德朗熱綜合征1例基因檢測和臨床分析

胡宇慧 陳淑麗 劉 麟 崔 冬

深圳市兒童醫(yī)院 1.遺傳代謝科，2.心血管內(nèi)科（廣東深圳 518038）

德朗熱綜合征（Cornelia de Lange syndrome，CdLS，MIM：122470，300590，300882，610759，614701）又稱為阿姆斯特丹侏儒癥，是一種罕見的多系統(tǒng)受累的發(fā)育障礙性遺傳疾病，具有獨特顱面特征、生長遲緩、認(rèn)知障礙、肢體缺陷、多毛癥和多系統(tǒng)受累等臨床特點[1]。獨特的面部特征為CdLS 的主要診斷點，包括弓形眉、連眉、多毛、短鼻、鼻孔上翹、薄上唇和小下頜等。CDLS 的發(fā)病率占活產(chǎn)嬰兒1/200000～1/10000[2]。目前明確為CdLS致病基因有5個：NIPBL、SMC1A、SMC3、RAD21和HDAC8。有報道提示，BRD 4和ANKRD 11基因與CdLS 相關(guān)[3]。遺傳方式為常染色體顯性遺傳（NIPBL、SMC3、RAD21）和X-連鎖顯性遺傳（SMC 1 A和HDAC 8），多數(shù)為散發(fā)病例，＜1%的患者有同樣受累的父母[4]。參考人類基因突變數(shù)據(jù)庫（Human Gene Mutation Database，HGMD），NIPBL為CdLS最常見致病基因，至今報道約300個突變位點，無熱點突變報道。目前CdLS無特效治療方法。本文通過對1 例高度疑似CdLS 患兒的全外顯子組基因突變檢測，報道一個新發(fā)現(xiàn)的NIPBL基因變異位點，同時進(jìn)行臨床資料總結(jié)，以便增加臨床醫(yī)師的認(rèn)識。

1 臨床資料

患兒，男，6 月齡，因體質(zhì)量增長緩慢6 個月就診于遺傳代謝科?；純篏3P2，孕37+4周剖宮產(chǎn)出生，出生體質(zhì)量2.1 kg（＜－3 SD），身長43 cm（＜－3 SD），Apgar評分不詳，無窒息搶救病史。生后因面容特殊在當(dāng)?shù)刈≡喊雮€月，診斷為“先天性腦發(fā)育異常，先天性心臟病（肺動脈狹窄），新生兒肺炎，足月小樣兒，隱睪”?；純涸娓改笧楸硇置?，父母體健。母親孕期多次彩色超聲示胎兒宮內(nèi)生長受限，拒絕行羊水穿刺，曾住院保胎治療，既往人流1 次。患兒7 歲姐姐體健?；純撼鲈汉笾两窕旌衔桂B(yǎng)，平素進(jìn)食偏慢，無頻繁嘔吐，無慢性腹瀉，無反復(fù)感染病史，無抽搐，體質(zhì)量增長緩慢，目前會無意識笑，抬頭不穩(wěn)，哭聲響亮，聽力視力無明顯異常。體格檢查：體質(zhì)量3.3 kg（＜－3SD），身長55 cm（＜－3SD），頭圍32.5 cm（＜－3SD）。精神尚可，前囟2 cm×2 cm，額部多毛，連心眉，弓形濃眉，睫毛長且彎曲，雙眼瞼下垂，鼻梁低平，人中長，嘴唇薄，嘴角下斜（圖1）。心前區(qū)可聞及3/6級收縮期雜音。胸廓無畸形，肺腹無異常；左側(cè)隱睪；雙手小，左手通貫掌，雙足第四趾短。四肢肌力尚可，肌張力無異常。實驗室檢查：近期外院血常規(guī)、胸片、肝酶、心肌酶譜、電解質(zhì)、甲狀腺功能均無異常，血串聯(lián)質(zhì)譜和尿氣相色譜質(zhì)譜結(jié)果陰性。染色體微陣列陰性。彩色多普勒超聲心動圖示肺動脈狹窄。生殖器超聲示雙側(cè)睪丸下降不全。

