莽吉柿提取物對宮頸癌Hela 細胞凋亡的影響

李凱強 郝 珂 陳以栗 陳秉宇 蔣珊珊 張 威 柴可群

宮頸癌是女性癌癥發(fā)病率第二的癌癥類型，能否及早發(fā)現(xiàn)病情和及時治療會影響生存[1]。傳統(tǒng)的化療和放療治療方式，會對正常細胞造成損傷，而藥物的低靶向性也會降低治療的效果。有數(shù)據(jù)顯示，有超過60%的癌癥患者使用天然植物提取物進行治療[2]。莽吉柿（Garcinia mangostana L.），又名山竹，藤黃科藤黃屬植物，為著名的熱帶水果，其外根莖具有較好的醫(yī)用價值，常用于治療肺癌和結腸癌[3]。我們采用柱層析法分離得莽吉柿提取物，其主要成分是氧雜蒽酮類化合物。研究發(fā)現(xiàn)其對宮頸癌細胞增殖具有顯著的抑制作用，并針對其對細胞凋亡的作用機制做了探索性研究。

1 材料與方法

1.1 材料 莽吉柿（Garcinia mangostana L.）提取物由浙江工業(yè)大學藥學院提供。

1.2 試劑 CCK-8 試劑盒（Cell Counting Kit-8，批號010417170406）、活性氧檢（Cell reactive oxygen，ROS）測試劑盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit，ROS Assay kit，批號070919181105）、RIPA 裂解液（RIPA Lysis Buffer，批號081619190911）、PMSF（批號120518190212）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（BCA Protein Assay Kit，批號010719190418）購于上海碧云天生物技術公司；Annexin V/PI 檢測試劑盒（批號A82380615）購于杭州聯(lián)科生物技術有限公司；B 淋巴細胞瘤-2 蛋白（B-cell lymphoma-2，Bcl-2，批號HJ1017）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2 Associated X Protein，BAX，批號HJ1017）、細胞外調節(jié)蛋白激酶（Phospho-Extracellular regulated protein kinases1/2，p-ERK1/2，批 號HJ1017）、Extracellular regulated protein kinases1/2（ERK1/2，批號HJ1121）、β-actin（批號HK0303）和羊抗兔-IgG（批號G181122）購于杭州華安生物技術有限公司；增強型化學發(fā)光試劑（ECL，批號20180720）購于杭州弗德生物；胎牛血清（Biological Industries，BI，批號1752054）購于杭州冠楠生物科技有限公司、高糖DMEM 培養(yǎng)基（批號AE29166346）購于美國Hyclone 公司產品。

1.3 細胞培養(yǎng) 人宮頸癌Hela 細胞購于上海中科院細胞庫，由浙江省人民醫(yī)院臨床實驗室提供。細胞培養(yǎng)于高糖DMEM 培養(yǎng)基中（含有10%胎牛血清、100U/mL 1%青霉素、100μg/mL 1%鏈霉素），在37℃、飽和濕度、含有5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 細胞活力檢測 將Hela 細胞按5×103/孔接種于96 孔板上，對照組為Hela 細胞不加藥培養(yǎng)24h，莽吉柿提取物組為加入無血清高糖DMEM 培養(yǎng)基配制的0.75、1.25、2.5、5μg/mL 的莽吉柿提取物，每孔100μL，培養(yǎng)24h，每孔加20μL CCK-8，避光孵育4h，用酶標儀在450nm 波長下檢測其吸光值，計算細胞抑制率（%）[抑制率=（OD 對照組-OD 實驗組）/OD 對照組×100%]。

