利用SSR熒光標(biāo)記構(gòu)建41份山東省蘋果資源分子身份證

李慧峰，王 濤，冉 昆（山東省果樹研究所，山東 泰安 271000）

山東是我國主要的小蘋果資源中心，種質(zhì)資源極為豐富，其中不乏具有特異性狀的優(yōu)良種質(zhì)。全世界的蘋果屬（Malus Mill）植物約有38種，我國約有30種[1-2]，山東省約有6～8種。由于山東省人工栽培小蘋果歷史久遠(yuǎn)，蘋果屬植物種間基因交流頻繁，種間雜交現(xiàn)象突出，因此，該地區(qū)蘋果種質(zhì)資源的鑒定工作十分困難。探索科學(xué)的鑒定方法，對山東蘋果屬植物資源保護(hù)利用具有重要意義。

目前，SSR（simple sequence repeats）標(biāo)記在蘋果、梨、桃、杏、棗、甜櫻桃、無花果、葡萄和柑橘等果樹的種質(zhì)資源遺傳多樣性、品種鑒定和分子身份證構(gòu)建中得到應(yīng)用[3-4]，其優(yōu)點(diǎn)被廣泛認(rèn)可。GUILFORD等[5]基于蘋果基因組文庫設(shè)計(jì)得到14對SSR引物，其中3對引物能夠鑒定出21個(gè)蘋果品種；MORIYA等[6]利用15對引物構(gòu)建了95份蘋果種質(zhì)的指紋圖譜；王立新等[7]構(gòu)建了40個(gè)蘋果主要栽培品種的指紋圖譜。LARSEN等[8]用15對SSR標(biāo)記對448個(gè)栽培品種進(jìn)行基因分型，共擴(kuò)增出284個(gè)等位基因，可以有效區(qū)分其中的42個(gè)品種；高源等基于熒光SSR分子標(biāo)記，對155份蘋果屬楸子[M．×prunifolia(Willd．)Borkh．]種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析，研究結(jié)果表明，楸子種質(zhì)的遺傳多樣性處于較高的水平，可能在人為擴(kuò)散過程中發(fā)生了種間自然雜交[9]。目前關(guān)于構(gòu)建山東地方蘋果屬植物的種質(zhì)資源分子身份證的工作，尚未見報(bào)道。

本研究利用篩選的10對SSR引物，利用SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳技術(shù)構(gòu)建41份山東蘋果種質(zhì)資源的分子身份證，旨在為地方蘋果種質(zhì)資源的鑒定和評價(jià)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2017年6月至2018年10月在國家蘋果工程技術(shù)中心進(jìn)行。供試的41份蘋果屬資源取自于山東省果樹研究所蘋果資源圃（表1）。每份資源隨機(jī)選取3株，取幼嫩葉3～4片，混合后用錫箔紙包好，置于冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，液氮冷凍后于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 41份供試蘋果資源Table 1 41 Malus germplasm for SSR analysis

1.2 方法

1.2.1 SSR引物合成與篩選 采用Magne Sphere Magnetic Separation Products（Promega）試劑盒磁分離技術(shù)富集短基因組DNA，產(chǎn)物純化后進(jìn)行克隆并篩選，建立SSR富集文庫，從中開發(fā)并設(shè)計(jì)分布于蘋果屬植物16個(gè)連鎖群的59對引物，引物由上海生工生物工程公司合成。隨機(jī)選擇4份樣品（2，3，15和41）的總DNA進(jìn)行初篩，對初篩合格的引物進(jìn)行復(fù)篩，從中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性高的10對引物用于樣品擴(kuò)增。正向引物的5'端加1個(gè)FAM熒光標(biāo)記，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成（表2）。

表2 10對SSR引物及優(yōu)化條件Table 2 Ten pairs of SSR primers and optimization conditions

1.2.2 DNA的提取與濃度測定 采用CTAB法提取葉片的總DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳和ND-1000微量紫外分光光度計(jì)檢測DNA質(zhì)量和濃度，并稀釋至200 ng·μL-1，保存于-20℃。SSR-PCR反應(yīng)在Biometra梯度PCR 儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系（共 20 μL）：ddH2O 14．8 μL，dNTP 0．4 μL，Buffer 2 μL，正向引物 0．3 μL（20μmol·L-1），反向引物 0．3 μL（20 μmol·L-1），DNA 模板 2 μL，Taq 酶 0．2 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s，適宜退火溫度復(fù)性35 s，72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。