圖1 患兒面部特征

經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核及患兒父母知情同意，EDTA 抗凝管采集患兒和父母外周血各2 mL 行基因分析。采用吸附柱法（QIAGEN公司）提取純化全基因組DNA；采用超聲波方法（Covaris公司）對DNA片段化并通過低循環(huán)數(shù)PCR將其兩端加上index標(biāo)簽及測序元件，經(jīng)全外顯子V6版探針（Agilnet公司）進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域捕獲并洗脫純化得到測序前文庫樣品。制備好的文庫通過NovaSeq（Illumina公司）二代高通量測序平臺進(jìn)行測序。測序完成后利用軟件對fastq數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾并使用BWA、比對、變異識別等生物信息分析，結(jié)合外部公共數(shù)據(jù)庫、臨床表型信息，參照美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）進(jìn)行變異解讀。利用Sanger 測序法對患兒及父母進(jìn)行陽性及疑似突變位點驗證（深圳基因啟示錄公司完成）。引物設(shè)計采用Primer5.0軟件，相關(guān)序列見表1。

表1 NIPBL基因第9外顯子擴(kuò)增上下游引物序列

檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，患兒NIPBL基因第9外顯子存在NM-133433 c.1679delA（p.K566Sfs*48）雜合突變，該突變導(dǎo)致突變位點后48 位出現(xiàn)終止密碼子，轉(zhuǎn)錄蛋白出現(xiàn)截短，應(yīng)用Sanger測序?qū)純和蛔兾稽c進(jìn)行家系驗證，證實患兒為雜合子，患兒父母該基因位點均無異常。見圖2。根據(jù)ACMG 聯(lián)合美國分子病理學(xué)會（Association for Molecular Pathology，AMP）2015年制訂的“基因序列變異的解釋標(biāo)準(zhǔn)和指南”進(jìn)行致病性分析[5]，c.1679delA導(dǎo)致缺失突變后48個異常氨基酸后出現(xiàn)截短蛋白，是無功能突變，為致病突變（非常強(qiáng)致病性證據(jù)，PVS 1）。通過比照千人基因組數(shù)據(jù)庫（1000 Genomes）、人類基因突變數(shù)據(jù)庫（HGMD）和Clinvar數(shù)據(jù)庫及近5年文獻(xiàn)，未見c.1679delA突變報道和收錄（中等致病性證據(jù)，PM2）；c.1679delA為未經(jīng)父母驗證的新發(fā)變異（中等致病性證據(jù)，PM 6）；患兒的臨床表現(xiàn)與NIPBL基因突變導(dǎo)致的CdLS 表型高度吻合（支持性致病性證據(jù)，PP 4）。因此根據(jù)ACMG 評級規(guī)則，c.1679 delA 突變（PVS 1+PM 2+PM6+PP4）判斷為未見文獻(xiàn)報道的致病性變異。

圖2 患兒及父母NIPBL 基因突變測序結(jié)果

2 討論

CdLS于1933年首先由荷蘭籍兒科醫(yī)師在2例發(fā)育障礙患兒中描述。2018 年發(fā)表針對CdLS 的診斷和處理的專家共識[6]。共識評分標(biāo)準(zhǔn)：①主要特征（每一條記2分）：連眉和/或濃眉；短鼻，鼻梁塌陷和或鼻孔前傾；長和/或平人中；上嘴唇薄和/或嘴角下彎；手少指和/或無指；先天性膈疝。②次要特征（每一條記1分）：全面發(fā)育遲緩和或智力障礙；宮內(nèi)生長遲緩（＜2 SD）；生后生長遲緩（＜2 SD）；小頭畸形（宮內(nèi)和或生后）；小手和或小腳；小指短；多毛。根據(jù)專家共識，CdLS診斷標(biāo)準(zhǔn)為評分≥11分，即使沒有分子遺傳學(xué)檢測也可臨床診斷為CdLS。本例患兒根據(jù)評分標(biāo)準(zhǔn)的臨床評分為13 分，可診斷為經(jīng)典型CdLS。有多個基因（EP300、AFF4、NAA10）缺陷臨床表現(xiàn)與CdLS臨床表型有部分重疊，為類德朗熱樣綜合征。CdLS基因檢測中約15%～20%出現(xiàn)嵌合現(xiàn)象[7]，應(yīng)用一代測序方法檢測外周血淋巴細(xì)胞可能出現(xiàn)漏診，此外約30%臨床診斷為CdLS患者的遺傳背景尚不清楚。由于CdLS 診斷經(jīng)驗不足，本例患兒選擇全外顯子組基因檢測技術(shù)對外周血進(jìn)行分子診斷學(xué)研究。

