核酸實驗室混樣篩查檢測過程的拆分陽性率分析*

張 麗，孫國棟

(邯鄲市中心血站,河北邯鄲 056001)

血站實驗室的血液篩查工作是保證臨床輸血安全有效的重要屏障。雖然現(xiàn)階段在酶聯(lián)免疫法檢測乙肝表面抗原(HBsAg)、HCV抗體(抗-HCV)、HIV抗體(抗-HIV)性能上有很大程度提高，但對于病毒窗口期、靜默感染等[1]卻是無法檢出，而核酸檢測技術具有高度敏感性和特異性，有利于隱匿性感染的檢出,有利于縮短病毒檢測窗口期。核酸檢測抗干擾能力弱，對設備及環(huán)境、人員等要求高，核酸檢測實驗室的質量管理就顯得尤為重要[2]。本中心血站自2018年起參與了京津冀血液篩查實驗室的質量指標監(jiān)控，為提高本站血液篩查能力提供了優(yōu)質的學習資源和平臺。筆者以此為契機通過對拆分陽性率的數(shù)據(jù)進行比對與回顧性分析，從這一角度客觀評價檢測過程的運行狀況，目的在于發(fā)現(xiàn)問題所在，以便在工作中尋找相應解決方案。

1 材料與方法

1.1標本來源 選取2016年1月至2018年12月河北邯鄲地區(qū)18～55歲的無償獻血者標本共274 309份。采集獻血者靜脈血標本共2管，使用乙二胺四乙酸(EDTA)-K2抗凝的負壓真空管留取標本,其中1管為8 mL(有分離膠)用于核酸檢測，另外1管5 mL(無分離膠)用于血清學檢測。核酸管采血后，需要在4 h內(nèi)離心,置于2～8 ℃冰箱保存,各檢測需在72 h內(nèi)完成。

1.2儀器與試劑 核酸檢測試劑為華益美核酸檢測試劑盒；酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)使用的試劑為上?？迫A、北京萬泰、珠海麗珠、廈門新創(chuàng)公司的產(chǎn)品。以上試劑均批檢合格,不同批號試劑均在有效期內(nèi)使用。儀器包括FAME2430全自動酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)、ABI7500擴增儀、尤瑞納斯AE280全自動酶免一體機、Hamiltom Star全自動加樣儀和全自動核酸提取儀。各實驗操作均嚴格按照《血站技術操作規(guī)程》和試劑盒說明書要求進行。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對此研究分時間、分試劑批號的陽性檢出率、拆分陽性率進行統(tǒng)計，各組陽性率的比較用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1核酸檢測情況 共檢測核酸標本274 309份,一部分為其中一種試劑檢測反應性判為待查的標本；另一部分為經(jīng)過ELISA檢測后2個試劑廠家均為陰性的標本。其中混樣反應率0.12%(335/274 309)，拆分陽性數(shù)152例,拆分陽性率為45.97%。2016至2018年拆分陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.16，P<0.05)。見表1。

2.22018年1-12月拆分情況匯總 由表2可見，2018年全年混檢陽性pool數(shù)為135，拆分陽性pool數(shù)為70，拆分陽性率為51.85%(70/135)。1-12月拆分陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 2016～2018年核酸檢測情況匯總

表2 2018年1-12月拆分情況匯總

注：1-12月拆分陽性率比較,χ2=63.61，P<0.05,差異有統(tǒng)計學意義。

3 討 論

《血站實驗室質量管理規(guī)范》規(guī)定，血站實驗室必須建立和持續(xù)改進實驗室質量體系，并負責組織實施和嚴格監(jiān)控[4]。通過對核酸檢測拆分陽性率的統(tǒng)計，可以有效評估整個核酸檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性，以及所使用的核酸試劑的性能。

