貂源冠狀病毒與2019新型冠狀病毒的遺傳進(jìn)化關(guān)系

楊艷玲，程世鵬，任林柱

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林長(zhǎng)春 130122；2.吉林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130062）

水貂冠狀病毒（mink coronavirus，MCoV）最早流行于美國(guó)的猶他州，1987年我國(guó)從北美進(jìn)口種貂時(shí)帶入該病毒[1]。近年來，我國(guó)山東省水貂養(yǎng)殖場(chǎng)中曾有MCoV感染發(fā)生，但感染率不高，致死率較低。MCoV主要引起水貂流行性卡他性胃腸炎，主要臨床表現(xiàn)為：腹瀉，排灰白色、綠色及粉黃色黏液狀稀便，有的排黑紅色、沒有明顯套管樣稀便；同時(shí)伴有食欲不振、嘔吐、精神萎靡、口渴、鼻鏡干燥、被毛欠光澤、消瘦、皮膚缺乏彈性等癥狀；體溫一般不高，多因脫水發(fā)生自體中毒而死亡[2]。

人冠狀病毒HCoV-19為2019年在我國(guó)武漢市引起人嚴(yán)重呼吸道感染的新型冠狀病毒，最初被命名為2019-nCov，后被國(guó)際病毒分類委員會(huì)更名為SARS-Cov-2。但是，由于SARS-Cov-2與SARS-Cov不同，將該病毒命名為SARS-Cov-2容易引起歧義，因此現(xiàn)在我國(guó)科學(xué)家將該病毒命名為HCoV-19[3-6]。

為進(jìn)一步明確我國(guó)貂源冠狀病毒與新型冠狀病毒（HCoV-19）的遺傳進(jìn)化關(guān)系，本研究比較了NCBI上公布的3株水貂冠狀病毒、5株雪貂冠狀病毒以及人冠狀病毒HCoV-19 和SARS-Cov的全基因組、ORF1a、ORF1ab以及病毒表面蛋白Spike的序列同源性，并分析了其遺傳進(jìn)化關(guān)系以及組成病毒的所有結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白的種類、基因位置及氨基酸數(shù)量。

1 材料與方法

1.1 基因序列

下載并整理NCBI上公布的3株水貂冠狀病毒、5株雪貂冠狀病毒、1株人源新型冠狀病毒HCoV-19（GenBank登錄號(hào)NC_045512）和1株人源SARS-Cov（GenBank登錄號(hào)AY274119）的全基因組序列。3株水貂冠狀病毒包括：1株中國(guó)株（GenBank登錄號(hào)MF113046）[2]，2株美國(guó)株（GenBank登錄號(hào)HM245926、NC_023760）[7]；5株雪貂冠狀病毒包括：2株美國(guó)株（GenBank登錄號(hào)KX512810、KX512809），2株日本株（GenBank登錄號(hào)LC215871、LC119077）[8]，1株荷蘭株（GenBank登錄號(hào)NC030292）。

1.2 序列同源性及遺傳進(jìn)化關(guān)系分析

根據(jù)下載的10株冠狀病毒基因組序列，分別整理每一株冠狀病毒的全基因組序列、ORF1a、ORF1ab和病毒表面蛋白Spike的編碼基因序列及其蛋白序列，并利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列同源性比對(duì)及進(jìn)化樹繪制。

同時(shí)，對(duì)冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的種類、基因位置及氨基酸數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，用于分析不同冠狀病毒株的全基因組成差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分類

根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)（ICTV）對(duì)冠狀病毒的分類標(biāo)準(zhǔn)，HCoV-19屬于巢病毒目冠狀病毒科正冠狀病毒亞科Betacoronavirus屬Sarbecovirus亞屬類SARS病毒種，而水貂冠狀病毒MCoV屬于α冠狀病毒，與雪貂冠狀病毒同屬于α冠狀病毒2亞屬。為此，在病毒分類上，水貂冠狀病毒、雪貂冠狀病毒與新型冠狀病毒HCoV-19不是同一屬的冠狀病毒。

2.2 全基因組相似性

比較了NCBI上公布的3株水貂冠狀病毒、5株雪貂冠狀病毒、HCoV-19和SARS-Cov的全基因組序列相似性。結(jié)果顯示，貂源冠狀病毒與HCoV-19的基因組序列相似性為68.42%，其中水貂冠狀病毒中國(guó)分離株與HCoV-19的全基因組相似性為50.57%，與SARS-Cov的相似性為50.34%（表1）。以上分析表明，HCoV-19與貂源冠狀病毒的基因組相似性較低。

