脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響

梁政 鐘劍鋒 吳源聰 溫文 陳燦 李波

[摘要] 目的 研究小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（mASCs）來源外泌體（Exo）對(duì)新生小鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（H/R）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響。 方法 采用超高速離心法分離提取mASCs來源Exo（mASCs-Exo），透射電子顯微鏡（TEM）、納米顆粒示蹤分析技術(shù)（NTA）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（WB）觀察并鑒定Exo;差速貼壁法提取C57BL/6乳鼠心肌細(xì)胞，免疫熒光檢測(cè)心肌標(biāo)志蛋白CTnI和conexin43表達(dá);PKH-26標(biāo)記Exo示心肌細(xì)胞攝取能力;實(shí)驗(yàn)分為3組：正常對(duì)照組（control組）、缺氧/復(fù)氧組（H/R組）和缺氧/復(fù)氧+mASCs-Exo組（H/R+mASCs-Exo組）;TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡;WB檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果 與control組比較，H/R組心肌細(xì)胞凋亡率升高（P < 0.01），與H/R組比較，H/R+mASCs-Exo組心肌細(xì)胞凋亡率降低（P < 0.05）;與control組比較，H/R組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Bcl-2/Bax比值降低（P < 0.01），而cleaved caspase-9/caspase-9比值升高（P < 0.001）;與H/R組比較，H/R+mASCs-Exo組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Bcl-2/Bax比值升高（P < 0.05或P < 0.01），cleaved caspase-9/caspase-9的比值降低（P < 0.01）。 結(jié)論 mASCs-Exo可抑制H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，這可能通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路介導(dǎo)的。

[關(guān)鍵詞] 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞;外泌體;C57BL/6乳鼠心肌細(xì)胞;缺氧/復(fù)氧;PI3K/Akt信號(hào)通路

[中圖分類號(hào)] R541.4? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）02（b）-0004-05

Effect of the exosomes extracted from adipose-derived mesenchymal stem cells on hypoxia/reoxygenation-induced cardiomyocyte apoptosis

LIANG Zheng? ?ZHONG Jianfeng? ?WU Yancong? ?WEN Wen? ?CHEN Can? ?LI Bo

Department of Cardiology， Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Guangdong Province， Zhanjiang? 524000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of mouse adipose-derived mesenchymal stem cells （mASCs） derived exosomes （Exo） on hypoxia/reoxygenation （H/R） induced apopotosis of cardiomyocytes neonatal mouse cardiomyocytes. Methods The mascs-derived Exo （mascs-exo） was isolated and extracted by ultra-high speed centrifugation. The Exo was observed and identified by transmission electron microscopy （TEM）， nanoparticle tracer analysis （NTA） and Western blot （WB）. C57BL/6 suckled rat cardiomyocytes were extracted by differential adherent method. Expression of CTnI and conexin43 was detected by immunofluorescence. Pkh-26 was labeled Exo to indicate the uptake capacity of cardiomyocytes. The experiment was divided into three groups： normal control group （control group）， hypoxia/reoxygenation group （H/R group） and hypoxia/reoxygenation + mascs-exo group （H/R+ mascs-exo group）. Apoptosis of was detected by TUNEL staining. The expression level of apoptosis-related protein was detected by WB. Results compared with the control group， the apoptosis rate of cardiomyocytes in the H/R group was increased （P < 0.01）， and the apoptosis rate of cardiomyocytes in the H/R+ mascs-exo group was decreased （P < 0.05）. Compared with the control group， p-PI3K /PI3K， p-Akt /Akt， and Bcl-2 /Bax were decreased in the H/R group （P < 0.01）， while the cleaved caspase-9/caspase-9 ratio was increased （P < 0.01）. Compared with H/R group， the ratio of p-PI3K/PI3K， p-Akt /Akt and Bcl-2 /Bax in H/R+ mascs-exo group was increased （P < 0.05 or P < 0.01）， and the ratio of cleaved caspase-9/caspase-9 was decreased （P < 0.01）. Conclusion mASCs-Exo can inhibit H/R induction of cardiomyocytes apoptosis， which may be mediated by activation of the PI3K/Akt signaling pathway.

