臨床分離碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌株的血清莢膜分型及耐藥機(jī)制

嚴(yán) 宏，嚴(yán) 華

(武漢市第三醫(yī)院光谷院區(qū)：1.檢驗(yàn)科；2急診科，湖北武漢 430073)

肺炎克雷伯菌(KP)是臨床主要的條件致病菌之一，主要引起醫(yī)院獲得性肺炎及血流感染性疾病，尤其在新生兒、老年人、腫瘤患者等免疫力低下人群，或長期使用抗菌藥物人群中易感[1-2]。碳青霉烯類抗菌藥物因其抗菌譜廣，穩(wěn)定性較好等優(yōu)點(diǎn)而被用為治療臨床感染的首選藥物[3]。但隨著該類抗菌藥物頻繁使用，碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌(CRKP)逐漸增多。研究發(fā)現(xiàn)部分KP可產(chǎn)生莢膜，形成高黏液表型，具有高毒力，高耐藥率等特點(diǎn)[4]。莢膜是KP重要的毒力因子，其種類多變，主要由酸性脂多糖組成，與病原菌的毒力有關(guān)。薛娟等[5]研究結(jié)果顯示，感染CRKP患者較其他病原菌感染患者病死率顯著增加。因此，對本院分離的CRKP菌株血清莢膜進(jìn)行分型，研究其具體耐藥機(jī)制，有利于對CRKP感染患者進(jìn)行針對性用藥，減少患者病死率。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2016年2月至2018年2月本院各種臨床標(biāo)本(血液、尿液、痰液、腹腔引流液等)，排除同一患者同一部位重復(fù)標(biāo)本，共獲取KP 316例，其中CRKP 126株，男性患者80例(5例患者從不同部位分離到菌株)，女性患者38例(3例患者從不同部位分離到菌株)；痰液中分離菌株82株，血液中分離24株，尿液中分離7株，腹腔引流液中分離13株。質(zhì)控菌包括大腸埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706。本研究所有菌株均采用Vitek2-Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀進(jìn)行鑒定。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 主要包括Vitek-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀及配套藥敏卡、細(xì)菌濁度儀、凝膠成像系統(tǒng)、PCR儀、ABI-PRISM 3730測序儀、DYC-6C電泳儀。PCR反應(yīng)試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.3方法

1.3.1菌株鑒定及藥敏試驗(yàn) 本研究采用Vitek-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀對分離菌株進(jìn)行體外藥物敏感試驗(yàn)，參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)[6]，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)標(biāo)準(zhǔn)[7]判讀替加環(huán)素敏感性，進(jìn)一步確定CRKP和不耐藥的KPN(non-CRKP)。

1.3.2黏液絲試驗(yàn) 將菌種接種于血瓊脂平板，35 ℃培養(yǎng)過夜，以接種環(huán)輕輕挑起菌落后，黏液絲長度≥5 mm為試驗(yàn)陽性，重復(fù)三次以上均陽性者為黏液菌株。

1.3.3碳青霉烯酶表型檢測 (1)改良Hodge試驗(yàn)：將配制好的0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊拇竽c埃希菌ATCC 25922菌液稀釋，將菌液均勻涂布于MH平板，3～5 min后，在培養(yǎng)基中央放置美羅培南紙片，挑選3～5個(gè)待測菌種純菌落垂直于紙片，自紙片外緣向平板邊緣劃線接種，以ATCC BAA-1705為陽性對照，ATCC BAA-1706為陰性對照，35 ℃培養(yǎng)孵育16～18 h。評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：待測菌株與大腸埃希菌ATCC 25922抑菌圈交界處出現(xiàn)向內(nèi)增強(qiáng)生長，抑菌圈不規(guī)則，表明該待測菌種為碳青霉烯酶菌株。(2)碳青霉烯酶抑制試驗(yàn)(CIM)：以ATCC BAA-1705為陽性對照，ATCC BAA-1706為陰性對照，將待測菌種混入1.5 mL無菌雙蒸水內(nèi)，加入亞胺培南紙片(10 μg)，35 ℃培養(yǎng)孵育4 h，將配制好的0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊拇竽c埃希菌ATCC 25922菌液稀釋，將菌液均勻涂布于MH平板培養(yǎng)基，取出孵育好的紙片貼于MH平板，35 ℃培養(yǎng)過夜，觀察結(jié)果。結(jié)果評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：大腸埃希菌ATCC 25922生長不受抑制，為產(chǎn)碳青霉烯酶菌株；大腸埃希菌ATCC 25922生長受抑制，為不產(chǎn)碳青霉烯酶菌株。