1.2.3 SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化后，將甲酰胺與分子質(zhì)量內(nèi)標(biāo)按100∶1的體積比混勻后，取15μL加入上樣板中，再加入1μL稀釋10倍的PCR產(chǎn)物，然后使用美國ABI3730XL測序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳。利用Genemarker中的Fragment（Plant）片段分析軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，將各泳道內(nèi)分子質(zhì)量內(nèi)標(biāo)的位置與各樣品峰值的位置進(jìn)行比較，確定片段大小。利用POPGENE和NTSYS軟件進(jìn)行遺傳多樣性分析。采用NTSYSpc 2．11軟件包進(jìn)行群體相似系數(shù)計(jì)算并采用UPGMA法進(jìn)行聚類，利用POPGENE 32計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)百分率 PPL （Percentage of Polymorphic Loci）；Nei's基因多樣性指數(shù) H （Nei's Gene Diversity）；Shannon's多態(tài)性信息指數(shù) I（Shannon's information index）。

1.2.4 編碼分子身份證 按照冉昆等[4]的方法，將擴(kuò)增獲得的指紋數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為數(shù)字編碼的分子身份證。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性檢測

篩選出的10對引物在41份樣品中均獲得良好效果。經(jīng)熒光毛細(xì)管電泳后，每對引物在每份樣品中均可獲得精確的DNA片段，由圖1可知，引物P3分別對35號難咽和40號過冬鮮2份樣品擴(kuò)增獲得的DNA片段清晰可見。10對引物在41份樣品中共擴(kuò)增出139個(gè)等位基因，平均每對引物擴(kuò)增出13．9個(gè)。其中，引物P24擴(kuò)增出的等位基因數(shù)目最多（21．0個(gè)）；引物P52擴(kuò)增出的等位基因數(shù)目最少（10．0個(gè)）?；蚨鄻有灾笖?shù)（Nei）變化范圍為 0．75（P3）～0．94（P44），平均值為 0．86。 觀察雜合度（Obs_Het）變化范圍為 0．55～0．83，期望雜合度（Het）變化范圍為 0．76～0．95。 香農(nóng)多樣性指數(shù)（I）變化范圍為 1．77～2．86，平均值為 2．25。 而多態(tài)性信息含量 PIC 值的變化范圍為0．73～0．93，平均值為0．85，均為高多態(tài)性位點(diǎn)。各引物擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性信息如表3。

根據(jù)各個(gè)材料間的Nei’s遺傳距離，利用非加權(quán)算術(shù)平均聚類法（UPGMA）對41份試材進(jìn)行聚類分析（圖2），從樹狀圖可以看出，41份材料可以分為兩大分支，第一分支包括“1”，“24”，“40”等24份材料，第二分支包括“4”，“19”，“25”等 17 份材料；而第一分支又可以分為兩類，第一類包括以“1”，“35”，“24”等 13 份材料，第二類包括以“31”，“37”，“39”等11份材料；通過遺傳距離進(jìn)行聚類可以將41份材料全部區(qū)分開來。

圖1 引物P3對35號（難咽）與40號（過冬鮮）樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的帶型Figure 1 The bands of primers P3 for the amplification products of samples 35(Nanyan)and 40(Guodongxian)

表3 10對SSR引物在41份蘋果資源中檢測到的遺傳多樣性信息Table 3 Genetic diversity information of 41 Malus germplasms using 10 SSR primers

2.2 指紋圖譜分析

10對SSR引物在41份樣品中獲得指紋圖譜（表4），10對引物所在位點(diǎn)在41份材料中共獲得244種基因型，每對引物擴(kuò)增出的基因型數(shù)為19～31種，平均24．4種。引物P3、P13、P44、P50、P53和P56在蘋果屬植物5,12，13，14，15，17，20，21，25，27，29，30，32，33，34，36，39 和 41 等 18 份材料中共獲得 21 個(gè)特異性位點(diǎn) （片段大小為 107，177，118，120，134，136，153，173，184，212，225，226，228，230，232，236，237，247，260，262，267），即21個(gè)特異的基因型。如表4所示，每對引物均可將41份樣品分為多個(gè)類型，其中引物P34和P44分辨率最高，且穩(wěn)定性好。單一的引物無法將41份樣品完全區(qū)分，以P34、P44和P52三對引物為核心的引物組合可將41份樣品完全區(qū)分。

2.3 分子身份證編碼

圖2 41份材料基于Nei's遺傳距離的聚類圖Figure 2 Clustering diagram of 41 accession of Malus germplasms based on Nei's genetic distance

各位點(diǎn)在41份材料之間的差異統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表5。在所有樣品中，差異位點(diǎn)數(shù)的變化范圍為2～12。其中，2與12號材料和18與28號材料的差異位點(diǎn)數(shù)最小(2個(gè))；7與23號材料、9與20號材料、3與9號材料和3與10號材料的差異位點(diǎn)數(shù)次之(3～6個(gè))。而其他材料之間的10對引物所在位點(diǎn)各不相同，差異位點(diǎn)數(shù)最大值達(dá)10。通過各材料差異位點(diǎn)數(shù)的比較，可以清晰地看出，根據(jù)這10對引物所對應(yīng)的位點(diǎn)可以將這41份材料鑒定區(qū)分開。