[Key words] Adipose-derived mesenchymal stem cells; Exosomes; Primary cardiomyocytes; Hypoxia/reoxygenation; PI3K/Akt signaling pathway

心肌梗死在全世界發(fā)病率和死亡率仍居高不下，對(duì)個(gè)人和社會(huì)造成巨大負(fù)擔(dān)[1]。針對(duì)心肌梗死目前公認(rèn)最有效的治療方法是快速恢復(fù)血液灌注降低心肌損傷[2]。雖然及時(shí)恢復(fù)血液灌注能夠挽救瀕死心肌，但可引起心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）[3]。盡管已經(jīng)報(bào)道許多干預(yù)措施可減輕動(dòng)物模型MIRI，但臨床上尚無有效治療方法[4]。

近年來再生醫(yī)學(xué)在心肌梗死治療中表現(xiàn)出巨大的潛力，Wernly等[5]研究顯示動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中移植干細(xì)胞可降低心肌梗死面積，改善心臟功能。研究顯示，干細(xì)胞主要通過旁分泌起治療作用。來源外泌體（exosomes，Exo）是細(xì)胞旁分泌的一種物質(zhì)，直徑為30～150 nm，內(nèi)含豐富的蛋白質(zhì)、脂類、核酸等。大量研究顯示[6-8]其在細(xì)胞通訊中充當(dāng)重要的作用，并且可以充當(dāng)疾病的標(biāo)志物及治療劑。已有研究[9]顯示間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchyma stem cell，MSC）來源的Exo對(duì)MIRI具有治療作用，但其作用機(jī)制如何仍需進(jìn)一步研究探索。本研究利用原代心肌細(xì)胞在體外模擬MIRI，研究mASCs-Exo對(duì)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響，并進(jìn)一步探究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞株? SPF級(jí)C57BL/6小鼠，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖有限公司，許可證號(hào)：SCXK（魯）20190003。動(dòng)物飼養(yǎng)于廣東醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2018-0008。本研究方案在廣東醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批后實(shí)施。小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞株（mASCs）購(gòu)自廣州賽業(yè)生物科技有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑? TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（綠色熒光）購(gòu)自Roche Life Science公司（批號(hào)：3900 6700）;抗熒光淬滅封片液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司（批號(hào)：032819190412）;小鼠脂肪干細(xì)胞完全培養(yǎng)基購(gòu)自蘇州賽業(yè)生物科技有限公司（批號(hào)：RASMD-90011）;4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（批號(hào)：D9542-1MG）;Akt rAbbit mAb、Phospho-Akt Rabbit mAb、Bcl-2 Mouse mAb、Bax Rabbit mAb、Anti-mouse IgG，HRP-linked antibody、Anti-rabbit IgG，HRP-linked antibody均購(gòu)自美國(guó) Cell Signaling Technology公司;Anti-CD9 antibody（批號(hào)：ab92726）、Recombinant Anti-CD63 antibody（批號(hào)：ab217345）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 mASCs細(xì)胞培養(yǎng)及外泌體提取? 復(fù)蘇mASCs細(xì)胞，細(xì)胞融合至80%～90%用無血清培養(yǎng)基處理48 h，收集上清，4℃、300 g/min離心10 min，2000 g/min離心10 min和10 000 g/min離心30 min。吸取上清120 000 g/min離心90 min得沉淀，PBS洗滌，100 μL PBS重懸，-80℃保存。

1.2.2 C57BL/6原代心肌細(xì)胞提取及鑒定? 健康3 d內(nèi)出生C57BL/6乳鼠6只，無菌操作剪取乳鼠心臟置于冰浴PBS溶液中并剪碎。1∶5比例0.25%胰酶吹打混勻，加入混合酶（0.125%胰酶+2%膠原酶Ⅱ）充分吹打，37℃孵育5 min，重復(fù)加入混合酶至心肌細(xì)胞全部消化，收集上清加入終止液。1000 r/min離心5 min，取沉淀重懸后100目篩網(wǎng)過濾，T75超貼壁培養(yǎng)瓶37℃培養(yǎng)90 min，吸取上清至新的超貼壁培養(yǎng)瓶。第3天觀察細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)搏動(dòng)情況，并檢測(cè)conexin43/cTnⅠ心肌標(biāo)志蛋白表達(dá)。