1.3.4PCR檢測血清莢膜、耐藥基因及高毒力基因 利用PCR法檢測擴(kuò)增菌株K1、K2、K5、K20、K54、K57等常見莢膜基因型，常見碳青霉烯酶耐藥基因KPC、NDM、VIM、IMP、OXA-48，β-內(nèi)酰胺酶基因TEM、SHV、CTX-M，膜孔蛋白基因Ompk35、Ompk36，AmpC酶基因DHA，常見毒力基因magA、rmpA、rmpA2、aerobactin、wcaG、mrkD、iroN、allS，引物、反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)[8],序列見表1。

續(xù)表1 擴(kuò)增基因的引物序列

注：F代表上游引物；R代表下游引物。

2 結(jié) 果

2.1藥敏檢測結(jié)果 本研究共分離出CRKP 126株，占39.87%。126株CRKP菌株中，對頭孢菌素類、酶抑制劑類、碳青霉烯類、單環(huán)類藥物耐藥率最高，顯著高于non-CRKP菌株(P<0.05)，替加環(huán)素類耐藥率最低，與non-CRKP菌株差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.2碳青霉烯酶表型檢測結(jié)果 改良Hodge試驗(yàn)陽性106株，陽性率33.54%；CIM試驗(yàn)陽性117株，陽性率37.03%。見圖1。

2.3血清莢膜分型及毒力基因 12株CRKP為黏液絲試驗(yàn)陽性，均未檢測到K1、K2、K5、K20、K54、K57血清型。所有CRKP中，檢測出K1血清型10株，均攜帶黏液表型調(diào)控基因rmpA基因，K2、K5、K20、K54、K57血清型均未檢測到，尚未分型116株。126株CRKP均檢測到毒力基因fimH基因，比例最高(100%)，見表3。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果的比較[n(%)]

續(xù)表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果的比較[n(%)]

注：A表示改良Hode試驗(yàn)，B表示CIM試陽。圖A中，1為ATCC1705，2為ATCC1706，3為陽性菌株；圖B中，1為ATCC1706，2為陽性菌株，3為ATCC1705。

圖1碳青霉烯酶表型檢測

表3 毒力基因的分布

2.4耐藥基因及膜孔蛋白檢測結(jié)果 126株CRKP中，檢測出A類碳青霉烯酶KPC基因117株，NDM基因6株，IMP基因3株；β-內(nèi)酰胺酶基因TEM基因53株，SHV基因100株，CTX-M基因112株，膜孔蛋白Ompk35基因缺失50株，Ompk36基因缺失94株，其中，缺失Ompk35膜孔蛋白基因的菌種均同時(shí)缺失Ompk36基因。見表4。

2.5CRKP攜帶耐藥基因情況 CRKP中攜帶4種不同耐藥基因的菌株數(shù)目最多，共64株，攜帶6種及不攜帶耐藥基因的菌株數(shù)目最少，僅有1株。見表5。

表4 耐藥基因及膜孔蛋白檢測結(jié)果

表5 CRKP攜帶耐藥基因情況

3 討 論

KP作為臨床重要的條件致病菌之一，近年來，研究顯示，其對主要的抗菌碳青霉烯類藥物耐藥率不斷上升，CRKP比例不斷上升，部分地區(qū)有暴發(fā)流行趨勢。已有研究表明，CRKP感染患者病死率顯著增加[5]。CRKP引起患者死亡主要與其多重耐藥、毒力表達(dá)有關(guān)[9]。目前研究結(jié)果顯示，CRKP主要耐藥機(jī)制為菌體產(chǎn)生碳青霉烯酶，可水解抗菌藥物[10]。此外，還有研究報(bào)道，其耐藥性可能與AmpC酶合并外膜孔蛋白通透性改變有關(guān)[11]。本研究從本院患者臨床標(biāo)本中分離出CRKP 126株，占39.87%，其中對頭孢菌素類、酶抑制劑類、碳青霉烯類、單環(huán)類藥物耐藥率最高，顯著高于non-CRKP菌株，替加環(huán)素類耐藥率最低，與non-CRKP菌株差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明CRKP對多類抗菌藥物耐藥，本研究結(jié)果提示，臨床可對CRKP使用替加環(huán)素治療。