Cohesin 復(fù)合物主要功能為參與姐妹染色單體聚合，確保有絲分裂和減數(shù)分裂過程中染色體的正確分離，同時在DNA修復(fù)、細(xì)胞功能維持和分化以及基因表達(dá)調(diào)控中具有非常重要的作用[8]。Cohesin復(fù)合物相關(guān)蛋白編碼基因發(fā)生突變導(dǎo)致CdLS的發(fā)生。SMC1A、SMC3和RAD21編碼cohesin復(fù)合物的三個核心亞基，NIPBL和HDAC8編碼蛋白為cohesin復(fù)合物調(diào)節(jié)蛋白。在明確與CdLS相關(guān)的5個基因中可找到約70%的致病突變，NIPBL為CdLS最常見致病基因，在具有典型臨床表型的CdLS中NIPBL致病突變檢出率為60%[9]。在對基因型與臨床表型的相關(guān)性研究中表明，攜帶NIPBL突變患者與SMC1A、SMC3、RAD21和HDAC8突變的患者相比更易出現(xiàn)嚴(yán)重表型[10]。NIPBL中具有無義、剪接位點和移碼突變導(dǎo)致截短突變的患者比具有錯義突變的患者具有更嚴(yán)重的表型[11]。本例患兒在NIPBL基因上檢測到一個缺失突變，導(dǎo)致缺失突變后48個異常氨基酸出現(xiàn)截短蛋白，臨床表現(xiàn)為經(jīng)典型CdLS，與文獻(xiàn)報道一致。NIPBL外顯子32缺失會影響復(fù)合物中NIPBL編碼的蛋白與其他蛋白結(jié)合，臨床表型嚴(yán)重[3]，c.1679delA 突變導(dǎo)致第9外顯子后包含外顯子32編碼的蛋白質(zhì)缺失，可能為該突變臨床表型嚴(yán)重的原因之一。本例患兒父母未檢測到相應(yīng)變異，臨床表型正常，考慮患兒為自發(fā)突變可能。有報道一對正常夫婦由于性腺嵌合，孕育兩次NIPBL突變胎兒[12]。因此不能排除患兒父母生殖細(xì)胞嵌合體可能，在父母孕育下一胎時建議羊水或絨毛膜穿刺進(jìn)行產(chǎn)前診斷。此外，有報道CdLS 基因檢測中約15%～20%出現(xiàn)嵌合現(xiàn)象，外周血檢測陰性，口腔頰黏膜細(xì)胞或者皮膚成纖維細(xì)胞檢測陽性[7,13]。本例患兒父母僅進(jìn)行外周血檢測，不能排除為嵌合體可能，但患兒父母無特殊面容，智力正常，可能性較小。

CdLS 為類似于唐氏綜合征和脆性X 綜合征一樣具有典型的畸形特征和智力遲鈍的一種疾病。文獻(xiàn)報道，連眉、濃眉、多毛和喂養(yǎng)困難見于90%以上CdLS患者[14]。本例患兒孕期就存在宮內(nèi)發(fā)育受限，出生后發(fā)現(xiàn)面容特殊、體質(zhì)量增長緩慢。有文獻(xiàn)報道，80%CdLS患兒在妊娠中期發(fā)現(xiàn)對稱性宮內(nèi)生長受限[15]。對于沒有明確基因突變類型的下一胎產(chǎn)前診斷可行B 超了解胎兒生長發(fā)育及面部輪廓、肢體異常來診斷。本例患兒在孕期發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)發(fā)育遲緩，進(jìn)行產(chǎn)前分子遺傳學(xué)檢查可能有助于減輕家庭的負(fù)擔(dān)[4]。在肢體異常中，上肢較下肢畸形更常見及嚴(yán)重，上肢畸形中可出現(xiàn)小手、第一掌骨縮短、短指、并指、近端橈骨頭發(fā)育不全、尺骨缺損等，下肢畸形通常較輕微，包括小腳，縮短的趾骨和雙側(cè)馬蹄足等，NIPBL中截短蛋白突變更易出現(xiàn)嚴(yán)重型肢體畸形[15]。本例患兒為NIPBL截短蛋白突變，肢體缺陷僅表現(xiàn)為小手和第四趾骨縮短，但未行雙上肢的X線檢測，不能完全排除存在近端橈骨頭發(fā)育不全和尺骨缺損可能。

本例患兒以足月小樣兒及生后生長緩慢為主要臨床表現(xiàn)，伴有特殊面容和多發(fā)畸形，臨床醫(yī)師易傾向于染色體組病，盡管CdLS 也有少數(shù)大片段缺失報道，但主要為點突變。本例患兒在外院行染色體微陣列檢測未發(fā)現(xiàn)異常，因此臨床在診治類似患兒時應(yīng)首選基因檢測，減少患兒家長經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。由于CdLS存在體細(xì)胞嵌合現(xiàn)象，外周血淋巴細(xì)胞檢測可出現(xiàn)陰性，建議口腔頰黏膜細(xì)胞為首選檢測標(biāo)本。