1.2.3蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blot，WB）? 實(shí)驗(yàn)分為3組：正常對(duì)照組（control組）、缺氧/復(fù)氧（H/R）組和缺氧/復(fù)氧+mASCs-Exo組（H/R+mASCs-Exo組）收集蛋白樣品100℃加熱10 min變性，凝膠電泳（SDS-PAGE）使蛋白分離。90 V 120 min恒壓轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h;根據(jù)分子量大小剪切目的條帶;4℃一抗孵育過夜;第2天室溫復(fù)溫1 h，TBST緩沖液洗膜，加入抗兔或小鼠的IgG，室溫孵育1 h;洗膜后加入發(fā)光液曝光拍片。

1.2.4 TUNEL染色? 共聚焦皿接種細(xì)胞，生長(zhǎng)融合至70%～80%處理細(xì)胞，免疫染色固定液固定30 min，0.2% Triton-X100通透液孵育30 min;TdT與dUTP按1∶9比例避光配置，100 μL/孔，暗濕盒孵育1 h;DAPI（1∶2000）孵育40 min;抗熒光猝滅封片液封片避光保存，熒光拍攝。

1.2.5 PKH-26標(biāo)記Exo? PKH-26紅色熒光標(biāo)記試劑盒（Sigma-Aldrich）標(biāo)記mASCs-Exo，與心肌細(xì)胞共孵育。4%多聚甲醛固定15 min，DAPI染核，抗熒光猝滅封片液封閉保存，熒光拍攝。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，3次重復(fù)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mASCs-Exo分離和鑒定

透射電子顯微鏡（TEM）下觀察mASCs-Exo呈圓形囊泡狀，質(zhì)膜邊緣清晰，中間顏色較邊緣深（圖1A）。納米顆粒示蹤分析技術(shù)（NTA）結(jié)果顯示粒子大小在30～120 nm范圍，平均（47.5±0.5）nm，與Exo特征一致（圖1B）。WB顯示Exo特異性標(biāo)志蛋白CD9/CD63陽性表達(dá)（圖1C）。分離獲得的囊泡即為Exo。

2.2 小鼠原代心肌細(xì)胞提取和鑒定

2.2.1 小鼠原代心肌細(xì)胞形態(tài)觀察與鑒定? 光鏡下觀察心肌細(xì)見剛分離單個(gè)未貼壁心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，呈圓形，恒溫培養(yǎng)2 d后大部分心肌細(xì)胞貼壁，細(xì)胞分散，呈橢圓形或菱形，中央高亮，出現(xiàn)自主搏動(dòng)，頻率緩慢（4～15次/min）。4 d后細(xì)胞融成集落，搏動(dòng)頻率一致且呈放射狀（30～50次/min）。7 d后觀察細(xì)胞搏動(dòng)頻率減弱，體積縮小并逐漸脫落（圖2A，封三）。三色免疫熒光鑒定心肌細(xì)胞純度。紅色熒光標(biāo)記conexin43，綠色熒光標(biāo)記CTnI，藍(lán)色熒光為DAPI染細(xì)胞核。心肌細(xì)胞陽性率為（94.3±4.2）%（n = 5）（圖2B，封三）。

2.3 mASCs-Exo對(duì)H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響

2.3.1 Exo標(biāo)記和心肌細(xì)胞攝取? PKH-26標(biāo)記mASCs-Exo，與心肌細(xì)胞共孵育0、12、24 h，DAPI復(fù)染細(xì)胞核。在12 h出現(xiàn)心肌細(xì)胞攝取PKH-26標(biāo)記mASCs-Exo，且紅色熒光信號(hào)隨著時(shí)間增強(qiáng)，24 h時(shí)絕大部分心肌細(xì)胞顯示紅色熒光（圖3，封三）。

2.3.2 TUNEL法檢測(cè)mASCs-Exo對(duì)H/R誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡影響? 與control組比較，H/R組和H/R+mASCs-Exo組凋亡率明顯升高（P < 0.01）;與H/R組比較，H/R+mASCs-Exo組細(xì)胞凋亡率降低（P < 0.05）（圖4，封三）。