莢膜作為KP重要的毒力因子，主要由酸性脂多糖組成，其中甘露糖與莢膜毒力有關(guān)，研究顯示，高毒力KP可產(chǎn)生大量莢膜多糖，莢膜呈高黏液表型，是重要的致病因素[12]。本研究通過黏液絲試驗(yàn)表明，分離得到的126株CRKP中，共有12株為高黏液絲菌株。根據(jù)K抗原分型，目前莢膜有80多種血清分型，常見的主要是K1、K2、K5、K20、K54、K57。以往研究表明，K抗原在高黏液性毒力KP上檢出率高達(dá)85%[13]，在本研究檢出的12株高黏液菌株中，均未檢測到K抗原，與馮曉靜等[12]研究結(jié)果不符，推測原因可能為該12株菌株表達(dá)為其他未檢測莢膜分型，或是獲得耐藥性后莢膜基因表達(dá)減弱。126株 CRKP中，檢測出K1血清型10株，均攜帶黏液表型調(diào)控基因rmpA基因，但均未表現(xiàn)出高黏液表型，目前關(guān)于rmpA基因與高黏液表型的關(guān)系仍未得到闡明，具體原因有待進(jìn)一步研究分析。在本研究中，各種毒力基因均有不同程度表達(dá)，毒力基因fimH基因比例最高。陳妍妍等[14]報(bào)道發(fā)現(xiàn)，菌毛黏附在細(xì)菌感染中發(fā)揮重要作用，fimH基因是介導(dǎo)Ⅰ型菌毛的基因，與王歡歡等[15]報(bào)道KP中普遍存在Ⅰ型菌毛一致，提示fimH基因是CRKP中重要的毒力基因。

碳青霉烯酶主要分為A、B、D類，A類酶主要包括KPC、SME、NMC、IMI、GES等基因，B類酶又稱為β-內(nèi)酰胺酶，包括IMP、VIM、NDM、SIM、GIM等基因。KPC作為我國目前流行的A類碳青霉烯酶，可水解大多數(shù)青霉素類、頭孢素類抗菌藥物。本研究采用改良Hodge試驗(yàn)及CIM試驗(yàn)檢測菌株碳青霉烯酶表型，結(jié)果顯示改良Hodge試驗(yàn)陽性106株，CIM試驗(yàn)陽性117株，其中CIM試驗(yàn)檢測結(jié)果與PCR結(jié)果一致，推測可能是由于部分菌株產(chǎn)碳青霉烯酶量較少，致使結(jié)果判斷出現(xiàn)假陰性。PCR結(jié)果表明，檢測出A類碳青霉烯酶KPC基因117株，NDM基因6株，IMP基因3株；β-內(nèi)酰胺酶基因TEM基因53株，SHV基因100株，CTX-M基因112株，膜孔蛋白Ompk35基因缺失50株，Ompk36基因缺失94株，其中，缺失Ompk35膜孔蛋白基因的菌種均同時(shí)缺失Ompk36基因，提示本院分離到的126株CRKP中，主要耐藥機(jī)制為產(chǎn)碳青霉烯酶，同時(shí)合并有部分菌株膜孔蛋白通透性改變。本研究統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，分離獲得的126株CRKP中，以攜帶4種不同耐藥基因的菌株數(shù)目最多，提示在臨床工作中要采用不同方法對菌株的耐藥機(jī)制進(jìn)行檢測，選擇合適藥物進(jìn)行治療。

4 結(jié) 論

本研究分離獲得的CRKP主要耐藥機(jī)制為產(chǎn)碳青霉烯酶，部分菌株合并有膜孔蛋白基因缺失，但關(guān)于CRKP莢膜血清分型尚不清楚，將進(jìn)一步進(jìn)行探究。