七氟醚預(yù)處理對(duì)膿毒癥模型小鼠NALP3 炎性體的影響

章小林 陶 凡 汪國香 羅 宏

膿毒癥是機(jī)體在受到嚴(yán)重創(chuàng)傷、手術(shù)或者感染時(shí)，多種炎癥介質(zhì)大量釋放而導(dǎo)致的一種全身炎癥反應(yīng)綜合征，也是導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征（MODS）、感染性休克（septic shock）的重要原因之一，具有較高的死亡率[1-2]。與其他感染性疾病不同，膿毒癥尚無特異性治療方法，有效治療膿毒癥是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)亟待解決的問題[3]。隨著近年來對(duì)膿毒癥發(fā)病機(jī)制研究的深入，如何調(diào)控機(jī)體免疫功能，維持促炎和抗炎平衡已經(jīng)成為治療膿毒癥的新靶點(diǎn)。炎性體（inflammasome）是一種多蛋白復(fù)合體，作為固有免疫的一部分，可識(shí)別和感受病原微生物及內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)，刺激活化胱天蛋白酶（cysteinylaspartatespecific protease，caspase），誘導(dǎo)白介素-1β（interleu-kin，IL-1β）、白介素-18（IL-18）、白介素-33（IL-33）等促炎性反應(yīng)細(xì)胞因子分泌及多種炎性反應(yīng)遞質(zhì)釋放[4]。有研究認(rèn)為，七氟醚作為一種新型的吸入麻醉藥物，除了誘導(dǎo)迅速、蘇醒快、血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定、器官毒性小等優(yōu)勢(shì)外，還能夠在一定程度上減少器官損傷，并具有調(diào)節(jié)炎癥免疫的作用，但目前對(duì)于具體機(jī)制的研究較少[5-6]。因此，本研究建立膿毒癥小鼠模型，使用七氟醚進(jìn)行預(yù)處理，通過七氟醚對(duì)膿毒癥小鼠生存率和炎性體的影響，探究抗炎作用的通道，為膿毒癥的預(yù)防以及治療提供新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物及分組 SPF 級(jí)C57BL/6N 健康雄性小鼠84 只，購于上海西普爾—必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK（滬）2015-0016。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境：置于溫度（22±1）°C，濕度（60%±10%），光照（12h 照明，12h 黑暗交替）環(huán)境下飼養(yǎng)1 周，自由飲水、普通顆粒飼料喂養(yǎng)。

1.2 藥品 吸入用七氟醚（sevoflurane）（丸石制藥株式會(huì)社，批號(hào)5X011，規(guī)格：250mL）；三氯乙醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)30037516，規(guī)格：100mL）。

1.3 試劑和儀器 RNA 提取試劑盒（Qiagen 公司，德國，批號(hào)74106）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo 公司，美國，批號(hào)EY2467）；PCR 試劑盒（天根生化公司，中國，批號(hào)28104）；瓊脂糖（Biowest 公司，西班牙）。梯度PCR 儀（abi 9700 美國），Bio-rad 微量核酸電泳系（Bio-RAD 公司），核酸凝膠成像系統(tǒng)（Biostep 德國），光學(xué)顯微鏡（Olympus 日本），石蠟切片機(jī)（RM2135 型德國），低溫高速離心機(jī)（Beckman 德國），F(xiàn)abius 麻醉機(jī)、氣體監(jiān)測儀（Drager 公司，德國），小鼠模擬七氟醚吸入箱等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法分為氧氣對(duì)照組、七氟醚對(duì)照組、氧氣膿毒癥組和七氟醚膿毒癥組，每組21 只。