2.3 基因組遺傳進(jìn)化關(guān)系

貂源冠狀病毒與HCoV-19的全基因組遺傳進(jìn)化分析顯示，8株貂源冠狀病毒與2株人源冠狀病毒（HCoV-19和SARS-Cov）不屬于同一種冠狀病毒分支，而且遺傳進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。2株人源冠狀病毒（HCoV-19和SARS-Cov）屬于同一種冠狀病毒下的同一分支，親緣關(guān)系較近；8株貂源冠狀病毒屬于同一種冠狀病毒分支，但是其中的3株水貂冠狀病毒和5株雪貂冠狀病毒又各自形成一個(gè)獨(dú)立分支，即水貂冠狀病毒與雪貂冠狀病毒不屬于同一分支（圖1）。為此，通過全基因組遺傳進(jìn)化關(guān)系分析，可以明確貂源冠狀病毒與新型冠狀病毒HCoV-19不在同一分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表1 水貂冠狀病毒中國(guó)分離株與其他冠狀病毒的同源性 %

圖1 貂源冠狀病毒與HCoV-19全基因組進(jìn)化關(guān)系

2.4 ORF1a和ORF1ab一致性

冠狀病毒ORF1a和ORF1ab非結(jié)構(gòu)蛋白序列一致性是國(guó)際病毒分類委員會(huì)對(duì)冠狀病毒種屬分類的依據(jù)。如果兩個(gè)冠狀病毒的序列一致性大于90%這個(gè)閾值，則表示兩個(gè)冠狀病毒屬同一種。通過對(duì)水貂冠狀病毒和人冠狀病毒ORF1a基因序列的分析發(fā)現(xiàn)，水貂冠狀病毒與HCoV-19的ORF1a基因相似性為46.96%，ORF1ab基因相似性為52.44%；與SARS-Cov的ORF1a基因相似性為47.39%，ORF1ab相似性為52.24%。水貂冠狀病毒與HCoV-19的ORF1a蛋白相似性為 72.02%，ORF1ab蛋白相似性為76.53%；與SARS-Cov 的ORF1a蛋白相似性為72.46%，ORF1ab蛋白相似性為 76.69%（表1）。ORF1a和ORF1ab的基因遺傳進(jìn)化關(guān)系分析顯示：貂源冠狀病毒與人源冠狀病毒不屬于同一種，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而HCoV-19和SARS-Cov屬于同一分支。另外，雪貂冠狀病毒和水貂冠狀病毒同屬一個(gè)種下的不同分支（圖2～3）。通過對(duì)ORF1a和ORF1ab一致性分析，進(jìn)一步明確了貂源冠狀病毒和人源冠狀病毒不是同一種冠狀病毒。

圖2 貂源冠狀病毒與HCoV-19的ORF 1ab進(jìn)化分析

2.5 Spike蛋白同源性

圖3 貂源冠狀病毒與HCoV-19的ORF 1a進(jìn)化分析

刺突糖蛋白（Spike glycoprotein，S glycoprotein）是病毒與人源細(xì)胞上血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）受體結(jié)合，幫助病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的重要成分，是冠狀病毒疫苗設(shè)計(jì)、治療性抗體研究、臨床診斷試劑開發(fā)及抗病毒藥物發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵靶點(diǎn)，也是冠狀病毒進(jìn)化過程中比較容易變異的主要成分。本研究分析了不同貂源冠狀病毒以及HCoV-19、SARS-Cov的S蛋白編碼基因同源性。結(jié)果顯示：貂源冠狀病毒與HCoV-19的S蛋白編碼基因相似性為47.36%，與SARS-Cov的相似性為46.15%；HCoV-19和SARS-Cov兩株冠狀病毒的S蛋白編碼基因相似性為74.29%；3株水貂冠狀病毒間的S蛋白相似性為85%，5株雪貂冠狀病毒間的S蛋白相似性為88.4%；水貂與雪貂冠狀病毒間的S蛋白相似性為74.86%。Spike 蛋白遺傳進(jìn)化分析顯示：貂源冠狀病毒與HCoV-19不屬于同一分支，遺傳進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)；3株水貂冠狀病毒的S蛋白和5株雪貂冠狀病毒的S蛋白屬于同一種下的兩個(gè)分支（圖4）。可見，貂源冠狀病毒與HCoV-19 的Spike蛋白同源性較低，遺傳進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖4 貂源冠狀病毒與HCoV-19 Spike蛋白的進(jìn)化分析

