甘肅省武威市駱駝蜱及梨形蟲病病原分子生物學(xué)調(diào)查

（民勤縣畜牧獸醫(yī)工作站，甘肅民勤 733399）

按中國(guó)動(dòng)物地理區(qū)劃，武威市屬于古北界，地處黃土高原、青藏高原和蒙新高原三大高原交匯地帶，地勢(shì)西高東低，局部地形復(fù)雜，是典型的蒙新區(qū)西部荒漠和半荒漠地區(qū)，也是駱駝生息繁衍的理想場(chǎng)所。民勤縣是聞名的“駱駝之鄉(xiāng)”，豢養(yǎng)使役駱駝歷史悠久，古有“漢馬唐駝”的說法。多年來，武威市駱駝養(yǎng)殖一直以傳統(tǒng)放牧為主，主要飼養(yǎng)于騰格里沙漠和巴丹吉林沙漠沿邊區(qū)域。近年來，因政府發(fā)布禁牧政策，自由式的放牧已不再適應(yīng)駱駝養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，導(dǎo)致駱駝數(shù)量急劇減少。

動(dòng)物梨形蟲病是世界各國(guó)公認(rèn)的、最重要的一類寄生蟲病之一。該病在我國(guó)分布廣泛，常呈地方性流行，給疫區(qū)畜牧業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。20世紀(jì)70～90年代，王心娥等[1]、康新民等[2]、姚文炳[3]對(duì)河西三地區(qū)和阿拉善盟地區(qū)的駱駝蜱類區(qū)系做過詳細(xì)調(diào)查，但僅作了蜱蟲種類鑒定，而對(duì)梨形蟲病病原在媒介蜱和貯藏宿主體內(nèi)的感染分布情況未作詳細(xì)描述。駱駝在自由放牧過程中接觸環(huán)境中媒介蜱蟲的概率較高。蜱蟲可通過吸取宿主血液，造成駱駝貧血、消瘦、營(yíng)養(yǎng)不良、內(nèi)臟機(jī)能受損、生產(chǎn)性能下降，更為嚴(yán)重的是蜱蟲可傳播多種疾病，如不采取有效的防治措施，會(huì)給駱駝產(chǎn)業(yè)造成毀滅性打擊。為深入了解和逐步保護(hù)開發(fā)駱駝產(chǎn)業(yè)，對(duì)武威市駱駝媒介蜱及其貯藏在體內(nèi)的梨形蟲病病原進(jìn)行了分子流行病學(xué)調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 試劑

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、TaKaRa ExTaq?、RNase-free Water、X-gal、IPTG，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；pGEM-T Easy載體，為Promega公司產(chǎn)品；DNA提取試劑盒，購(gòu)自QIAGEN公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒（ZymocleanGel DNA Recovery Kit），購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 基因組DNA

臨床樣品為2018年6—7月采自武威市“甘蒙”邊界21匹駱駝體表的蜱蟲及相對(duì)應(yīng)駱駝的抗凝血樣品，其中抗凝血樣品21份、蜱樣品40份。蜱樣品為饑餓成蜱或半飽血雌蜱，其中雄蜱8只、雌蜱32只。使用QIAGEN公司的基因組提取試劑盒（No.51306）提取臨床樣品基因組DNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。梨形蟲病病原陽性及陰性基因組DNA，均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所外寄生蟲與蟲媒疫病團(tuán)隊(duì)提供。

