調控了Th1/Th2細胞免疫平衡的作用及機制?，F(xiàn)總結如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF 級雌性 Lewis 大鼠 50 只，4 - 5 周齡，體質量85 ± 10 g。購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006。

1.2 實驗藥物

黃芪、夏枯草、郁金、穿山龍、柴胡、烏梅、浙貝母、山慈菇、玄參顆粒劑，溶于100 mL 雙蒸水中制成藥物混懸液，于4℃儲藏，甲炎康泰專利號：CN1064216 33A。

1.3 主要試劑及配制方法

豬甲狀腺球蛋白（Sigma，批號：018K7012）、弗氏完全佐劑（Sigma，批號：SLBW7430）、弗氏不完全佐劑（Sigma，批號：SLBZ0619）、碘化鈉（Maya-R，CAS 號：7681-82-5，99% AR）、T-bet 一 抗（Cell Signaling Technology）、GATA3 一抗（Cell Signaling Technology）、TBET-F：CAACAACCCCTTTGCCAAAG（上海生工，批號：2012383040）、TBET-R：TCCCCCAAGCAGTTGACAGT（上海生工，批號：2012383041）、GATA3-F：TGGGCTCTACTACAAGCTTCACAATAT（上海生工，批號：2012383038）、GATA3-R：TTGCTAGACATTTTTCGGTTTCTG（上海生工，批號：2012383039）、RNGAPDH-F：AggTCggTgTgAACggATTTg（上海生工，批號：BN61204-0001）、RN-GAPDH-R：TgTAgACCATg-TAgTTgAggTCA（上海生工，批號：BN61204-0002）。

碘化鈉溶液制備：于100 mL 雙蒸水中加入64 mg碘化鈉，制成0.064%的NaI 溶液。現(xiàn)用現(xiàn)配，注意避光。乳化劑的配制：首先用PBS 配制需要量為濃度0.1%的豬甲狀腺球蛋白（porcine thyroglobulin，PTg），再與弗氏完全佐劑（Freund's complete adjuvant，F(xiàn)CA）等容積比例混合，制成乳劑。Tg 終濃度為0.05%，即100 μg Tg/0.2 mL 乳化劑。弗氏不完全佐劑（Freund’s incomplete adjuvant，F(xiàn)IA）配制方法同F(xiàn)CA。

1.4 主要儀器

低溫高速離心機（Beckman公司）、OLYMPUS BH-2 光鏡（日本）、高溫干燥箱（FD53，Binder，德國）、手術相關器械。

2 實驗方法

2.1 造模與分組

自身免疫性甲狀腺炎大鼠模型制作[8]方法：正常對照組10只大鼠自由飲用雙蒸水，其余鼠均造模。造模鼠適應性喂養(yǎng)1 周后，自由飲用0.064% NaI 溶液直至取材結束。第3 周各組造模鼠接受初次免疫：大鼠頸部皮下、足墊和背部皮下多點注射豬甲狀腺球蛋白合弗氏完全佐劑每次每只0.2 mL，共2 次，間隔4 天。第4 周至第8 周于同樣部位多點注射豬甲狀腺球蛋白合FIA 每次每只0.2 mL，每周1 次。第8 周結束，眶靜脈取血離心取上清，酶聯(lián)免疫吸附法（Elisa）檢測血清中TgAb、TPOAb抗體表達水平，以驗證造模是否成功。

2.2 給藥方法

造模成功后，各組大鼠給藥量參照人與動物之間體表面積比例表折算，正常、模型組大鼠每日予以0.9 mL/100 g 雙蒸水，甲炎康泰低（0.708 g·kg-1）、中（1.417 g·kg-1）、高（2.834 g·kg-1）劑量組大鼠每天予以同體積藥物混懸液且連續(xù)灌胃8周，給藥期間繼續(xù)造模。

2.3 檢測指標及方法

2.3.1 RT-PCR 檢測各組大鼠脾臟中T-bet、GATA3 mRNA的表達情況

-80℃超低溫冰箱取大鼠脾臟組織，利用Trizol 法獲取脾臟組織總RNA，進行反轉錄采用GoScriptTMReverse Transcription System 試劑盒，退火 25℃ 5 min，延伸42℃ 1 h，滅活70℃ 15 min，得到cDNA；建立20 uL反應體系包含：0.8 uL 引物混合物、7.2 uL Nuclease-Free Water以及10 uL GoTaq反應液加2 μL cDNA稀釋液。將其置于7500 Real Time PCR System 運行反應，運行過程為：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min（共40次循環(huán)）；95℃ 15 s，60℃ 15 s 溶解。比較各組目標mRNA的表達差異采用2-△△CT相對定量法。

