白細(xì)胞介素-37在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)及意義*

柯慶喜，黃 震，余紅嵐，陳思達(dá)，束振華，武紅梅

(1.貴陽(yáng)市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州貴陽(yáng) 550001；深圳市龍崗中心醫(yī)院:2.檢驗(yàn)科；3.內(nèi)分泌科，廣東深圳 518116)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是以累積周?chē)P(guān)節(jié)為主的慢性炎癥性自身免疫病，表現(xiàn)為滑膜襯里細(xì)胞增生、間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以及血管翳的形成及軟骨和骨組織的破壞等[1]。RA的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，現(xiàn)有的研究證實(shí)炎性細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)在RA的滑膜炎癥中起著關(guān)鍵作用，RA滑膜組織產(chǎn)生的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，是引起炎癥反應(yīng)、蛋白水解、細(xì)胞募集和增殖的重要介質(zhì)。白細(xì)胞介素(IL)-37是一種抗炎細(xì)胞因子，目前研究發(fā)現(xiàn)IL-37在多種疾病中起到保護(hù)作用，特別是對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡[2]、克羅恩病[3]、病態(tài)肥胖[3]等自身免疫性疾病以及脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的感染性休克方面具有明顯的抗炎保護(hù)作用?；顒?dòng)性RA患者滑膜內(nèi)層高表達(dá)IL-37，而在健康人群中卻不表達(dá)[4]。IL-37作為抑炎性因子，可能通過(guò)介導(dǎo)一種負(fù)反饋機(jī)制來(lái)抑制炎癥，這提示IL-37參與了RA的發(fā)病進(jìn)程。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1對(duì)照組 收集2018年1-8月在貴陽(yáng)市第一人民醫(yī)院體檢中心體檢的30例健康標(biāo)本，其中男13例，女17例，年齡23～68歲，平均(34.4±6.2)歲，經(jīng)檢查無(wú)急慢性病史、無(wú)遺傳病家族史、無(wú)自身免疫性疾病。

1.1.2疾病組 收集2018年1-8月在貴陽(yáng)市第一人民醫(yī)院就診的RA患者60例。診斷符合2010年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)/歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(EULAR)RA評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[5]。排除重度感染、嚴(yán)重心腦血管病、肝腎疾病、惡性腫瘤、活動(dòng)性結(jié)核病。并根據(jù)臨床資料計(jì)算類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病活動(dòng)性評(píng)分(DAS)，將其分為活動(dòng)期RA患者30例，其中男8例，女22例，年齡20～72歲，平均(47.32±13.21)歲，穩(wěn)定期RA患者30例，其中男12例，女18例，年齡26～76歲，平均(48.41±14.68)歲。本研究經(jīng)貴陽(yáng)市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清IL-37水平 采集患者清晨空腹靜脈血3 mL。離心后取上清，置于-20 ℃保存待測(cè)。全部標(biāo)本一次性檢測(cè)。血清IL-37測(cè)定采用ELISA，試劑盒購(gòu)自武漢華美生物公司。操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè) 提取患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，采用Trizol法提取總RNA。按寶生物Prime Script RT Master Mix試劑盒說(shuō)明進(jìn)行cDNA合成。IL-37基因特異性引物(根據(jù)GENBank 登錄號(hào)NM_014439的IL-37的基因序列設(shè)計(jì))及看家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物均由廣州英駿公司合成，引物序列見(jiàn)表1。采用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行目的基因的檢測(cè)，按照寶生物公司SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒說(shuō)明在ABI Prism 7500 型熒光定量PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)進(jìn)行定量檢測(cè)。反應(yīng)體系為20 μL。取樣本總cDNA總量2 μL，10 μmol/L。上下游引物各0.8 μL，加入試劑盒其他成分。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s后，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)熔解曲線控制每個(gè)樣品的擴(kuò)增特異性。每一個(gè)樣品目的基因擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)(Ct)都依據(jù)GAPDH進(jìn)行校正，得出ΔCt(Ct目的基因-CtGAPDH)。目標(biāo)基因表達(dá)差異以疾病組相對(duì)于對(duì)照組的倍數(shù)表示，即檢測(cè)基因的差異為2-ΔΔCt(ΔΔCt=ΔCt疾病組-ΔCt對(duì)照組)。

1.2.3類(lèi)風(fēng)濕因子(RF)和抗環(huán)瓜氨酸肽(CCP)抗體檢測(cè) 血清RF的檢測(cè)，采用日立7600全自動(dòng)生化儀及配套試劑，運(yùn)用免疫透射比濁法，嚴(yán)格按照儀器操作手冊(cè)測(cè)定，血清中抗CCP抗體采用羅氏電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑測(cè)定。

2 結(jié) 果

2.1RA患者PBMC中IL-37 mRNA的表達(dá)檢測(cè) 以對(duì)照組細(xì)胞作為空白組樣品，計(jì)算出各個(gè)實(shí)驗(yàn)組樣品相對(duì)于空白組樣品的基因相對(duì)表達(dá)量(2-ΔΔCt)。活動(dòng)期RA患者組PBMC IL-37 mRNA的相對(duì)表達(dá)量與穩(wěn)定期RA患者組PBMC IL-37 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別是對(duì)照組的3.35倍和2.19倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而活動(dòng)期RA患者組IL-37 mRNA相對(duì)表達(dá)量與穩(wěn)定期RA患者組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