2.2 小鼠膿毒癥模型（CLP）建立 參照文獻(xiàn)[7]，采用盲腸結(jié)扎穿刺法制備小鼠膿毒癥模型。腹腔注射2%水合氯醛15mL/kg 麻醉下，于腹部備皮消毒后，沿腹中線切開皮膚、腹壁約1cm，以無菌鑷探查到盲腸后，用手術(shù)縫線在回盲瓣下方盲腸近段1/4 處結(jié)扎，用20G 無菌針頭分別于結(jié)扎盲腸頭尾端穿孔，擠出內(nèi)容物0.3mL，將盲腸和擠出物一起還納腹腔，并逐層縫合切口，術(shù)后切口碘伏消毒以防切口感染。對(duì)照組小鼠在無菌狀態(tài)下開腹找出盲腸后再將其還納腹腔，不進(jìn)行盲腸結(jié)扎和穿刺，然后逐層關(guān)腹。各組術(shù)畢皮下注射0.9%氯化鈉溶液1mL 抗休克。

2.3 七氟醚氣體吸入 手術(shù)前，在22cm×12cm×15cm 自制吸入麻醉箱底鋪墊2cm 厚鈉石灰，箱體兩側(cè)分別接Fabius 麻醉機(jī)進(jìn)氣、出氣管和氣體監(jiān)測儀，氧流量3L/min，調(diào)節(jié)揮發(fā)罐誘導(dǎo)麻醉，使麻醉箱內(nèi)七氟醚濃度達(dá)到5.0%，隨后放入小鼠，約2min 后小鼠翻正反射消失，調(diào)節(jié)七氟醚濃度3.0%。采用美國Kent 小動(dòng)物監(jiān)測儀，監(jiān)測SPO2，40min 后關(guān)閉揮發(fā)罐。對(duì)照組僅吸入純氧，氧流量3L/min。

2.4 標(biāo)本采集和檢測

2.4.1 小鼠生存率觀察 模型制作后每組隨機(jī)選取9 只小鼠觀察生存情況，計(jì)算生存率。

2.4.2 組織學(xué)檢查與臟器組織炎癥評(píng)分 手術(shù)后24h，各組隨機(jī)選取3 只小鼠斷頭處死，獲取肺、肝、腎組織，置于10%中性福爾馬林緩沖液，在4℃下固定24h，石蠟包埋，切片厚度5μm。將病理切片分別進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）（北京索萊寶科技有限公司）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察HE 染色觀察各臟器是否有炎癥反應(yīng)，按照SIRS 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[8]進(jìn)行炎癥評(píng)分：無損傷為0 分，損傷0～25%為1 分，25%～50%為2 分，50%～75%為3 分，75%～100%為4 分，得分越高，炎癥越嚴(yán)重。

2.4.3 RT-PCR 方法檢測血液、腹腔灌洗液、肺灌洗液NALP3、Caspase-1 及ASC mRNA 表達(dá) 剩余小鼠均24h 后水合氯醛麻醉，摘眼球取血，并對(duì)各組小鼠進(jìn)行腹腔灌洗及肺灌洗。灌洗液2000r/min 離心后去上清（血標(biāo)本經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離后取單核細(xì)胞層），37℃溫箱1640 細(xì)胞培養(yǎng)液下培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，收集細(xì)胞。取部分收集到的細(xì)胞按照Trizol RNA、提取試劑盒說明書提取總RNA，采用紫外吸收法測定其在A260nm/A280nm 的比值，在1.8～2.0 之間認(rèn)為RNA 純度合格。使用TAKARA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA（濃度為50ng/μL）。加樣后置入定量PCR 儀進(jìn)行反應(yīng)擴(kuò)增。

采用Primer Premier 5.0 及Oligo 6 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)提供引物合成技術(shù)。NALP3 上游引物：5'-ATTACCCGCCCGAGAAAGG-3'，下游引物：5'-TCGCAGCAAAGATCCACACAG-3'；Caspase1 上游引物：5'-GGAAGCAATTTATCAACTCAGTG-3'，下游引物：5'-GCCTTGTCCATAGCAGTAATG-3'；ASC 上游引物：5'-GCAACTGCGAGAAGGCTAT-3'；下游引物：5'-CTGGTCCACAAAGTGTCCTG-3'；β-actin 上游引物：5'-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3'，下游引物：5'-ATGGAGCCACCGATCCACA-3'。