2.3.2 Western Blot 檢測各組大鼠脾臟中T-bet、Gata3蛋白的表達情況

脾臟組織蛋白提取及BCA 法蛋白定量→制膠及上樣→電泳→蛋白質的電轉移和膜封閉→抗原抗體反應及顯影（一抗GATA3為1∶2000；T-bet為1∶500，二抗 GATA3 為 1∶2000；T-bet 為 1∶1000）→蛋白圖像分析：IPP軟件分析目的條帶灰度值。

2.3.3 免疫組織化學分析

14 周后處死大鼠，取雙側甲狀腺組織置入4%的多聚甲醛中，常規(guī)石蠟包埋切片。免疫組化檢測主要步驟：切片脫蠟、水化，3%過氧化氫處理，高溫抗原修復，山羊血清封閉，一抗4℃過夜，復溫PBS 沖洗，滴加二抗，DAB 顯色，蘇木精染色，鹽酸酒精分化，自來水沖洗，脫水，封片。光鏡下觀察并存取照片，采用Image-Pro Plus 6.0 進行吸光度檢測，分析T-bet、GATA3的平均光密度（IOD/Area），進行統(tǒng)計學處理。

2.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用方差分析，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 甲炎康泰對AIT 大鼠脾臟T-bet、GATA3 mRNA的表達變化

較正常組，模型組T-bet、GATA3 mRNA 表達均顯著上升（P＜ 0.01）；較模型組，甲炎康泰低、中、高劑量組T-bet、GATA3 mRNA 均下降，高劑量組具有顯著意義，T-bet（P＜0.01），GATA3（P＜0.01）（表1）。

3.2 甲炎康泰對AIT 大鼠脾臟T-bet、GATA3 蛋白免疫印跡的表達變化

較正常組，模型組T-bet、GATA3 蛋白表達均顯著上升（P＜ 0.01）；較模型組，甲炎康泰低、中、高劑量組T-bet、GATA3 蛋白表達均下降，高劑量組具有顯著意義，T-bet（P＜0.05）；GATA3（P＜0.01）（表2、圖1）。

3.3 甲炎康泰對AIT 大鼠脾臟T-bet、GATA3 蛋白免疫組化的表達變化

較正常組，模型組T-bet、GATA3 蛋白表達均顯著上升（P＜ 0.01）；較模型組，甲炎康泰低、中、高劑量組T-bet、GATA3 蛋白表達均下降，中劑量組 T-bet（P＜0.05）、高劑量組 T-bet（P＜ 0.01）和中、高劑量組GATA3（P＜ 0.01）具有顯著性意義（表3、圖2、圖3）。

表1 各組大鼠脾臟T-bet、GATA3 mRNA表達比較（,n = 6）

表1 各組大鼠脾臟T-bet、GATA3 mRNA表達比較（,n = 6）

注：#與正常組比較，P ＜ 0.05；##與正常組比較，P ＜ 0.01；△與模型組比較，P ＜ 0.05；△△與模型組比較，P ＜ 0.01。

組別正常組模型組甲炎康泰低組甲炎康泰中組甲炎康泰高組T-bet 0.70±0.56 8.23±2.85##11.61±9.89##6.41±3.94#1.47±1.30△△GATA3 2.09±1.05 21.70±12.89##20.78±11.75#9.27±1.98#5.45± 0.92△△

表2 各組大鼠脾組織中T-bet、GATA3蛋白表達的情況（,n = 6）

表2 各組大鼠脾組織中T-bet、GATA3蛋白表達的情況（,n = 6）

注：#與正常組比較，P ＜ 0.05；##與正常組比較，P ＜ 0.01；△與模型組比較，P ＜ 0.05；△△與模型組比較，P ＜ 0.01。

GATA3/GAPDH 0.94±0.04 12.00±0.40##11.25±0.85##10.71±0.54##9.92 ± 0.61##△△組別正常組模型組甲炎康泰低甲炎康泰中甲炎康泰高T-bet/GAPDH 0.96±0.27 1.59±0.19##1.31±0.19##1.08±0.12##0.90±0.10##△