由表6可知，基于10對引物擴(kuò)增出的基因型所獲得的分子身份證編碼，可將41份材料有效的區(qū)分。在對應(yīng)的位置上，代碼相同表示該引物在樣品上擴(kuò)增的等位基因相同。

3 討論

SSR標(biāo)記是進(jìn)行物種種質(zhì)鑒定的常用分子標(biāo)記技術(shù)，已經(jīng)越來越廣泛地應(yīng)用于蘋果[5,11-12]、楊梅[13]、桃[14-15]、山楂[10]、葡萄[16-17]和梨[18]等果樹的遺傳分析領(lǐng)域。與傳統(tǒng)的PAGE檢測技術(shù)相比，熒光標(biāo)記分析技術(shù)具有較高的準(zhǔn)確性、高效性、重復(fù)性，無害且適用于大批量樣品的檢測分析等優(yōu)點(diǎn)，已成功應(yīng)用于大量果樹資源的檢測分析[7,19]。

前人根據(jù)蘋果基因組序列、EST和NGS等數(shù)據(jù)庫開發(fā)了大量的SSR引物，獲得了高質(zhì)量的遺傳連鎖圖譜，為親緣關(guān)系演化、遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源鑒定、目的基因定位等研究奠定了基礎(chǔ)[20-23]。分子身份證是在DNA指紋圖譜的基礎(chǔ)上，將指紋圖譜進(jìn)行數(shù)字化處理，進(jìn)而得到的字符串，不同的字符串代表不同的資源。高源等[24]利用12個(gè)SSR位點(diǎn)的指紋圖譜和條碼技術(shù)生成的分子身份證鑒定了27份中國原產(chǎn)蘋果屬植物；馬衣努爾姑·吐地等[25]利用4對引物構(gòu)建了62份新疆蘋果種質(zhì)資源的指紋圖譜，實(shí)現(xiàn)了62份供試材料的有效區(qū)分；榮浩等[26]利用2對SSR引物成功構(gòu)建了61個(gè)觀賞海棠品種的指紋圖譜，可將61個(gè)觀賞海棠品種完全區(qū)分開，判別率達(dá)100%。本研究采用來自蘋果基因組的10對SSR標(biāo)記，構(gòu)建了41份山東省蘋果種質(zhì)資源的分子身份證。結(jié)果表明，10對SSR引物在41份蘋果資源中均表現(xiàn)出較高的多態(tài)性，共檢測到139個(gè)SSR等位位點(diǎn)，平均每對引物對品種擴(kuò)增的等位位點(diǎn) 13．9 個(gè)，PIC 值為 0．80～0．93，平均 0．85。 10 個(gè) SSR 位點(diǎn)期望雜合度為 0．76～0．95，平均雜合度為 0．87，與前人在蘋果上的研究結(jié)果基本一致[6-8]，高于山楂[10]和桃[15]等植物。

分子身份證構(gòu)建的基礎(chǔ)是DNA指紋圖譜，相對于指紋圖譜，分子身份證作為識別種質(zhì)資源的一個(gè)標(biāo)志，可以更加簡單明了的識別和檢索種質(zhì)資源。在構(gòu)建分子身份證時(shí)，常采用的編碼方法有3種[27]，本研究采用將每對引物擴(kuò)增的等位基因按從小到大排列、依次編碼的方法，將獲得的SSR數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為數(shù)字與字母結(jié)合的分子身份證，較好的區(qū)分了41份山東省蘋果種質(zhì)資源。

近年來，由于生態(tài)破壞和過度開發(fā)已導(dǎo)致山東地方蘋果種質(zhì)資源損失嚴(yán)重，急需采取有效手段進(jìn)行收集保護(hù)。蘋果屬植物遺傳背景復(fù)雜，基因互滲、種間雜交現(xiàn)象突出，因此在資源收集過程中，資源“身份”的精準(zhǔn)鑒定十分必要[28]。今后，本研究將在現(xiàn)有工作的基礎(chǔ)上，利用SSR熒光標(biāo)記等技術(shù)對更多的資源進(jìn)行鑒定，以期為山東蘋果資源的收集、評價(jià)和利用提供更加有力的支撐。

表4 41份蘋果資源在10對SSR引物上的等位基因片段大小Table 4 Allelic fragment size of 10 pairs of SSR primers from 41 accession of Malus germplasms

表5 10對SSR引物在41份材料之間的差異位點(diǎn)數(shù)Table 5 Numbers of discrepant loci of 10 SSR primers among 41 materials

表6 41份山東地方蘋果種質(zhì)資源分子身份證代碼表Table 6 Molecular ID of 41 local Malus domestica germplasm resources in Shandong Province