2.3.3 mASCs-Exo對(duì)心肌細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Bcl-2/Bax、cleaved caspase-9/caspase-9蛋白表達(dá)的影響? 與control組比較，H/R組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Bcl-2/Bax比值顯著下降（P < 0.01），而cleaved caspase-9/caspase-9比值增加（P < 0.01）;H/R+mASCs-Exo組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Bcl-2/Bax比值下降（P < 0.01或P < 0.05），cleaved caspase-9/caspase-9比值增加（P < 0.01）;與H/R組比較，H/R+mASCs-Exo組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Bcl-2/Bax比值升高（P < 0.01或P < 0.05），cleaved caspase-9/caspase-9的比值降低（P < 0.01）。見圖5。

3 討論

MIRI損傷過程復(fù)雜，涉及線粒體功能障礙，氧化應(yīng)激和炎癥等分子機(jī)制，這些機(jī)制導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)和功能損傷[10]。但針對(duì)這些機(jī)制進(jìn)行干預(yù)尚未證明可有效預(yù)防 MIRI[11]。近年來，基于干細(xì)胞療法在心血管疾病中受到了極大的關(guān)注，并且已應(yīng)用到臨床試驗(yàn)中[12]。MSCs因其具有多向分化潛能、免疫調(diào)節(jié)特性及容易在體外分離和擴(kuò)增的特性，可能成為最具臨床前景的干細(xì)胞[13]。多項(xiàng)研究顯示，應(yīng)用MSC植入能減輕MIRI[14-15]。然而，研究提示MSC治療MIRI僅1%干細(xì)胞有效發(fā)揮作用[16]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞降低MIRI損傷是通過旁分泌介導(dǎo)的[17]。使用干細(xì)胞來源的Exo可能比單純使用活細(xì)胞具有更加可觀的優(yōu)勢(shì)[18]。本研究采用mASCs-Exo預(yù)處理對(duì)H/R誘導(dǎo)損傷的心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)H/R處理心肌細(xì)胞凋亡顯著增加，而mASCs-Exo后心肌細(xì)胞的凋亡明顯減少，提示mASCs-Exo可以通過抑制心肌細(xì)胞凋亡從而減輕MIRI損傷。

MIRI過程中，不同時(shí)期可能激活了不同的病理信號(hào)，從而通過多種機(jī)制導(dǎo)致心臟損傷[19]。PI3K/Akt途徑是體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在細(xì)胞存活、增殖和凋亡中起著重要作用。PI3K激活催化了磷脂酰肌醇（3，4，5）-三磷酸的產(chǎn)生，其在膜上積累并激活磷酸化Akt。磷酸化Akt則增加了抗凋亡蛋白表達(dá)，抑制促凋亡蛋白表達(dá)[20]。mASCs-Exo預(yù)處理H/R損傷心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt激活，抗凋亡蛋白Bcl-2水平顯著增加，而促凋亡蛋白Bax及caspase-9（cleaved caspase-9是其激活形式）表達(dá)減少。因此，結(jié)果提示mASCs-Exo抑制H/R后心肌細(xì)胞的凋亡可能是通過激活PI3K/Akt途徑介導(dǎo)的。

本研究仍然存在一些局限性，雖然研究采用乳鼠原代心肌細(xì)胞作為體外實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，對(duì)比使用穩(wěn)定細(xì)胞系H9C2實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加可靠。但是H/R損傷模型只是在體外模擬MIRI損傷，與實(shí)際體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境仍然存在差異，需要進(jìn)一步補(bǔ)充體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。在機(jī)制研究上，通過WB驗(yàn)證了PI3K/Akt及凋亡相關(guān)蛋白水平的表達(dá)情況，如果再使用PI3K/Akt抑制劑進(jìn)行反向驗(yàn)證，會(huì)使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加可靠。

總之，本研究提示，使用mASCs-Exo處理H/R損傷的心肌細(xì)胞可以激活PI3K/Akt信號(hào)，上調(diào)Bcl-2蛋白，下調(diào)caspase-9和Bax蛋白的表達(dá)，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡達(dá)到保護(hù)心臟作用。本研究將為臨床治療MI/R損傷提供新方法和理論基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2019-09-26? 本文編輯：劉永巧）