2.6 全基因組的蛋白組成、基因位置和氨基酸數(shù)量

為進(jìn)一步明確貂源冠狀病毒與人源冠狀病毒HCoV-19的結(jié)構(gòu)差異，分別對(duì)1株水貂冠狀病毒中國(guó)分離株、1株水貂冠狀病毒美國(guó)分離株、1株雪貂冠狀病毒和1株人冠狀病毒HCoV-19武漢分離株的主要蛋白、各組分基因位置及氨基酸數(shù)量進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果顯示：4種不同冠狀病毒在蛋白組成上存在顯著差異，其中HCoV-19編碼的結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白有12個(gè)，而水貂冠狀病毒僅有10個(gè)，雪貂冠狀病毒有9個(gè)。另外，相同蛋白編碼基因的位置相差也較大，尤其是N蛋白。HCoV-19的N蛋白在基因組28 274～29 533核苷酸之間，而水貂和雪貂的N蛋白位置比較相似，分別位于基因組26 454～27 584和26 368～27 492核苷酸之間。此外，氨基酸的數(shù)量差異也比較大，如ORF1a、ORF1ab、S蛋白等重要結(jié)構(gòu)蛋白在貂源冠狀病毒與HCoV-19之間差異十分顯著（表2）。以上分析表明，貂源冠狀病毒與新型冠狀病毒的蛋白組成、基因位置和氨基酸數(shù)量均存在明顯差異。

3 討論

冠狀病毒是一類家族龐大的病原微生物，目前有α、β、γ和δ 4個(gè)屬[9-10]。而且感染宿主比較廣泛，包括多種野生動(dòng)物、家養(yǎng)哺乳動(dòng)物、家禽等。已知感染豬的冠狀病毒有6種，分別是豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬呼吸道冠狀病毒（PRCV）、豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（SADS-CoV）、豬血凝性腦脊髓炎病毒（PHEV）和豬δ冠狀病毒（PDCoV）[11]。家禽冠狀病毒感染危害較大的是屬于γ冠狀病毒屬的雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）。此外，鴨冠狀病毒、鵝冠狀病毒和鴿冠狀病毒等在家禽中也有檢出。一些野禽可感染δ屬冠狀病毒（如鵝口瘡冠狀病毒HKU12等）[12]。牛冠狀病毒（BCoV）是β冠狀病毒屬的成員，主要引起犢牛胃腸炎、呼吸道疾病、奶牛冬季痢疾及牛運(yùn)輸發(fā)熱性肺炎等[13]。有研究分別對(duì)豬冠狀病毒[11]、禽冠狀病毒[12]與人冠狀病毒HCoV-19進(jìn)行了基因組相似性的比對(duì)及遺傳進(jìn)化關(guān)系分析，結(jié)果均發(fā)現(xiàn)豬和禽的冠狀病毒與HCoV-19的基因組相似性僅為40%左右，相似性較低，這些冠狀病毒與人冠狀病毒的親緣關(guān)系也較遠(yuǎn)。本研究分析發(fā)現(xiàn)，貂源冠狀病毒與人源冠狀病毒的全基因組相似性僅為68%，相似性較低，同時(shí)遺傳進(jìn)化關(guān)系顯示，它們不在同一分支，而且親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。在病毒分類上，貂源冠狀病毒屬于α冠狀病毒[14]，而人冠狀病毒HCoV-19屬于β屬冠狀病毒[7]。本研究結(jié)果也顯示，它們不在同一分支。

表2 水貂冠狀病毒與人冠狀病毒全基因組蛋白的核苷酸位置及氨基酸數(shù)量

為明確貂源冠狀病毒與HCoV-19的親緣關(guān)系，對(duì)ORF1a和ORF1ab的氨基酸序列一致性進(jìn)行了比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)貂源冠狀病毒與HCoV-19的ORF1a和ORF1ab氨基酸一致性分別為72.02%和76.53%。根據(jù)國(guó)際病毒分類委員會(huì)的冠狀病毒分類依據(jù)，ORF1a和ORF1ab的序列一致性需要大于90%這個(gè)閾值，才表示兩個(gè)冠狀病毒屬同一種。本研究的數(shù)據(jù)分析結(jié)果進(jìn)一步說明，貂源冠狀病毒與人冠狀病毒HCoV-19不屬于同一種。同時(shí)，本研究還將貂源冠狀病毒與HCoV-19的全基因組組成、基因位置及氨基酸數(shù)量進(jìn)行了比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩株冠狀病毒在基因組構(gòu)成上的差異十分顯著，最明顯的是兩株冠狀病毒的構(gòu)成成分。貂源冠狀病毒編碼的閱讀框有10個(gè)蛋白質(zhì)，而HCoV-19有12個(gè)，且編碼基因在基因組中的位置也有較大差異，尤其是N蛋白差別很大。通過對(duì)全基因組的詳細(xì)對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，貂源冠狀病毒與毒HCoV-19不是同一種冠狀病毒。

4 結(jié)論

通過對(duì)HCoV-19武漢流行株和已經(jīng)公布的水貂、雪貂冠狀病毒株進(jìn)行全基因組系統(tǒng)分析，明確了貂源冠狀病毒與人冠狀病毒HCoV-19不是同一種冠狀病毒，而且親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；此次流行的人冠狀病毒由貂源冠狀病毒重組而成的可能性很小，可初步排除HCoV-19來源于水貂和雪貂的可能性。