長鏈非編碼RNA 牛磺酸上調基因1 調節(jié)膿毒癥患者炎癥反應的分子機制研究

謝月群 單國勇 許智利 錢旭如 林強康

膿毒癥是由感染導致的機體全身炎癥反應性綜合征，常伴隨多功能器官損傷和免疫功能紊亂，是導致膿毒癥危重患者死亡的主要原因[1]。巨噬細胞作為調節(jié)機體免疫功能主要效應細胞，是機體防御病原微生物入侵的第一道防線[2-3]。巨噬細胞分泌大量促炎及抗炎因子，調節(jié)膿毒癥炎癥反應，機體過度炎癥反應嚴重影響膿毒癥治療及預后。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類轉錄長度超過200nt、不編碼蛋白的RNA[4]。LncRNA 調控蛋白質表達，參與凋亡、分化及免疫等生理過程，現(xiàn)已作為多種疾病診斷及治療靶點[5]。研究報道，lncRNA TUG1 抑制核因子κB（NFκB）通路激活，減輕膿毒癥急性肺損傷。HMGB1 激活LPS 處理的巨噬細胞NF-κB 通路，誘導機體過度炎癥反應[6]。本研究通過數(shù)據(jù)庫starBase 預測發(fā)現(xiàn)HMGB1 與lncRNA TUG1 序列高度互補，進一步比較膿毒癥患者lncRNA TUG1 和HMGB1 臨床表達，發(fā)現(xiàn)兩者存在負相關性，LPS 處理的巨噬細胞轉染TUG1，HMGB1 表達減少，炎性因子IL-6 和TNF-α水平降低，現(xiàn)將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年1 月—2018 年12 月浙江省溫州市人民醫(yī)院收治的膿毒癥患者30 例作為研究對象，選擇同期健康志愿者30 名作為健康對照組，所有實驗對象均簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過。膿毒癥患者納入標準[7-8]：（1）年齡18～70 歲；（2）未接受任何免疫調節(jié)治療；（3）臨床資料完整；（4）符合《膿毒癥和膿毒性休克治療指南（2012 版）》診斷標準。排除標準：（1）自身免疫性疾病患者；（2）惡性腫瘤及慢性嚴重疾病患者。

1.2 藥品與試劑 IFN -γ（Invitrogen，批 號KHC4021）、IL-10（Invitrogen，批號BMS215-2）、TNFα（Invitrogen，批號BMS223HS）和IL-6（Invitrogen，批號BMS213HS）ELISA 試劑盒；MTT 細胞增殖檢測試劑盒（Invitrogen，批號V13154）；Lipofectamine 2000轉染試劑盒（Invitrogen，批號11668500）；佛波酯（PMA）（solarbio，批號6741）；HMGB1 抗體（Cell Signaling Technology，批號3935），GAPDH 抗體（Cell Signaling Technology，批號5174）。

1.3 方 法

1.3.1 熒光定量PCR 檢測對照組及膿毒癥組lncRNA TUG1 mRNA 水平 取膿毒癥患者及對照組靜脈血2mL，分離培養(yǎng)外周血單個核細胞（PBMC），實時定量PCR 檢測兩組lncRNA TUG1 mRNA 水平。引物序列如下：lncRNA TUG1：Forward：5′-TAGGAGTGGATGTGTTCTGTAGCA-3′，Reverse：5′-TGGTCGTGGAATATGGTCAATGAG-3′，U6：Forward：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA3′，Reverse：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA3′，HMGB1 Forward：5′-GTTCAAGGATCCCAATGCAC-3′，Reverse：5′-GATTTTTGGGCGATACTCAGA-3′；GAPDH Forward：5′-AGCCACATCGCTCAGACA-3′，Reverse：5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′。

1.3.2 ELISA 檢測血清炎癥因子水平 取膿毒癥組及對照組靜脈血4mL，ELISA 檢測炎癥因子IFN-γ、IL-10、TNF-α 和IL-6 濃度，嚴格按照試劑盒說明書步驟操作。

1.3.3 THP-1 細胞培養(yǎng)與轉染 THP-1 細胞培養(yǎng)消化，計數(shù)板計數(shù)，在6 孔板中接種THP-1 細胞，每孔加入1mL 含106個細胞的培養(yǎng)液，每孔加入16μL的20μg/mL 的PMA 刺激24h，誘導成巨噬細胞，分為三組，LPS 處理組，LPS+空載處理組和LPS+TUG1過表達慢病毒處理組；LPS+空載處理組：利用Lipo2000 轉染試劑轉染對照病毒；LPS+TUG1 過表達慢病毒處理組：利用Lipo2000 轉染試劑轉染TUG1過表達慢病毒，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h，進行相關指標的檢測。

1.3.4 MTT 檢測細胞活力 THP-1 細胞培養(yǎng)消化，計數(shù)板計數(shù)，在96 孔板中接種THP-1 細胞，每孔加入0.1mL 含104個細胞的培養(yǎng)液，孵育24h 后，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3 遍，每孔加入500μg/mL MTT 孵育3h，分光光度計檢測吸光度，計算細胞活力改變。