1.5 細胞凋亡實驗 將Hela 細胞按2×105/孔接種于12 孔板上，對照組為Hela 細胞不加藥培養(yǎng)24h，莽吉柿提取物組為加入無血清高糖DMEM 培養(yǎng)基配制的2.5μg/mL、5μg/mL 的莽吉柿提取物，培養(yǎng)24h后各自收集每孔內細胞，用PBS 洗滌2 次，每管加入5μl Annexin V-FITC 和10μL PI，輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育5min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.6 細胞活性氧檢測實驗 將Hela 細胞按2×105/孔接種于12 孔板上，對照組為Hela 細胞不加藥培養(yǎng)24h，莽吉柿提取物組為加入無血清高糖DMEM 培養(yǎng)基配制的5μg/mL 的莽吉柿提取物，培養(yǎng)24h 后加入1：5000 無血清培養(yǎng)液稀釋的DCFH-DA 450μL，置于37℃細胞培養(yǎng)箱內避光孵育20min，加入無血清培養(yǎng)液洗滌3 次，用于熒光共聚焦顯微鏡觀察拍照；收集每孔內細胞，用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞后，用流式細胞儀檢測細胞ROS 含量。

1.7 Western Blot 實驗 將Hela 細胞按2×105/孔接種于12 孔板上，對照組為Hela 細胞不加藥培養(yǎng)24h，莽吉柿提取物組為加入無血清高糖DMEM 培養(yǎng)基配制的2.5、5μg/mL 的莽吉柿提取物培養(yǎng)24h，之后用RIPA 裂解收集蛋白，并使用BCA 蛋白檢測試劑盒測定其濃度。收集的蛋白用12%的SDSPAGE 進行電泳分離，結束后將SDS-PAGE 膠300mA，70min 轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，用TBST 配置的5%的脫脂奶粉封閉2h，一抗Bcl-2、BAX、p-ERK、ERK、β-actin 蛋白（均1：1000）4℃封閉過夜，用TBST 清洗后，二抗羊抗兔-IgG（1:2000）室溫封閉1h。洗去二抗，使用ECL 工作液浸潤，經(jīng)Bio-Rad 化學發(fā)光成像系統(tǒng)顯影。用Image J 軟件檢測各組細胞Bcl-2、BAX、p-ERK、ERK 和β-actin 的灰度值，目的蛋白的相對表達用目標蛋白灰度值與βactin 蛋白灰度值的比值表示。

1.8 統(tǒng)計學方法 每項實驗均重復3 次。應用Graphpad prism 6 統(tǒng)計軟件；實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，兩兩比較采用T-檢驗分析，多組比較采用多因素方差分析；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CCK-8 檢測不同濃度的莽吉柿提取物對Hela抑制率 與對照組比較，不同濃度莽吉柿提取物處理組的抑制率隨藥物濃度升高呈上升趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P 均<0.05），見表1。另通過Graphpad prism 軟件計算莽吉柿提取物半數(shù)抑制濃度（IC50值）為1.63μg/mL。

表1 不同濃度的莽吉柿提取物對Hela 細胞增殖抑制率比較（%，）

表1 不同濃度的莽吉柿提取物對Hela 細胞增殖抑制率比較（%，）

注：與對照組比較，aP＜0.05

2.2 流式細胞術檢測Hela 細胞凋亡水平變化 Annexin V-FITC 為橫坐標，代表綠色熒光強度；PI 為縱坐標，代表紅色熒光強度。與對照組比較，不同濃度莽吉柿提取物處理物Hela 細胞凋亡率顯著提高（P<0.05）。見表2，圖1。

2.3 流式細胞術和熒光顯微鏡檢測Hela 細胞活性氧含量 流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)莽吉柿提取物處理后，Hela 細胞的活性氧（ROS）含量顯著提高為對照組的3.05 倍（見表3，圖2A）。熒光共聚焦顯微鏡拍攝結果ROS 熒光水平也顯著升高（見圖2B、C）。