1.3 方法

1.3.1 蜱蟲形態(tài)學(xué)鑒定 借助顯微鏡，對(duì)采集的饑餓成蜱（雌蜱）進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.3.2 梨形蟲病病原通用引物設(shè)計(jì)及基因擴(kuò)增 參考文獻(xiàn)[4-5]，設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增巴貝斯蟲和泰勒蟲（統(tǒng)稱為梨形蟲病病原）18S rRNA基因的巢式PCR通用引物2對(duì)：VP-1F（5'-CCT TCCTTTAAGTGATAAGGTTCAC-3'），VP-1R（5'-GACGGTAGGGTATTGGCCTmCCG-3'，簡(jiǎn)并堿基m=A+C）；VP-2F（5'-ATTACCCAATmC bGACACvGkGAGG-3'，簡(jiǎn)并堿基v=A+C+G，b=T+C+G，k=T+G，m=A+C）；VP-2R（5'-TTAAATACGAATGCCCCCAAC-3'）。以實(shí)驗(yàn)室保存的動(dòng)物梨形蟲病病原基因組為模板，分別以陽性基因組、陰性基因組和PCR用水為陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，在25 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行第1輪擴(kuò)增：10×PCR buffer（Mg2+plus）2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L each）2.0 μL，TaqDNA polymerase 1.25 U，VP-1F和VP-1R引物（10 μmol/L）各1 μL，基因組模板1 μL，PCR用水補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。然后以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用VP-2F和VP-2R引物對(duì)進(jìn)行第2輪擴(kuò)增，反應(yīng)體系同上。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min，4 ℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠（含8 μL/100 mL的Goldview I 型核酸染色劑）電泳分析，觀察擴(kuò)增結(jié)果。在380～420 bp位置出現(xiàn)特異性目的條帶時(shí)，判定為動(dòng)物梨形蟲病病原樣品陽性。對(duì)擴(kuò)增的陽性目的條帶進(jìn)行膠回收，將所得目的片段與pGEM-T Easy載體連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Trans DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，用含氨芐青霉素的LB平板篩選陽性菌落。將PCR鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送西安擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)定的基因片段經(jīng)BLASTn分析，鑒定引物擴(kuò)增特異性區(qū)段的正確性。

2 結(jié)果

2.1 蜱形態(tài)學(xué)鑒定

通過顯微鏡對(duì)采集的饑餓成蜱（雌蜱）進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)：盾板橢圓多角形，后緣尖窄，暗呈角狀，亮褐至暗褐色；氣門板逗點(diǎn)形，背突細(xì)窄，氣門板后緣在背突基部較直；足粗細(xì)適中，呈黃褐色或赤褐色，關(guān)節(jié)的淡色環(huán)帶及背緣談色縱帶較窄；爪墊短小，不及爪長(zhǎng)一半。根據(jù)以上形態(tài)學(xué)特征，鑒定該蜱為亞洲璃眼蜱（圖1）。

圖1 蜱蟲鑒定結(jié)果

2.2 蜱體內(nèi)梨形蟲病病原基因擴(kuò)增

通過巢式PCR擴(kuò)增鑒定，從駱駝體表采集的40份蜱樣品中擴(kuò)增出陽性樣品1份，經(jīng)測(cè)序鑒定為雙芽巴貝斯蟲；將擴(kuò)增的序列提交GenBank，獲得基因序列登錄號(hào)MK418667。

2.3 駱駝抗凝血中梨形蟲病病原基因擴(kuò)增

通過巢式PCR擴(kuò)增，在采集的21份駱駝抗凝血樣中，未檢測(cè)出巴貝斯蟲和泰勒蟲病原。

3 討論

研究[1-2]顯示：20世紀(jì)70～90年代，武威市駱駝蜱蟲種類主要為鈍跗硬蜱（Ixodes pomerantzevi Serdukova，1941年）、亞東璃眼蜱（Hyalomma asisticum kozlovi Olenev，1931年）、亞洲璃眼蜱（H.asistisum asiaticum Schlze &Schlottke，1929年）和波斯銳緣蜱（Argas persicus Oken，1818年）。此次調(diào)查所采集到的蜱蟲經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為亞洲璃眼蜱，證實(shí)亞洲璃眼蜱依然是該地的優(yōu)勢(shì)種。亞洲璃眼蜱是一種三宿主蜱，主要分布于我國(guó)新疆、內(nèi)蒙古、青海以及中亞地區(qū)；宿主廣泛，以牛、羊、馬、犬、兔、鼠等哺乳動(dòng)物及鳥類為主[6]；而波斯銳緣蜱作為雞蜱蟲的優(yōu)勢(shì)種，孫明等[7-8]于2015年7月在民勤縣蘇武鎮(zhèn)農(nóng)戶所養(yǎng)殖的家禽上已發(fā)現(xiàn)；其余兩種蜱蟲，近幾年未有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

