非小細胞肺癌患者惡性胸腔積液及外周血T790M 突變檢測的應(yīng)用價值

黃芳芳 趙振中 陳 佳 汪鐵軍

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占80%～85%[2-3]。多數(shù)患者在確診時已無手術(shù)機會，放化療及分子靶向治療成為其主要的治療方法?；驒z測是靶向治療的前提，然而由于患者意愿或不能手術(shù)等種種原因，腫瘤活檢或手術(shù)切除的組織標(biāo)本獲取較為困難，多次取材活檢更是難以實現(xiàn)。因此，臨床研究者一直試圖尋找其他標(biāo)本來替代腫瘤組織標(biāo)本。目前研究較多的是外周血及胸腔積液，取材方便，且相對無創(chuàng)。本研究通過收集40 例NSCLC 患者的惡性胸腔積液及外周血標(biāo)本，進行T790M 基因檢測，并與組織標(biāo)本的T790M 突變情況進行比較，探討惡性胸腔積液、外周血標(biāo)本作為組織標(biāo)本的備選替代標(biāo)本用于T790M 基因檢測的可行性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取2017 年5 月—2019 年6 月杭州市余杭區(qū)第二人民醫(yī)院NSCLC 患者的惡性胸腔積液及外周血標(biāo)本各40 例，所有患者經(jīng)組織病理學(xué)確診為NSCLC 且伴有惡性胸水。本研究經(jīng)杭州市余杭區(qū)第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)（1）組織病理學(xué)確診為NSCLC；（2）可進行組織學(xué)基因檢測或者已經(jīng)有組織學(xué)基因檢測結(jié)果；（3）B 超證實有胸腔積液且能進行穿刺取樣，病理細胞學(xué)證實胸水中有腫瘤細胞。

1.3 標(biāo)本收集及檢測 取活檢或手術(shù)標(biāo)本進行石蠟包埋，經(jīng)兩位病理醫(yī)師質(zhì)控確定為NSCLC，且癌組織≥30%。切取5～10 片約5～6μm 厚的切片放入Ependorf 管中，加入二甲苯脫蠟后用乙醇清洗，晾干。再加入20μL 蛋白酶K 及200μL 裂解液Buffer DTL，震蕩混勻后消化1h，靜置離心，用廈門艾德公司的核酸提取試劑盒收集提取DNA。同時采集患者外周血50mL，存于抗凝管中，及胸腔積液250～500mL，均2～8℃條件下保存，24h 內(nèi)3000rpm 離心10min，沉淀涂片并進行病理質(zhì)控，單個視野下腫瘤細胞數(shù)＞10 個視為病理質(zhì)控合格；合格者采用離心法分離沉淀中的腫瘤細胞與血細胞；胸水沉淀細胞采用胸水樣本DNA 分離試劑盒及RNA 分離試劑盒提取胸水中的核酸。所有收集提取的DNA 均使用艾德公司的人類EGFR 基因21 種突變檢測試劑盒（熒光PCR 法）進行T790M 檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計分析，用卡方檢驗分別比較胸腔積液、外周血標(biāo)本與組織標(biāo)本中T790M 基因突變的差異，及胸腔積液與外周血標(biāo)本T790M 突變的差異。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。用Kappa 系數(shù)進行一致性檢驗，Kappa>0.75為一致性極好，0.4≤Kappa≤0.75 為一致性良好，Kappa<0.4 為一致性差。

2 結(jié)果

本組共40 例，男28 例，女12 例，女性突變率75.0%（9/12）顯著高于男性35.7%（10/28）。年齡＜60歲患者19 例，＞60 歲患者21 例，年齡組突變率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。組織病理學(xué)類型：腺癌患者16 例，T790M 突變12 例，鱗癌患者24 例，T790M 突變7 例，突變率29.2%，顯著低于腺癌的75.0%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。未使用酪氨酸激酶抑制劑（TKI）藥物17 例，有2 例T790M 突變陽性，TKI 耐藥后標(biāo)本23 例，17 例陽性，突變率達73.9%，遠高于用藥前患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

40 份組織標(biāo)本中，檢出T790M 突變共19 例，突變率47.5%。對應(yīng)惡性胸腔積液標(biāo)本，檢出T790M 突變共15 例，突變率37.5%，兩者Kappa 值0.797，提示一致性極好，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。外周血檢出T790M 突變例數(shù)共11 例，突變率27.5%，與組織標(biāo)本Kappa 值0.591，提示一致性較好，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。外周血與惡性胸腔積液相比，Kappa 值0.662，一致性較好，提示無明顯差異。所有標(biāo)本中，未出現(xiàn)組織標(biāo)本陰性，惡性胸腔積液或外周血標(biāo)本陽性情況。組織標(biāo)本T790M 陽性患者19 例，有17 例使用奧西替尼口服靶向治療，用藥1 個月后復(fù)查胸部CT，其中可測量病灶縮小25%以上患者1例（5.9%），病灶略縮小25%以下患者7 例（41.2%），病灶穩(wěn)定無明顯變化患者5 例（29.4%），剩余4 例患者病灶增大（23.5%）。