表2 不同濃度莽吉柿提取物處理后Hela 細胞凋亡率比較（%，）

表2 不同濃度莽吉柿提取物處理后Hela 細胞凋亡率比較（%，）

注：與對照組比較，aP＜0.05

圖1 不同濃度莽吉柿提取物處理后Hela 細胞凋亡率

表3 莽吉柿提取物處理后Hela 細胞ROS 比較（%，）

表3 莽吉柿提取物處理后Hela 細胞ROS 比較（%，）

注：與對照組比較，aP＜0.05；Mean 比值=5μg/mL 莽吉柿提取物組Mean 值/對照組Mean 值

圖2 不同濃度莽吉柿提取物處理后Hela 細胞ROS 含量

2.4 Western blot 檢測Hela 細胞p-ERK、BAX 及Bcl-2 蛋白表達水平 不同濃度藥物處理后，莽吉柿提取物處理組（2.5μg/mL 和5μg/mL）宮頸癌Hela 細胞p-ERK1/2 蛋白顯著降低，分別為對照組的54%和25%；Bcl-2 蛋白顯著降低，分別為對照組的76%和67%；BAX 蛋白顯著提高，分別為對照組的1.11倍和1.45 倍（P 均<0.05）。（見圖3 和表4）。

圖3 不同濃度莽吉柿提取物處理后Hela 細胞p-ERK1/2、Bcl-2 和BAX 蛋白表達水平

表4 不同濃度莽吉柿提取物處理后Hela 細胞p-ERK1/2、Bcl-2 和BAX 蛋白表達水平比較（%，）

表4 不同濃度莽吉柿提取物處理后Hela 細胞p-ERK1/2、Bcl-2 和BAX 蛋白表達水平比較（%，）

注：p-ERK1/2 為磷酸化的細胞外調節(jié)蛋白激酶；Bcl-2 為B 淋巴瘤細胞-2 蛋白；BAX 為bcl-2 相關X 蛋白；與對照組比較，aP＜0.05

3 討論

莽吉柿（Garcinia mangostana L.）為藤黃科植物，中醫(yī)古籍記載藤黃具有消炎、抑菌、止血、抗病毒等作用，常被用于膿腫、跌打損傷和各種體蘚的治療[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)莽吉柿提取物具有抗腫瘤效果。王靜等[5]研究發(fā)現(xiàn)藤黃酸通過TNF-α 引起的NF-κB 激活調控抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達抑制腎癌細胞增殖，并促進癌細胞凋亡的發(fā)生。我們在前期的研究也發(fā)現(xiàn)莽吉柿提取物對胃癌細胞SGC-7901 的增殖有一定的抑制效果[6]。本研究發(fā)現(xiàn)莽吉柿提取物能顯著抑制宮頸癌Hela 細胞增殖并通過氧化損傷的形式誘導細胞凋亡的發(fā)生。

MAPK/ERK 通路是目前已經(jīng)鑒定的4 條MAPK途徑之一，是導致細胞凋亡的延遲，促進腫瘤細胞的生長的重要方式。Li 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，ROS 的大量累積能夠通過調控MAPK/ERK1/2 的失活促進Bcl-2 的泛素化導致其下調引起細胞的死亡。Xing 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，ROS 的過量產生導致線粒體膜通透性增加，導致BAX 從細胞質轉運至線粒體并釋放細胞色素c，細胞色素c 與凋亡蛋白激酶結合促進細胞凋亡的發(fā)生。因此，我們通過流式細胞術對細胞活性氧水平進行了檢測。研究發(fā)現(xiàn)，莽吉柿提取物能夠顯著誘導氧化損傷的發(fā)生，莽吉柿提取物處理組ROS 含量是對照組的3.05 倍。進一步Western blot 檢測莽吉柿提取物顯著抑制宮頸癌Hela 細胞中p-ERK1/2 蛋白和凋亡相關蛋白BCL-2 蛋白的表達，促進BAX 蛋白的表達，顯示莽吉柿提取物通過誘導細胞ROS 的大量累積調控MAPK/ERK1/2 蛋白水平的變化，促進宮頸癌細胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，莽吉柿提取物對宮頸癌細胞的影響可能是通過誘導細胞氧化損傷，調控腫瘤細胞MAPK/ERK1/2 信號通路和凋亡相關蛋白，如：BCL-2和BAX，促進細胞凋亡的發(fā)生，發(fā)揮抗腫瘤的作用。