圖1 甲炎康泰對AIT大鼠脾臟T-bet、GATA3蛋白表達的影響

表3 各組大鼠甲狀腺組織T-bet、GATA3蛋白表達（,n = 6）

表3 各組大鼠甲狀腺組織T-bet、GATA3蛋白表達（,n = 6）

注：#與正常組比較，P ＜ 0.05；##與正常組比較，P ＜ 0.01；△與模型組比較，P ＜ 0.05；△△與模型組比較，P ＜ 0.01。

GATA3（IOD/Area）0.86±0.17 1.78±0.48##1.70±0.30##1.30 ± 0.22#△△1.04±0.24△△組別正常組模型組甲炎康泰低甲炎康泰中甲炎康泰高T-bet（IOD/Area）0.70±0.11 3.01±0.44##2.06±0.36##1.93±0.50#△1.78± 0.13△△

4 討論

圖3 甲炎康泰對AIT大鼠脾臟GATA3蛋白免疫組化的表達變化（200×）

生理狀態(tài)下，輔助性T 細胞所分化的Th1、Th2 型細胞及其所分泌的細胞因子以網(wǎng)絡動態(tài)形式相互協(xié)同或拮抗，來維持正常免疫應答以維護內環(huán)境處于穩(wěn)態(tài)中[9]。當免疫系統(tǒng)被甲狀腺組織內的特異性抗原激活后，體內T 細胞及所分泌的細胞因子形成的網(wǎng)絡平衡即被打破，Th0 向 Th1 或 Th2 發(fā)生偏移[10]。其中，Th1型細胞特異轉錄因子T-bet 不僅可促進Th1 型細胞的生長發(fā)育，亦對Th2型細胞因子的合成起到抑制作用。并且T-bet可觸發(fā)IFN-γ的基因轉錄，IFN-γ進一步促進T-bet 的表達水平，更一步促進Th0 進行分化成Th1型細胞；T-bet 亦可將成熟的Th2 型細胞轉變成Th1 型細胞并產(chǎn)生IFN-γ，進一步影響Th 輔助細胞向Th1 發(fā)生偏移[11]。特異性轉錄因子GATA3為Th2型細胞轉錄所必須，其可直接激活IL-4 而促進Th2 型細胞的成形[12]，是Th0細胞向Th2極化專有的轉錄因子[13]?？梢?，T-bet/GATA3 的表達與Th1/Th2 細胞免疫平衡關系密切，即T-bet/GATA3可調控Th1/Th2細胞免疫偏移。

圖4 甲炎康泰對AIT大鼠血清中IFN-γ濃度的變化

本次實驗結果顯示：與正常組比較，模型組T-bet、GATA3 mRNA 及蛋白表達均顯著上升（P＜ 0.01）。即T-bet與GATA3均參與了自身免疫性甲狀腺炎的發(fā)病機制。前期研究顯示：在自身免疫性甲狀腺炎的發(fā)病進程中，IFN-γ與IL-4 均上調（圖4-5），提示IFN-γ與IL-4 的高表達可能與T-bet 與GATA3 的表達升高有關。本研究中，與模型組比較，甲炎康泰低、中、高劑量組T-bet、GATA3 mRNA 及蛋白均下降（P＜ 0.05，P＜ 0.01），即甲炎康泰可下調 T-bet、GATA3 表達水平。前期研究示：甲炎康泰可下調IFN-γ、IL-4表達水平與Th1、Th2 比例以糾正Th1/Th2 細胞免疫平衡偏移（圖4-6），那么，甲炎康泰及其可能通過調控T-bet、GATA3 的表達而糾正了Th1/Th2 細胞免疫平衡偏移，以緩解自身免疫性甲狀腺炎的發(fā)展。

綜上所述研究結果提示，可以推測甲炎康泰可能通過影響T-bet/GATA3 信號通路，下調T-bet 的表達，抑制Th1 型免疫反應，減少 Th1 型細胞因子 IFN-γ的表達和分泌，以及下調GATA3，一定程度抑制Th2 型免疫反應，從而調控Th1/Th2細胞免疫平衡以緩解AIT的發(fā)展。但甲炎康泰是通過什么機制使T-bet、GATA3轉錄因子發(fā)生變化，還待進一步研究。

圖6 甲炎康泰對AIT大鼠血清中Th1/Th2細胞比率的變化