表1 T790M 基因突變與性別、年齡、病理類型相關(guān)性

3 討論

分子靶向藥物因其特異性高，副作用小，在延長患者生存時間和提高生活質(zhì)量方面發(fā)揮了越來越重要的作用。其中，又以表皮生長因子（EGFR）-TKI 療效最為顯著[4-5]。EGFR-TKI 能明顯延長晚期EGFR突變陽性的NSCLC 患者的無進展生存期（PFS），因此被推薦為該類患者的一線治療方案[6]。然而，治療過程中，耐藥幾乎不可避免。即使對初始EGFR-TKI治療應(yīng)答良好，然而幾乎所有服用EGFR-TKI 的患者在平均治療10 個月后都會對此類藥物出現(xiàn)耐藥[7]。國內(nèi)外研究表明，50%的耐藥患者存在EGFR 基因20 號外顯子第790 位點的突變，即T790M 基因突變，并且與EGFR-TKI 療效密切相關(guān)[8]。目前已有第三代EGFR-TKI 例如奧西替尼針對T790M 突變患者的治療，療效顯著[9]。因此在治療期間連續(xù)動態(tài)監(jiān)測分析T790M 突變狀態(tài)及患者的臨床特征，可為臨床提供更多有用的信息，從而指導(dǎo)治療方案的制定?；铙w組織標(biāo)本的獲取主要依靠腫瘤活檢或手術(shù)切除組織，受患者主觀意愿、客觀條件及病灶位置等影響較大，反復(fù)多次取材存在很大難度，且創(chuàng)傷較大。IPASS 研究納入的1038 例患者中只有681 例能夠提供標(biāo)本，最后僅437 例患者能夠評價EGFR 基因突變狀態(tài)[10]。國內(nèi)的一項多中心調(diào)查表明，2009 年中國患者EGFR 突變檢測的比例僅有9.6%，而2012年有所上升也只有20%，這提示大多數(shù)患者無法獲取足夠的標(biāo)本用于基因檢測[11]。相對來說，外周血及惡性胸腔積液作為組織標(biāo)本替代品應(yīng)用于臨床耐藥基因T790M 檢測，存在顯著優(yōu)勢：一是較容易獲取，可多次采樣，從而形成一個動態(tài)監(jiān)測過程；二是外周血及胸腔積液多為治療需要時獲取，即僅在患者出現(xiàn)臨床相關(guān)癥狀需要治療時獲取，相對創(chuàng)傷較小，因而患者接受度較高；第三，相對于組織學(xué)固態(tài)標(biāo)本取樣的局限性，外周血及胸腔積液液態(tài)標(biāo)本的靈動性，所含有的腫瘤信息或許更加豐富。

本組40 例患者年齡介于32～81 歲之間，均有組織學(xué)T790M 基因檢測結(jié)果，其中女性突變率明顯高于男性，可能與女性中非吸煙腺癌患者較男性中非吸煙腺癌占比高有關(guān)。腺癌患者T790M 突變率明顯高于鱗癌患者，TKI 治療耐藥后的T790M 突變率亦明顯高于治療前患者，提示TKI 治療可能是引起T790M 突變發(fā)生的主要原因。組織標(biāo)本中，檢出T790M 突變共19 例，突變率47.5%。對應(yīng)惡性胸腔積液T790M 突變的檢出率比較，兩者Kappa 值0.797，一致性極好。對應(yīng)外周血T790M 突變檢出率27.5%，兩者比較Kappa 值0.591，一致性較好，兩者均有統(tǒng)計學(xué)意義，因此，可以認為惡性胸腔積液及外周血作為組織標(biāo)本的替代標(biāo)本進行T790M 檢測，具有一定的可行性。另外，惡性胸腔積液的突變檢出率相對外周血較高，前者與組織學(xué)標(biāo)本比較所得Kappa 值明顯高于后者，考慮惡性胸腔積液可能更占優(yōu)勢，這可能與惡性胸腔積液中病理質(zhì)控及多態(tài)性有關(guān)。但因標(biāo)本數(shù)量的限制，結(jié)果存在一定的局限性，期待進一步的大樣本探討研究。

綜上所述，臨床工作中，若遇到組織標(biāo)本不能獲取的情況，不妨嘗試考慮使用惡性胸腔積液替代進行T790M 檢測，若兩者皆不易獲取，使用患者外周血標(biāo)本進行T790M 檢測也是一個選擇。