1.3.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，采用t 檢驗進行分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較 膿毒癥組30 例，男16 名，女14 名；年齡（54.75±3.12）歲；平均體質量（60.31±2.15）kg，體溫36.3℃～36.9℃。健康志愿者30 名，男15 名，女15 名；年齡（47.13±5.25）歲，平均體質量（58.23±3.42）kg，體溫36.4℃～37.2℃。兩組年齡、性別、體質量及體溫比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 兩組LncRNA TUG1 和HMGB1 表達水平比較與健康對照組比較，膿毒癥組lncRNA TUG1 水平顯著降低，HMGB1 水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P 均＜0.01）。見表1。

表1 健康對照組和膿毒癥組lncRNA TUG1 和HMGB1相對表達水平比較（）

表1 健康對照組和膿毒癥組lncRNA TUG1 和HMGB1相對表達水平比較（）

注：lncRNA TUG1 為長鏈非編碼RNA ?；撬嵘险{基因1；HMGB1 為高遷移率族蛋白B1

2.3 兩組炎癥因子水平比較 與健康對照組比較，膿毒癥組血漿促炎因子IL-6、IFN-γ 和TNF-α 顯著升高，抗炎因子IL-10 顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P 均＜0.05）。見表2。

表2 健康對照組和膿毒癥組炎癥因子水平比較（pg/mL，）

表2 健康對照組和膿毒癥組炎癥因子水平比較（pg/mL，）

注：IFN-γ 為干擾素γ；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-6 為白介素-6；IL-10 為白介素-10

2.4 HMGB1 與TUG1 序列互補 利用StarBase 數(shù)據(jù)庫預測HMGB1 與TUG1 結合序列，發(fā)現(xiàn)HMGB1序列與TUG1 高度互補，可能是TUG1 調控的基因。見表3。

2.5 TUG1 改變THP-1 巨噬細胞活力 LPS 處理THP-1 細胞，細胞活力顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），慢病毒TUG1 處理LPS 激活的巨噬細胞，細胞活力顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表4。

表3 LncRNA TUG1 與HMGB1 互補序列

表4 噻唑藍（MTT）比色法檢測巨噬細胞活力（%，）

表4 噻唑藍（MTT）比色法檢測巨噬細胞活力（%，）

注：TUG1 為長鏈非編碼RNA ?；撬嵘险{基因1；LPS 為抑制脂多糖；THP-1 為巨噬細胞；與THP-1 組比較，aP＜0.01；與THP-1+LPS+空載組比較，bP＜0.01

2.5 TUG1 抑制THP-1 巨噬細胞HMGB1 表達LPS 處理巨噬細胞后，TUG1 水平降低，HMB1 蛋白表達增多（P＜0.01），TUG1 過表達慢病毒感染LPS 處理的THP-1 細胞，細胞TUG1 水平顯著升高，HMGB1 蛋白表達減少（P＜0.01）。見表5、圖1。

表5 各組TUG1 相對表達水平

圖1 長鏈非編碼RNA 牛磺酸上調基因1（TUG1）抑制高遷移率族蛋白B1（HMGB1）表達

2.6 TUG1 抑制THP-1 巨噬細胞炎癥因子水平LPS 處理巨噬細胞后，與THP-1 組比較，IL-6 和TNF-α 濃度顯著升高（P 均＜0.01），TUG1 過表達慢病毒感染LPS 處理的THP-1 細胞，IL-6 和TNF-α濃度顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P 均＜0.01）。見表6。

3 討論

膿毒癥炎癥調控機制尚未明確。LncRNA 微陣列檢測膿毒癥組和對照組血清樣品發(fā)現(xiàn)，5361 個LncRNA 表達上調，5928 個LncRNA 表達下調，因此LncRNA 在膿毒癥發(fā)展中發(fā)揮重要作用[9]。LPS 誘導的膿毒癥小鼠模型中，lncRNA H19 異常升高，促進炎癥反應，加重心肌衰老[10-12]。NAD-依賴性去乙?；?（SIRT1）通過抑制lncRNA CCL2 表達，下調巨噬細胞炎癥因子濃度[13-14]。本研究結果顯示，在膿毒癥患者TUG1 低表達。TUG1 過表達升高巨噬細胞活力，抑制促炎因子IL-6、IFN-γ 和TNF-α 分泌。

表6 ELISA 檢測巨噬細胞炎癥因子分泌

HMGB1 作為膿毒癥的晚期介質，介導炎癥反應，控制細胞凋亡和自噬，是造成膿毒癥器官損傷的主要原因。HMGB1 在慢性腎臟疾病中的表達增加，引起脾臟細胞凋亡[15]。HMGB1 通過激活NF-κB 通路促進炎癥因子釋放，介導巨噬細胞極化[16-17]。本研究顯示，LPS 處理巨噬細胞，HMGB1 蛋白表達增多，但調控HMGB1 的上游分子尚不明確?；赟tarBase 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)HMGB1 和TUG1 存在堿基互補序列，我們推測TUG1 可能是HMGB1 的上游調控因子。結果顯示，TUG1 在LPS 處理的巨噬細胞中下調。此外，TUG1 過表達調控HMGB1，抑制細胞凋亡，抑制IL-6 和TNF-α 分泌。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者TUG1 低表達，HMGB1 高表達，可能作為膿毒癥診斷指標之一。TUG1 下調巨噬細胞HMGB1 表達，抑制促炎因子分泌。表明TUG1 可能通過調控HMGB1 參與巨噬細胞炎癥因子分泌，發(fā)揮抗炎作用，為膿毒癥治療新靶點提供依據(jù)。但TUG1 調控HMGB1 介導炎癥反應的具體機制尚未闡明，還需進一步研究。