表1 IL-37引物序列表

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與穩(wěn)定期組比較，#P<0.05。

圖1不同組別RA患者PBMC IL-37mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.2血清IL-37 ELISA檢測(cè)結(jié)果 根據(jù)直線回歸方程式代入各樣本吸光度值，計(jì)算出所有樣本的IL-37濃度，結(jié)果顯示RA患者血清IL-37水平明顯高于對(duì)照組[(71.27±23.56)pg/mLvs. (17.13±5.64)pg/mL]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.81,P=0.000)。通過(guò)臨床資料分析，進(jìn)一步將RA患者分為活動(dòng)期組與穩(wěn)定期組，結(jié)果顯示與穩(wěn)定期RA患者[(55.13±13.55)pg/mL]比較，活動(dòng)期RA患者血清IL-37的水平[(87.41±19.68)pg/mL]明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.99,P=0.000)。

表2 不同組別RA患者血清IL-37水平與病情診斷評(píng)分相關(guān)性分析

2.3RA患者血清抗CCP抗體、RF水平與IL-37水平相關(guān)性分析 RA患者血清IL-37水平與抗CCP抗體、RF抗體的水平呈正相關(guān)(r=0.468，P=0.001；r=0.384，P=0.004)，見(jiàn)圖2、3。

2.4IL-37血清水平與RA診斷評(píng)分相關(guān)性 活動(dòng)期組與穩(wěn)定期組血清IL-37水平與RA患者病情診斷評(píng)分均呈正相關(guān)(P<0.05),見(jiàn)表2。

圖2 RA患者血清IL-37水平與抗CCP抗體的相關(guān)性

圖3 RA患者血清IL-37水平與RF的相關(guān)性

3 討 論

RA是以累及周?chē)P(guān)節(jié)為主的多系統(tǒng)炎癥性的自身免疫病。RA的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，現(xiàn)有的研究證實(shí)，炎性細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)在RA的滑膜炎癥中起著關(guān)鍵作用，RA患者滑膜組織中存在著大量CD4+T的Th1細(xì)胞，它所產(chǎn)生的IL-1α、IL-1β和IL-18等細(xì)胞因子，具有很強(qiáng)的促炎作用[6]。IL-18能夠活化單核/巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)干擾素-γ(IFN-γ)產(chǎn)生，導(dǎo)致RA炎癥反應(yīng)加重。研究表明IL-37能與IL-18BP和IL-18Rα的Fc段結(jié)合形成三元絡(luò)合物，抑制IL-18的信號(hào)傳導(dǎo)通路，促使細(xì)胞核因子κB不發(fā)生移位，減少了IFN-γ的合成[7-8]，提示IL-37可通過(guò)抑制IFN-γ的合成來(lái)減輕RA炎癥反應(yīng)。IL-37通過(guò)抑制樹(shù)突狀細(xì)胞活性來(lái)實(shí)現(xiàn)其抗炎作用[9]。DCs可激活RA滑膜的自身反應(yīng)性T細(xì)胞,導(dǎo)致炎癥的持續(xù)存在。本實(shí)驗(yàn)研究表明RA患者中IL-37水平增加，使其可以抑制樹(shù)突狀細(xì)胞活性，減輕DCs引起的固有免疫應(yīng)答反應(yīng)。IL-37與Smad3相結(jié)合發(fā)揮炎癥抑制效應(yīng)，研究證實(shí)Smad3參與了IL-37胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[10]。Smad3可與TGF-β結(jié)合使Smad3磷酸化，并轉(zhuǎn)移至胞核內(nèi)影響基因轉(zhuǎn)錄，IL-37可部分通過(guò)Smad3行使其功能，促進(jìn)TGF-β細(xì)胞因子抑制屬性，從而發(fā)揮其抗炎功效。

研究對(duì)收集的RA患者病例，依據(jù)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病活動(dòng)性評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，將其分為活動(dòng)期組和穩(wěn)定期組。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)RA患者PBMC IL-37 mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)RA患者組的IL-37 mRNA表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，并且活動(dòng)期組的上調(diào)量高于穩(wěn)定期組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示IL-37在RA的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮了作用，可能參與了RA的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)。現(xiàn)有的研究證實(shí)炎癥因子能夠上調(diào)人滑膜細(xì)胞IL-37的表達(dá)[11]。本研究應(yīng)用ELISA法檢測(cè)了RA患者血清IL-37水平，結(jié)果顯示，RA患者血清IL-37水平顯著高于對(duì)照組。活動(dòng)期組IL-37水平明顯高于穩(wěn)定期組。進(jìn)一步分析IL-37水平與RA臨床指標(biāo)相關(guān)性，結(jié)果表明RA患者IL-37水平與RF、抗CCP抗體水平有顯著相關(guān)性，患者RA疾病診斷評(píng)分與血清IL-37水平有顯著相關(guān)性，提示IL-37與RA患者嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。RF和抗CCP抗體作為RA特異性診斷和判斷預(yù)后的重要指標(biāo)；其高滴度的抗體水平常提示患者病情較重，進(jìn)展快，骨破壞嚴(yán)重，這提示IL-37水平與RA的病情嚴(yán)重程度具有一定相關(guān)性，IL-37可作為評(píng)估病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)而進(jìn)一步指導(dǎo)臨床診治。

綜上所述，RA患者中IL-37水平顯著增加，并且活動(dòng)期患者IL-37水平明顯高于穩(wěn)定期患者，表明IL-37參與了RA的發(fā)病過(guò)程。RA患者血清IL-37水平與RF、抗CCP抗體等RA自身抗體呈正相關(guān)，提示IL-37可作為評(píng)估病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)。IL-37是一種抗炎因子[12]，在RA發(fā)病機(jī)制中有重要作用，在RNA的病情判斷中有潛在應(yīng)用價(jià)值，但由于本試驗(yàn)樣本量較少，試驗(yàn)人群范圍有限，還需進(jìn)一步研究與探討。