PCR 反應(yīng)條件：95°C 預(yù)變性10min，95°C 變性30s，60°C 30s，72°C 延伸1min，共40 個(gè)循環(huán)。所有目的基因的閾值是與內(nèi)參比較，通過計(jì)算2-ΔΔCt 表示基因相對(duì)表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各項(xiàng)監(jiān)測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)分析結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間數(shù)據(jù)分析采用t 檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析（ANOVA），后續(xù)分析采用LSD 檢驗(yàn)，以P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 小鼠生存率觀察 7 天后，七氟醚對(duì)照組與氧氣對(duì)照組小鼠無死亡，生存率100%，而七氟醚膿毒癥組中死亡3 只，生存率66.67%（6/9）；氧氣膿毒癥組中死亡4 只，生存率55.56%（5/9）；七氟醚膿毒癥組與氧氣膿毒癥組小鼠生存率明顯低于七氟醚對(duì)照組和氧氣對(duì)照組（P＜0.05），但七氟醚膿毒癥組與氧氣膿毒癥組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3.2 各組小鼠臟器組織炎癥評(píng)分 與對(duì)照組比較，膿毒癥組小鼠肺、肝、腎組織炎癥評(píng)分明顯升高；七氟醚膿毒癥組炎癥評(píng)分明顯低于氧氣膿毒癥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠肺、肝、腎組織炎癥評(píng)分比較（分，）

表1 各組小鼠肺、肝、腎組織炎癥評(píng)分比較（分，）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與氧氣膿毒癥組比較，bP＜0.05

3.3 各組小鼠血NALP3、Caspase-1 以及ASC mRNA 表達(dá) RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，膿毒癥組小鼠血NALP3、ASC、Caspase-1 表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P均＜0.05）；與氧氣膿毒癥組比較，七氟醚膿毒癥組小鼠血NALP3、ASC、Caspase-1 表達(dá)顯著下調(diào)（P 均＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠血NALP3、Caspase-1 及ASC mRNA 表達(dá)量比較（）

表2 各組小鼠血NALP3、Caspase-1 及ASC mRNA 表達(dá)量比較（）

注：NALP3 為核苷酸結(jié)合低聚體結(jié)構(gòu)域樣受體3；Caspase-1 為半胱天冬酶-1；ASC 為凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與氧氣膿毒癥組比較，bP＜0.05

3.4 各組小鼠腹腔灌洗液NALP3、Caspase-1 及ASC mRNA 表達(dá)量比較 RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，膿毒癥組小鼠腹腔灌洗液NALP3、ASC、Caspase-1表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P 均＜0.05）；與氧氣膿毒癥組比較，七氟醚膿毒癥組NALP3、ASC、Caspase-1 表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.05）。見表3。

3.5 各組小鼠肺灌洗液NALP3、Caspase-1 及ASC mRNA 表達(dá)量比較 RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，膿毒癥組小鼠肺灌洗液NALP3、ASC、Caspase-1 表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P 均＜0.05）；與氧氣膿毒癥組比較，七氟醚膿毒癥組NALP3、ASC、Caspase-1 表達(dá)顯著下調(diào)（P 均＜0.05）。見表4。

表3 各組小鼠腹腔灌洗液NALP3、Caspase-1 及ASC mRNA表達(dá)量比較（）

表3 各組小鼠腹腔灌洗液NALP3、Caspase-1 及ASC mRNA表達(dá)量比較（）

注：NALP3 為核苷酸結(jié)合低聚體結(jié)構(gòu)域樣受體3；Caspase-1 為半胱天冬酶-1；ASC 為凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與氧氣膿毒癥組比較，bP＜0.05

表4 各組小鼠肺灌洗液中NALP3、Caspase-1 及ASC mRNA 表達(dá)量比較（）

表4 各組小鼠肺灌洗液中NALP3、Caspase-1 及ASC mRNA 表達(dá)量比較（）

注：NALP3 為核苷酸結(jié)合低聚體結(jié)構(gòu)域樣受體3；Caspase-1 為半胱天冬酶-1；ASC 為凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與氧氣膿毒癥組比較，bP＜0.05