在國(guó)內(nèi)外已有的文獻(xiàn)中，駱駝泰勒蟲（Theileria camelensis）僅為單峰駝的一種寄生蟲，也是唯一一種寄生于駱駝的蜱傳性寄生蟲病[9]，主要分布于埃及和利比亞，在埃及的流行率為30%，在利比亞的流行率為6.5%，在伊朗也有發(fā)現(xiàn)[10-12]，但沒有相關(guān)的流行病學(xué)數(shù)據(jù)公布。最近，對(duì)約旦單峰駝血液的分子研究[13]揭示了單峰駝中存在馬巴貝斯蟲（Babesia caballi）和馬泰勒蟲（T.equi），但是紅細(xì)胞的顯微鏡檢查并沒有發(fā)現(xiàn)巴貝斯蟲及泰勒蟲。在感染泰勒蟲的駱駝體表獲得的硬蜱中，嗜駝璃眼蜱（Hyalomma dromedarii）為優(yōu)勢(shì)種。蒙古國(guó)雙峰駝上寄生有亞洲璃眼蜱（Hy.asiaticum）、草原革蜱、達(dá)吉斯坦革蜱（De.daghestanicus）和短小扇頭蜱（Rh.pumilio）的報(bào)道[14]，阿富汗[15]、伊朗[16]也有亞洲璃眼蜱叮咬駱駝的報(bào)道。此次流行病學(xué)調(diào)查在駱駝體表的蜱體內(nèi)檢出雙芽巴貝斯蟲病原，說明當(dāng)?shù)卮嬖谕ㄟ^蜱傳播梨形蟲病的風(fēng)險(xiǎn)。本次調(diào)查雖然在駱駝抗凝血樣品中并未檢出梨形蟲病病原，但這并不能說明該地駱駝中不存在梨形蟲病流行，很有可能與此次樣本的采樣數(shù)量過小有關(guān)。

盡管國(guó)內(nèi)外關(guān)于駱駝梨形蟲病的報(bào)道不多，但駱駝體表的蜱蟲作為動(dòng)物梨形蟲病病原或其他媒介動(dòng)物疫病的貯存宿主，給公共衛(wèi)生和人畜安全帶來了嚴(yán)重威脅。有文獻(xiàn)證實(shí)，駱駝上的蜱在環(huán)形泰勒蟲病、東海岸熱、牛心水病傳播中起重要作用[17]，璃眼蜱和革蜱被列為馬梨形蟲病的傳播媒介[18-19]；在我國(guó)內(nèi)蒙古地區(qū)，草原革蜱和亞洲璃眼蜱是人西伯利亞立克次氏體的傳播媒介。而本次在駱駝體表的蜱體內(nèi)檢出雙芽巴貝斯蟲，同樣警示蜱作為動(dòng)物梨形蟲病病原的傳播媒介，在叮咬宿主繁衍后代的同時(shí)也可傳播疫病，如不采取有效的防治措施，將給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重影響。

綜上所述，PCR技術(shù)具有快速、敏感、特異性高的優(yōu)點(diǎn)，為駱駝蜱及梨形蟲病的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了有效的技術(shù)手段。此次調(diào)查，也是甘肅省基層獸醫(yī)機(jī)構(gòu)首次利用分子生物學(xué)檢測(cè)手段，開展動(dòng)物梨形蟲病病原檢測(cè)，將有助于全省基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室提高動(dòng)物疫病檢測(cè)能力。