2016年1月至2018年12月本站共檢測核酸標本274 309份,其中混檢反應率為0.12%,與北京0.14%[5]、寶雞0.15%[6]等地相比略低。拆分陽性152例,拆分陽性率為45.97%,低于臨近的唐山地區(qū)79.45%[7]、安陽地區(qū)75.00%[8]；徐州地區(qū)63.3%[9],渭南地區(qū)的61.11%[10]。陽性檢出率為0.55‰,與大連0.50‰[11]相似,低于國內(nèi)一些城市[12-14]。原因可能與以下因素相關：(1)使用單人份HBV DNA試劑靈敏度高于混樣核酸檢測;(2)由于核酸檢測系統(tǒng)的反應原理不同,系統(tǒng)設計不同,操作流程各有差異,導致病毒檢出率有所不同；(3)人群分布的地域差異導致病毒檢出率的差異； 2015年底本站開展核酸檢測以來，標本數(shù)量逐年上升，拆分陽性率也相應提高，2016年與2017年基本持平，2018年則提高較多原因可能有以下三點：(1)在開展核酸檢測初期，操作人員對設備的使用缺乏經(jīng)驗，導致檢測結果出現(xiàn)一定波動；(2)本單位所使用的試劑在抗污染方面有待提高；(3)2018年本單位參加京津冀血液篩查實驗室質量分析，按照要求又對實驗環(huán)節(jié)進行進一步的嚴格把控，不斷提高實驗的有效拆分。而前兩點在2018年也有了較大改善，故2018年的拆分陽性率同比增長約15%。本核酸實驗室拆分陽性率也高于在2018年京津冀血液篩查實驗室質量指標數(shù)據(jù)匯總分析中的拆分陽性率均線48.94%。

在2018年拆分的70例陽性中有1例標本,第1次拆分檢測陰性,但有線下起跳的現(xiàn)象,根據(jù)本站核酸檢測操作規(guī)程,結合擴增曲線特征,為此進行第2次拆分結果為陽性,且循環(huán)閾值(Ct)值范圍為>39～43。這與趙欣等[15]的報道相似。而在之前本核酸實驗室統(tǒng)計過Ct值在此范圍里的標本拆分陽性率有42.86%,這提示在未被拆分出的標本中可能存在以下原因：(1)標本混檢陽性為假陽性結果，雖然核酸檢測靈敏度較高，但檢測中存在一定的不確定度，對人員操作，環(huán)境控制，抗污染能力要求較高[16]，容易造成非特異性擴增。(2)如果病毒的濃度處于試劑盒檢測限以下或極低水平,由于病毒顆粒在血漿中泊松分布,吸樣時未必能每次都吸取到含有一定量病毒的樣本,從而影響檢出,造成假陰性；(3)不合適的保存溫度、不規(guī)范的運送條件、其他干擾物的存在都可能導致病毒降解造成假陰性的產(chǎn)生。

美國臨床實驗室標準委員會CLSI-GP35D關于監(jiān)控指標的文件里[17]，明確了混檢陽性率是混檢陽性標本個數(shù)與檢測標本個數(shù)之比，若混檢陽性率出現(xiàn)升高，應觀察拆分陽性率，若拆分陽性率呈現(xiàn)下降，提示該實驗室在檢測過程中存在污染的風險有所增加。此時應該排查可能導致污染的步驟，并對可能導致污染的因素進行評估[18]。本實驗室每月月初對上一月核酸檢測情況進行回顧性總結與分析，當分析發(fā)現(xiàn)拆分陽性率下降的情況出現(xiàn)時，首先會對操作環(huán)節(jié)進行加強培訓，例如操作人員的再培訓，室內(nèi)溫濕度控制，操作時防污染控制，調整試驗完畢后的消毒措施；其次分析檢測系統(tǒng)本身的原因，例如在人員、環(huán)境、操作步驟都相對固定的情況下，若某批次試劑在使用過程中出現(xiàn)拆分陽性率雖然在平均水平，但檢出率卻明顯超出平均水平的情況，需將此批號所檢出的陽性標本均留樣并送衛(wèi)健委臨檢中心實驗室進行確證，待結果回報后再進行分析總結。

綜上所述，現(xiàn)行的監(jiān)控指標可以有效地監(jiān)控并保障每批次試驗正常運行。血站血篩實驗室的運行狀況直接關系到血液安全，應通過從“人、機、料、法、環(huán)”等方面查找漏洞，及時發(fā)現(xiàn)影響質量的不穩(wěn)定因素并采取措施，使血站血篩實驗室質量監(jiān)控不斷完善。