4 討論

目前認(rèn)為，過度的炎癥反應(yīng)是膿毒癥發(fā)病的關(guān)鍵因素[9]。適度的炎癥反應(yīng)有利于宿主消除入侵的病原體并促進(jìn)組織修復(fù)。然而，如果炎癥級(jí)聯(lián)不受控制，導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的過量產(chǎn)生和抗炎細(xì)胞因子與促炎細(xì)胞因子之間的失衡，則會(huì)發(fā)生全身性炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）或敗血癥[10]。有研究表明，在膿毒癥發(fā)病過程中，存在炎性體（尤其是NALP3 炎性體）的異?；罨殡S其底物IL-1β、IL-18 的顯著升高[11-12]。NALP3 是一種炎性體NOD 樣受體，能夠?qū)C(jī)體中微生物以及細(xì)胞內(nèi)自身代謝性應(yīng)激進(jìn)行識(shí)別和感受，介導(dǎo)炎癥因子的分泌和炎性介質(zhì)的釋放[13]。其在受到外源或內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)刺激后，通過招募ASC 和pro-caspase-1，促進(jìn)caspase-1 活化，從而使大量pro-IL-1β 轉(zhuǎn)化為成熟IL-1β 并進(jìn)行分泌。IL-1β 因子通過激活I(lǐng)L-1 受體使趨化因子和其他炎癥調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用。在炎性發(fā)生時(shí)，機(jī)體中的NALP3 水平會(huì)急劇上升，然后逐漸降低，調(diào)節(jié)炎癥因子的分泌和釋放，對(duì)機(jī)體獲得性免疫反應(yīng)具有重要的調(diào)控作用[14]。大量研究也表明，NALP3 的寡聚體化不僅可以促進(jìn)pro-IL-1β 轉(zhuǎn)化為成熟IL-1β，還可以使caspase-1 水解產(chǎn)生解pro-IL-18 和pro-IL-33，促進(jìn)活性IL-18 和IL-33 的產(chǎn)生，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[15]。

七氟醚是最常用的揮發(fā)性麻醉劑，近年來七氟醚抗炎效應(yīng)、緩解應(yīng)激及缺血/再灌注損傷等免疫效應(yīng)的研究日益得到重視[16-17]。七氟醚預(yù)處理是在臟器缺血-再灌注前分次間斷或連續(xù)吸入一定濃度的七氟醚，激活缺血心腦等器官的防御機(jī)制，發(fā)揮保護(hù)作用。Herrmann 等[5]研究表明，七氟醚預(yù)處理通過抑制炎癥反應(yīng)，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及氧化應(yīng)激等緩解膿毒血癥。Zhou 等[18]發(fā)現(xiàn)，七氟醚預(yù)處理可以通過Toll 樣受體（TLR3）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，上調(diào)抗炎因子和下調(diào)促炎因子的表達(dá)，減輕體外循環(huán)對(duì)腦組織的損傷。本研究結(jié)果顯示，七氟醚膿毒癥組與氧氣膿毒癥組小鼠的生存率明顯低于七氟醚對(duì)照組與氧氣對(duì)照組（P<0.05）；氧氣膿毒癥組和七氟醚膿毒癥組小鼠的肺、肝、腎組織炎癥評(píng)分明顯高于氧氣對(duì)照組和七氟醚對(duì)照組，但七氟醚膿毒癥組明顯低于氧氣膿毒癥組（P<0.05），七氟醚預(yù)處理可以有效的改善膿毒癥患小鼠的炎癥水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與氧氣對(duì)照組和七氟醚對(duì)照組比較，氧氣膿毒癥組和七氟醚膿毒癥組小鼠的NALP3、ASC、Caspase-1 表達(dá)明顯升高，且七氟醚膿毒癥組明顯低于氧氣膿毒癥組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Lai 等[19]研究結(jié)果相符。

綜上所述，七氟醚預(yù)處理能有效降低膿毒癥小鼠炎癥水平，這一過程可能通過調(diào)節(jié)NALP3 炎性體的活性實(shí)現(xiàn)。NALP3 炎性體與膿毒癥的發(fā)生與發(fā)展具有密切關(guān)系。